CC BY
130
УДК 615.466
ОЦЕНКА БИОАКТИВНОСТИ И БИОСОВМЕСТИМОСТИ ОСТЕОПЛАСТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА В ОПЫТАХ IN VITRO И IN VIVO
В настоящее время наиболее перспективную и стремительно развивающуюся группу материалов, используемых в современной хирургической стоматологии, челю-стно-лицевой хирургии и травматологии, представляют материалы на основе металла, керамики, полимеров и композитов [3, 5, 6]. Любой материал, применяемый для профилактики или устранения дефектов соединительных тканей, следует оценивать с учетом основных характеристик, к которым относятся биоактивность, биосовместимость, биорезистентность. Степень выраженности биоактивности имплантированного образ-ца, в зависимости от его физико-химических характеристик, лежит в диапазоне от биорезистентности до цитотоксичности. При этом биоактивность и биосовместимость находятся в прямой зависимости от биорезистентности материала, что оказывает существенное влияние на сроки применения лечебных препаратов и остеопластических материалов. На сегодняшний день для оценки биоактивности создаваемых прототипов остеопластических стоматологических материалов широко используют различные клеточные культуры и нативные клетки красного костного мозга [4]. Биосовмести-мость медицинских изделий принято оценивать методом прямой имплантации мате-риала под кожу, в мышечную ткань или непосредственно в кость [2]. Целью исследования явилась оценка цитотоксичности и способности поддер-живать гистотипическую дифференцировку клеток при имплантации нового остеопла-стического материала для восстановления дефектов костных тканей. Материалы и методы. В качестве материала исследования использовалась резорбируемая биомембра-на на основе ксеноколлагена, изготовленная на предприятии ЗАО «ОЭЗ «ВладМиВа», г. Белгород. Натуральная белковая структура мембраны имеет морфологию плотно ориентированных волокон, легко моделируется, обладает оптимальной жесткостью и пластичностью. Плотный внешний слой мембраны, обращенный к мягким тканям, предотвращает пролиферацию эпителиоцитов и инокуляцию рыхлой и плотной соединительной ткани. Пористый внутренний слой, обращенный к кости, способствует созданию оптимальных условий для связывания факторов роста и дифференциации
Проведена оценка цитотоксичности и способности под-держивать гистотипическую дифференцировку клеток при им-плантации нового остеопластического материала для восста-новления дефектов костных тканей. Работа выполнена в двух сериях с использованием лабораторных белых крыс линии Вис-тар. В качестве материала исследования использовалась резор-бируемая биомембрана на основе ксеноколлагена, изготовлен-ная на предприятии ЗАО «ОЭЗ «ВладМиВа», г. Белгород. Ис-следование образцов проводилось при помощи микроскопии проходящего света, конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и растровой электронной микроскопии. В ходе исследования было установлено, что материал в виде резорби-руемой мембраны на основе коллагена не является цитоток-сичным, инкубированные на нем клетки сохраняют жизнеспо-собность и свои морфологические особенности. Инокулирован-ный под кожу остеопластический материал является биоактив-ным и биосовместимым, в зоне дефекта отмечается его резорб-ция и активное протекание регенераторного процесса соединительных тканей Ключевые слова: остеопластический материал, резорби-руемая биомембрана, биоактивность, биосовместимость, биоре-зистентность.
остеоцитов из предшественников (рис. 1). Благодаря пористой структуре, непосредст-венно перед применением, в материал можно дополнительно вводить лекарственные средства (антисептики, антибиотики, гемостатики) и факторы роста, что позволяет предотвратить воспалительные процессы и ускорить процесс регенерации костной ткани.
