ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ И ЭФФЕКТИВНОСТИ МЕТОДА ИНГАЛЯЦИОННОГО ВВЕДЕНИЯ МАЛЫХ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ВЕЗИКУЛ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПУПОЧНОГО КАНАТИКА ЧЕЛОВЕКА, ПРИ ДВУСТОРОННЕЙ ПНЕВМОНИИ, ОБУСЛОВЛЕННОЙ НОВОЙ КОРОНАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ SARS-COV-2 Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

DOI: 10.23868/202205004

ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ И ЭФФЕКТИВНОСТИ МЕТОДА ИНГАЛЯЦИОННОГО ВВЕДЕНИЯ МАЛЫХ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ВЕЗИКУЛ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПУПОЧНОГО КАНАТИКА ЧЕЛОВЕКА, ПРИ ДВУСТОРОННЕЙ ПНЕВМОНИИ, ОБУСЛОВЛЕННОЙ НОВОЙ КОРОНАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ SARS-COV-2

О.В. Тюмина1, 2, И.Л. Давыдкин2, С.Е. Волчков1, /Поступка:01.01.2022

П.А. Овчинников1, А.И. Бугаков1, Д.Ю. Шаронова1, _ Принята кпечати:29.05.2022

-,..««-. с Опубликована on-line: 30.05.2022

Д.Ю. Константинов2, И.А. Золотовская2

1 Самарский областной медицинский центр «Династия», Самара, Россия

2 Самарский государственный медицинский университет, Самара, Россия

SAFETY AND EFFICIENCY OF INHALATION METHOD FOR ADMINISTRATION OF SMALL EXTRACELLULAR VESICLES DERIVED FROM MULTIPOTENT MESENCHYMAL STROMAL CELLS OF HUMAN UMBILICAL CORD IN SARS-COV-2 ASSOCIATED PNEUMONIA

O.V. Tiumina1, 2, I.L. Davydkin2, S.E. Volchkov1, P.A. Ovchinnikov1, A.I. Bugakov1, D.U. Sharonova1, D.U. Konstantinov2, I.A. Zolotovskaya2

1 Samara Regional Medical Center "Dinasty", Samara, Russia

2 Samara State Medical University, Samara, Russia

e-mail: centr123@bk.ru

Коронавирусная инфекция (С0УЮ-19)—острое вирусное заболевание с преимущественным поражением верхних дыхательных путей, является вызовом для современной медицины. Учитывая, что в патогенезе коронавирусной пневмонии имеется нарушение иммунного ответа (гиперреакция, цитокиновый шторм), перспективным в лечении пневмонии могут быть препараты, локально регулирующие иммунный ответ. Биологическая активность малых внеклеточных везикул активно исследуется в мире. Малые внеклеточные везикулы мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) пупочного канатика человека обладают антиапоп-тотическим, противовоспалительным и иммуномодулирующим эффектами, кроме того, они стимулируют пролиферацию.

Цель исследования: провести оценку безопасности и эффективности метода ингаляционного введения малых внеклеточных везикул при двусторонней пневмонии, обусловленной новой коронавирусной инфекцией БАРБ-СоУ-2.

Было проведено интервенционное, проспективное, рандомизированное, двойное слепое плацебо-контролируемое исследование, в котором участвовало 36 пациентов с подтверждённой новой коронавирусной инфекцией С0УЮ-19, осложнённой двусторонней пневмонией, средней степени тяжести (по 12 человек в исследуемых группах 1 и 2, различающихся по типу введенных малых внеклеточных везикул, и 12 человек в контрольной группе). Ингаляцию малых внеклеточных везикул проводили 2 раза в сутки в количестве 2-10х1010 частиц. Эффективность и безопасность метода оценивали по общему состоянию пациентов, тяжести заболевания, показателям общего и биохимического анализа крови, данных коагулограммы, сатурации, компьютерной томографии лёгких до и через 10 сут. после начала лечения. Период наблюдения после госпитализации — 30 сут. В ходе исследования была доказана безопасность метода, все пациенты выздоровели. Установлены достоверные различия между пациентами исследуемых групп 1, 2 и контролем по показателю С-реактивного белка крови, который нормализовался к 10 сут. после начала лечения у пациентов 1 и 2 групп, однако оставался повышенным у пациентов контрольной группы. По другим оцениваемым показателям значимых различий выявлено не было.