Рис. 1. Резорбируемая мембрана с различной топографией поверхности сторон (А - внутренняя
сторона, Б - внешняя сторона)
Работа выполнена в двух сериях с использованием лабораторных белых крыс самцов линии Вистар (Питомник лабораторных животных «Столбовая» РАМН). В первой серии - опыты in vitro для оценки биоактивности образцов - исполь-зовали клетки красного костного мозга, которые выделяли непосредственно перед проведением теста на цитотоксичность. На данном этапе работы исследования прово-дили согласно ГОСТ Р ИСО 10993-6-2009 Изделия медицинские. Оценка биологиче-ского действия медицинских изделий. Часть 2. Требования к обращению с животными. Часть 5. Исследования на цитотоксичность: методы in vitro, методом прямого контакта. Использовали флуоресцентный метод анализа жизнеспособности клеток с двойным окрашиванием - этидиум бромидом (Helicon) и ацетооксиметиловым эфиром каль-цеина (Fluka) [10]. В этой серии использовано три крысы, которых умерщвляли передозировкой парами эфира с последующим удалением большеберцовых костей. Выделенные кости очищали от мягких тканей, отсекали эпифизы и вымывали красный костный мозг физиологическим раствором с помощью шприца в чашку Петри с питательной средой 199 [7, 8]. Полученную суспензию клеток делили на две части: первая использовалась для контроля - инкубации клеток в чашке Петри на стекле (три повтора), вторая - опытная для инкубации клеток на поверхности мембраны (три повтора). Образцы мембраны в виде тонкого лоскута помещали в стерильные чашки Петри и наносили на их поверхность 30 мкл суспензии клеток красного костного мозга, столько же суспензии наносили на поверхность покровного стекла (контроль). По истечении 2 минут в чашки Петри доливали 3 мл питательной среды 199 (ПанЭко, Москва). Все пробы инкубировали в термостате при +37°С в присутствии 5% двуокиси углерода в течение 3 часов. Затем во всех чашках Петри сливали несвежую питательную среду и приливали 300 мкл свежей с добавлением 150 мкл флуоресцентного красителя. Пробы с флуоресцентным красителем инкубировали 5 мин в термостате при +37 °С в присут-ствии двуокиси углерода. После истечения времени образцы в виде мембраны выни-мали из чашек Петри и помещали на покровные стекла (опытная проба). На покров-ные стекла опытной (с мембраной) и контрольной проб (только клетки) добавляли 150 мкл питательной среды 199.
Сканирование проб и последующий анализ проводили на конфокальном лазер-ном санирующем микроскопе Nikon DIGITAL ECLIPSE C1 plus с использованием лазера 488 нм и режима Z-Stack (сканирование образца по осям Х, Y, Z). В пробах на каждые 100
клеток подсчитывали количество живых (зеленая флуоресценция в цитоплазме) и мерт-вых клеток (красная флуоресценция в ядре), рассчитав их жизнеспособность (%) [9]. Изучение морфологии клеток костного мозга опытных и контрольных проб проводили на растровом электронном микроскопе (РЭМ) «Quanta 200 3D» (FEI Com-pany, США) в режиме низкого вакуума (оборудование Центра коллективного пользо-вания научным оборудованием НИУ «БелГУ» «Диагностика структуры и свойств на-номатериалов»). Во второй серии в опытах in vivo для оценки биосовместимости материала был применен метод «Подкожной инокуляции» согласно требованиям ГОСТ Р ИСО 10993-6-2009 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изде-лий. Часть 6. Исследования местного действия после имплантации». Использовано 12 животных по 6 штук в опытной и контрольной (ложно оперированные) группах. Все экспериментальные исследования с использованием животных проводили в соответст-вии с международными требованиями [11] и согласно ГОСТ Р ИСО 10993-6-2009 «Из-делия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 2. Требования к обращению с животными». Опытной группе инокулировали мембрану в прослойку соединительной ткани под кожу, расположенную на спине подопытного животного. После проведения ане-стезии и обработки участка кожи антисептическим раствором разрезали кожу живот-ного, тупым рассечением делали один карман шириной 2 мм и глубиной 4 мм. В кар-ман помещали один образец исследуемого материала, рану обрабатывали спиртовым раствором специальной синтетической фенолформальдегидной смолы, поливинилбу-тирола и канифоли с добавлением пластификатора. В группе контроля (ложно опери-рованные животные) все манипуляции осуществляли по схеме, примененной на кры-сах опытной группы. Оценку биологического действия материалов проводили через 7 дней после операции, макро- и микроскопически исследовали реакцию соединитель-ных тканей в зоне дефекта. Степень реакции определяли измерением расстояния от поверхности соприкосновения имплантата с тканью до участков, имеющих характери-стики интактной ткани с нормальным кровообращением. После макроскопического исследования проводили резекцию соединительной ткани. Гистологические препараты из тканей зоны дефекта готовили общепринятыми методами. Оценивали следующие параметры: степень фиброза и воспаления; дегене-рацию окружающих тканей; наличие некроза; степень интеграции материала имплан-тата с соединительной тканью инокуляционной зоны. Объем регенераторного процес-са (в %) определяли при помощи сетки со 100 точками (81 квадрат = 100%), вставлен-ной в окуляр стереомикроскопа Leica EZ4D [1]. Гистологические препараты, окрашен-ные гематоксилин-эозином, изучали при помощи аппаратно-программного комплекса Видео-Тест-Размер (микроскоп Axioplan plus фирмы Zeiss). Результаты исследования и их обсуждение. В эксперименте in vitro при помощи конфокальной лазерной сканирующей микроскопии была зарегистрирована флуоресценция живых и мертвых клеток, инку-бированных на стекле (контрольная проба) и на резорбируемой мембране (опытная проба). При сканировании каждой мембраны послойно (по оси Z) выявлены клетки красного костного мозга, располагающиеся во всей толще материала (рис. 2). Анализ флуоресцентных изображений слоев мембраны (опыт) и поверхности покровного стекла (контроль) показал, что жизнеспособность клеток красного костно-го мозга, взаимодействующих с волокнами мембраны, составляет 80% и не отличается от клеток, контактирующих со стеклом. В ходе изучения электронограмм было установлено, что на резорбируемых мембранах клетки красного костного мозга сохраняют свои морфологические особенности. Поверхность клеток имеет развитую складчатость с выростами в виде коротких микроворсинок и ламеллоподий. Часть клеток, прикре-пившись к субстрату, сохраняет сферическую форму, другие клетки распластаны по субстрату и имеют вид полусферы (рис. 3).