Ключевые слова: новая коронавирусная инфекция, малые внеклеточные везикулы.

The coronavirus infection (COVID-19), an acute viral disease with predominant affection of the upper respiratory tract, is a challenge for modern medicine. Considering the fact that in the patho-genesis of coronavirus pneumonia there is violation of the immune response (hyper-response, cytokine storm) the drugs that locally regulate it may be promising in the pneumonia treatment. Biological activity of exosomes is widely investigated in the world. Small extracellular vesicles of mesenchymal cells have the following effects: anti-apoptotic, proliferation stimulation, anti-inflammatory and immunomodulatory.

Objective: to evaluate the safety and efficacy of the method of inhalation administration of small extracellular vesicles in bilateral pneumonia caused by a new SARS-CoV-2 coronavirus infection.

To study these effects an interventional, prospective, randomized, double-blind, placebo-controlled study has been conducted to evaluate the safety and efficacy of inhaled small extracellular vesicles administration to the patients with bilateral pneumonia caused by the new coronavirus infection SARS-CoV-2. Altogether 36 patients with confirmed new coronavirus infection COVID-19, complicated by bilateral pneumonia of moderate severity (12 patients each in study groups 1 and 2, depending on the type of given small extracellular vesicles, and the control group) participated in the study. Small extracellular vesicles were inhaled twice a day in the dose of 2-10x1010 particles. The efficacy and safety of the method were assessed judging by the patients' general state, assessment of the disease severity, general and biochemical blood tests, coagulogram, saturation, CT scan of the lungs before and after 1 0 days of treatment. The observation period was 30 days after hospitalization. During the study the safety of the method was proved, all the patients recovered. Reliable differences of the blood CRP index, which normalized by day 10 of treatment in groups 1 and 2, but remained elevated in the control group. No significant differences were found in other assessed parameters.

Keywords: new coronavirus infection, small extracellular vesicles.

Введение

Коронавирусная инфекция (С0УЮ-19) — острое вирусное заболевание с преимущественным поражением

верхних дыхательных путей. Актуальным является поиск новых методов лечения этого заболевания. Основные клетки-мишени для коронавирусов — это клетки

альвеолярного эпителия, в цитоплазме которых происходит репликация вируса. После сборки вирионов они переходят в цитоплазматические вакуоли, мигрирующие к мембране клетки и путем экзоцитоза выходящие во внеклеточное пространство. Антигены вируса на поверхности клетки не активируются до выхода вирионов из клетки, поэтому образование антител и синтез интерферонов начинается не сразу, а спустя несколько дней после начала заболевания. Образование синцития под воздействием вируса обусловливает возможность последнего быстро распространяться в ткани. Действие вируса вызывает повышение проницаемости клеточных мембран и усиленный транспорт жидкости, богатой альбумином, в интер-стициальную ткань лёгкого и просвет альвеол. При этом разрушается сурфактант, что ведёт к коллапсу альвеол, в результате резкого нарушения газообмена развивается острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС). В патогенезе ОРДС вследствие инфекции COVID-19 основную роль играет избыточный ответ иммунной системы со стремительно развивающимся фатальным цитокино-вым штормом. Проведенные исследования показали, что смертность при COVID-19 ассоциирована, в том числе, с повышением уровня интерлейкина-6 (ИЛ-6). Учитывая, что в патогенезе коронавирусной пневмонии имеется нарушение иммунного ответа (гиперреакция, цитокино-вый шторм), перспективным в лечении пневмонии могут быть препараты, локально регулирующие иммунный ответ, например, мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), так как они подавляют гипериммунный ответ, переключая воспалительную фазу в фазу репарации, стимулируя восстановление поврежденной ткани и блокируя рост соединительной ткани, что, по-видимому, может уменьшить объем фиброза при пневмонии COVID-19 [1]. На сайте clinical trials.gov есть информация о проводимых в настоящее время более 40 исследований с использованием ММСК при пневмониях [2]. Последние открытия в области молекулярной биологии и биологии стволовых клеток, показали, что ММСК вырабатывают малые внеклеточные везикулы. Внутри малых внеклеточных везикул находятся регулятор-ные вещества, среди которых особо выделяют хемокины, цитокины, микроРНК и малые интерферирующие РНК [3].