1 52.00 ит 11 32.00 ит # 21 12.00 ит »
* * •
« • * к 1 *
■ч» •
0 « „ • ■ • А * #ч V
• • • • • • ■
% •
31 -8.00 ит 41 -28.00 ит 51 -48.00 ит
ф • » • * •
• 4
• • г • • > • • « • VI • » • • •• • '(> % \< • 1 ^ Л
Рис. 2. Серии оптических срезов: №1,11, 21, 31, 41, 51 (слева направо) с флуоресценцией волокон резорбируемой мембраны (красный цвет) и живых (зеленая флуоресценция) и мертвых (красная флуоресценция) клеток красного костного мозга. Увел. Х 40
Рис. 3. Электронограмма. Клетки костного мозга (одинарная стрелка) на поверхности резорбируемой мембраны (волокна ксеноколлагена - двойная стрелка)
Таким образом, компоненты резорбируемой мембраны не обладают цитоцид-ным и цитостатическим эффектами, а структура и топография поверхности мембраны не препятствует миграции клеток в толщу материала.
В опытах in vivo, при макроскопическом изучении зон дефекта, на коже живот-ных внешних признаков местной асептической воспалительной реакции не выявлено во всех экспериментальных группах. Так, в зоне дефекта у животных контрольной группы с внутренней стороны кожного лоскута отмечается умеренная васкуляризация тканей, что свидетельствует о завершении процессов регенерации. Нижележащие под кожей слои соединительной и мышечной тканей в зоне дефекта без признаков патоло-гической дегенерации. В соединительно-тканном регенерате превалируют зрелые фибробласты над другими клеточными элементами; паренхима представлена волок-нистыми структурами с продольной ориентацией. Степень реакции ткани на оперативное вмешательство была слабой и составляла менее 0,5 мм. Объем регенераторно-го процесса составил 10% площади зоны дефекта. Более интенсивное протекание регенераторного процесса в зоне дефекта отме-чается в опытной группе. В данной группе вокруг резорбируемой мембраны сформи-ровалась соединительно-тканная капсула. Извлеченная из капсулы резорбируемая мембрана имела меньшие геометрические параметры (1 мм х 1 мм х 0,5 мм) по срав-нению c исходными. Капсула мягкой консистенции с тонкой стенкой, через которую просматривается резорбируемая мембрана. Паренхима капсулы имеет обильную вас-куляризацию. Кровеносные капилляры полнокровны, образуют густую сеть по всей поверхности капсулы (рис. 4).
/ \
/ 4
Рис. 4. Соединительно-тканная капсула с густой сетью кровеносных капилляров вокруг резорбируемой
мембраны
Степень реакции ткани на инокуляцию данного материала была умеренной и составила 1,5 мм. Объем регенераторного процесса составил 70% площади зоны дефек-та. В соединительнотканном регенерате преобладает плотная волокнистая соедини-тельная ткань, имеющая продольную ориентацию фибрилл. Повсеместно в паренхиме регенерата определяются как дифференцирующиеся, так и зрелые фибробласты. Ре-зорбируемая биомембрана в силу своих физико-химических свойств способствует ре-паративной регенерации соединительных тканей и
формированию густой сети микро-капилляров. В месте имплантации отмечается резорбция биомембраны с сохранением заданных свойств, что свидетельствует о слабой биорезистентности компонентов мате-риала к воздействию сред организма. Заключение. В ходе исследования было установлено, что резорбируемая биомембрана не яв-ляется цитотоксичной, продукты ее разрушения при контакте с клетками не оказыва-ют отрицательного воздействия на процессы их жизнедеятельности. Инокулированная под кожу мембрана является биоактивной, биосовместимой, биорезорбируемой и мо-жет использоваться в качестве прототипа нового остеопластического материала для восстановления дефектов костных тканей. Работа выполнена в рамках договора об условиях предоставления и использо-вания субсидии на реализацию комплексного проекта по созданию высокотехноло-гичного производства, выполняемого с участием российского высшего учебного за-ведения № 13.G25.31.0006 от 07.09.2010 г. «Биосовместимые композиционные и кальцийсодержащие остеопластические и лечебно-профилактические материалы для медицины».
Литература
1. Автандилов, Г.Г. Медицинская морфометрия / Г.Г. Автандилов. — М. : Медицина, 1990. — 384 с.
2. Григорян, А.С. Проблемы интеграции имплантатов в костную ткань (теоретические аспекты) / А.С. Григорян. — М. : Техносфера, 2007. — 128 с.
3. Грудянов, А.И. Остеопластические материалы, используемые при хирургическом ле-чении заболеваний пародонта / А.И. Грудянов, А.И. Ерохин // Пародонтология. — 1998. — № 1. — С. 1321.
4. Еропкина, М.Ю. Культуры клеток как модельная система исследования токсичности и скрининга цитопротекторных препаратов. / М.Ю. Еропкина, Е.М. Еропкин. — СПб. : МОРСАР АВ, 2003. — 239 с.
5. Корж, Н.А. Имплантационные материалы и остеогенез. Роль индукции и кондукции в остеогенезе / Н.А. Корж, В.А. Радченко, Л.А. Кладченко // Ортопедия, травматология и протезирование. — 2003. — № 2. — С. 150-157.
6. Островский, А. В. Остеопластические материалы в современной пародонтологии и имплантологии / А. В. Островский // Новое в стоматологии. — 1999. — № 6. — С. 39-52.
7. Петров, Р.В. Костномозговые иммунорегуляторы миелопептиды / Р.В. Петров, А.А. Михайлова, Л.А. Фонина // Российский химический журнал : Научно-теоретический жур-нал по химии и химической технологии. Журнал Российского общества им. Д.И. Менделеева. — 2005. — Т. 49, №1.
— С. 55-63.
8. Пинаев, Г.П. Методы культивирования клеток / Г.П. Пинаев, М.С. Богданова. - СПб. : Изд-во Политехн. ун-та, 2008. — 278 с.
9. Andrew, L. Fluorescent Viability Stains Overestimate Chondrocyte Viability in Osteoarticu-lar Allografts / L. Andrew, M. James, A. Annunziato // The American Journal of Sports Medicine. - 2007. -Vol. 35. - № 11. - Р. 1817-1823.
10. Alderson, M. Fas Ligand Mediates Activation-induced Cell Death in Human T Lymphocytes / Mark g. Alderson.// J. Exp. Med. - 1995. - Vol. 181. - P. 71 - 77.
11. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition. — URL: http://www.aaalac.org/resources/theguide.cfm (дата обращения 12.03.2012).
THE ESTIMATION OF BIOACTIVITY AND BIOCOMPATIBILITY OF OSTEOPLASTIC MATERIAL
IN EXPERIENCES IN VITRO AND IN VIVO
M.Z. FEDOROVAi S.V. NADEZHDIN1 V.F.TPOSOKHOVA2 The aim of the study is the estimation of the V.V.CHUEV1 V.A. SHATERNIKOVAi, Belgorod
cytotoxicity and ability to support a histotypic
.„ - „ , differentiation of cells during the implantation of a
National Research University Joint-Stock . n.. t-i jr t r
r <№7 vi tiM'v "!• • new osteoplastic material used for restoration of
Company SEZ VladMiVa e-mail:: ... ... . . . r ..
nadezhdin@bsu.edu.ru defects of bone tissues. The research is performed in
two stages and is based on the use of white laboratory rodents (Wistar). The resorbable biomembrane based on xenokollagen, which was made by Joint-Stock Company SEZ VladMiVa (Belgorord) is used as a research material. The study of samples was conducted with the transmitted light microscopy, confocal laser scanning microscopy and
scanning electron microscopy. As it is established in the course of study the resorbable biomembrane based on xenokolla-gen as the data for research is not cytotoxic; cells incubated on it retain their viability and morphological features. The osteoplastic material inoculated under skin is biocompatible and bioactive; and its resorption and active progress of regenerative process of connective tissue is marked. Key words: osteoplastic material, resorbable biomembrane, bioactivity, biocompatibility, bioresistance.