Основная функция малых внеклеточных везикул — защита и транспортировка регуляторных молекул из клетки в клетку. Их оболочка состоит из двухслойного липидного слоя и включает керамиды, холестерол, сфинголипиды, фосфоглицериды, белки-рецепторы, обеспечивая высокий уровень проникновения внутрь клеток и эффективную защиту во внеклеточном пространстве. Проникая в клетку через мембрану, малые внеклеточные везикулы высвобождают регуляторные молекулы, запуская каскад биологических реакций, изменяющих состояние и поведение клетки. Среди таких регуляторов особенно важными являются микроРНК.

МикроРНК — самые эффективные регуляторы жизнедеятельности клеток — это естественный механизм регуляции экспрессии генов, встроенный в клетки, а их эффект разнообразен и зависит от состояния и типа клеток, которые их производят. Так, например, малые внеклеточные везикулы ММСК обладают антиапоптоти-ческим, противовоспалительным иммуномодулирующим эффектами и стимулируют пролиферацию [4].

Биологическая активность малых внеклеточных везикул активно изучается в мире, в том числе имеются зарегистрированные клинические исследования по использованию малых внеклеточных везикул при COVID-19. Предполагают, что малые внеклеточные везикулы могут блокировать чрезмерное высвобождение

провоспалительных цитокинов и снижать апоптоз клеток, что приводит к сокращению объема повреждения легочной ткани [5-7]. Наличие факторов, стимулирующих репарацию функциональной ткани, позволит сократить область фиброза и способствовать более быстрой рекон-валесценции пациентов. Малые внеклеточные везикулы содержат комплекс цитокинов: SCF — фактор роста стволовых клеток; PDGF — тромбоцитарный фактор роста, TGF — трансформирующий фактор роста, IGF — инсулино-подобный фактор роста, VEGF — фактор роста эндотелия сосудов, bFGF — основной фактор роста фибробластов, а так же комплекс регуляторных микроРНК: MiR-19, 29, 32, 125, 141, 150, 152, 200, обеспечивающих регуляцию пролиферативной активности фибробластов; MiR-21, 24, 31, 125b, 198, 205, 483, стимулирующих пролиферацию специализированных клеток; MiR-24, 34, 125b, отвечающих за васкуляризацию и миграцию стволовых клеток [8, 9]. Учитывая большое разнообразие комплексов регуля-торных молекул, содержащихся в малых внеклеточных везикулах, и данные об их эффективности как in vitro, так и in vivo, можно предположить, что введение малых внеклеточных везикул будет существенно влиять на исход заболевания. Поскольку основной патологический процесс при COVID-19 локализован в легочной ткани, встает вопрос об эффективной доставке малых внеклеточных везикул. Исходя из того, что малые внеклеточные везикулы — это частицы нанометрового размера (2-80 нм), наиболее оптимальным методом их локальной доставки может считаться ингаляционный [10]. Известно, что ультразвуковые или компрессорные небулайзеры диспергируют лекарственные препараты в аэрозоль с размером частиц около 1 микрона, однако точных данных о безопасности такого метода введения малых внеклеточных везикул в доступной литературе нет.

Цель исследования: провести оценку безопасности и эффективности метода ингаляционного введения малых внеклеточных везикул при двусторонней пневмонии, обусловленной новой коронавирусной инфекцией SARS-CoV-2.

Материал и методы

Исследование выполнено методом ограниченного клинического наблюдения на базе инфекционных отделений ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России и ГБУЗ «СОКБ им. В.Д. Середавина», малые внеклеточные везикулы получали в лаборатории клеточных технологий ГБУЗ «Самарский областной медицинский центр Династия». Исследование одобрено этическим комитетом ГБУЗ «МЦ Династия» (протокол № 5 от 08.07.2020). Тип исследования: интервенционное, проспективное, рандомизированное, двойное слепое плацебо-контролируемое.

Обязательным условием включения в исследование было наличие добровольного информированного согласия пациента на участие в исследовании. Методы исследования: наблюдение, лабораторная аналитическая и статистическая оценка.

Критерии включения в исследование

Пациенты были включены в исследование, если соответствовали следующим критериям:

• способность понять цели и риски исследования и предоставить подписанное и датированное информированное согласие;

• мужчины и женщины в возрасте >18 и <65 лет на момент подписания формы информированного согласия;

• инфекция вирусом 8ДП8-СоУ-2, подтвержденная по критериям Всемирной организации здравоохранения (положительный результат теста на нуклеиновые кислоты в любом образце [из дыхательных путей, в крови, в моче, в образце стула или другой жидкости тела]) в течение 4 сут. от рандомизации; средняя степень тяжести заболевания;

• вызванная С0УЮ-19 пневмония (подтвержденная методом ПЦР и радиологическими методами), требующая госпитализации, и насыщение кислородом <94% в помещении, либо потребность во вспомогательном кислороде. Подтверждённый объем поражения легких по компьютерной томографии (Кт): не менее 30% и не более 80%;

• способность выполнять ингаляцию.

Критерии невключения пациентов (противопоказания к данному виду лечения):

• дыхательная недостаточность тяжёлой степени на момент скрининга в связи с С0УЮ-19 пневмонией;

• известное проведение медицинской реанимации в течение 14 сут. до рандомизации;

• любое серьезное медицинское состояние или отклонение клинического лабораторного параметра, которое, по мнению исследователя, препятствует безопасному участию и завершению исследования участником; подтвержденная неконтролируемая активная бактериальная, грибковая, вирусная или другая инфекция (помимо 8Д1=!8-СоУ-2);

• по мнению исследователя, прогрессирование до летального исхода неизбежно и наступит в течение ближайших 24 ч., независимо от проведения терапии.

Медицинские состояния:

• ожидаемая продолжительность жизни менее 28 сут., учитывая уже имеющееся, не подлежащее коррекции медицинское состояние, например, у участников со следующими состояниями или подозрением на них: полиорганная недостаточность, плохо контролируемые новообразования, заболевания сердца терминальной стадии, остановка сердца, которая потребовала сердечно-легочной реанимации, либо электрическая активность, не сопровождающаяся пульсом, либо асистолия в течение последних 30 сут., заболевание легких терминальной стадии, заболевание печени терминальной стадии, инфекция вирусом иммунодефицита человека, синдром приобретенного иммунодефицита с известными терминальными проявлениями, сахарный диабет в стадии декомпенсации;

• беременность или грудное вскармливание;

• уровни аланинаминотрансферазы, аспартатами-нотрансферазы и(или) билирубина >5 ВГН (верхняя граница нормы) и(или) тяжелое нарушение функции печени (класса С по Чайлд-Пью), выявленные в течение 24 ч. на скрининге (по данным местной лаборатории);

• абсолютное число нейтрофилов (АЧН) <500 кл./мкл на скрининге (по данным местной лаборатории);

• число тромбоцитов <50 000 кл/мкл на скрининге (по данным лаборатории);

• уровень креатинина >1,5 от верхней границы нормы;

• неконтролируемая аритмия с клиническими проявлениями, инфаркт миокарда в течение последних 6 недель или застойная сердечная недостаточность (степени 3 или 4 по классификации NYHA);

• исключение: участники с контролируемой бессимптомной фибрилляцией предсердий во время скрининга могут участвовать в исследовании;

• дыхательная недостаточность в последние 6 мес. или применение кислорода на дому в условиях тяжелого хронического респираторного заболевания (ХОБЛ);

• квадриплегия;

• первичный иммунодефицит, туберкулёз, прогрессирующая мультифокальная лейкоэнцефа-лопатия, аспергиллез или другая инвазивная плесневая, грибковая инфекция в анамнезе, или трансплантация внутренних органов или костного мозга в течение 6 мес. до рандомизации;

• известная инфекция вирусами гепатита B или C, требующая терапии.

Показания и противопоказания к данному виду лечения для каждого пациента определялись на консилиуме врачей.

Методы и цели исследования пациентов представлены в табл. 1.

В исследовании приняли участие 36 пациентов, разделенных на 3 группы, по 1 2 человек в каждой группе. Средний возраст пациентов: 1 группа — 47,9 ± 4,2 (6 мужчин, 6 женщин), 2 группа — 52,3 ± 2,1 (4 мужчины, 8 женщин), 3 группа (контроль) — 53,3 ± 1,0 (6 мужчин, 6 женщин). Всем пациентам был установлен диагноз новая коронавирусная инфекция COVID-19, подтверждённая методом ПЦР, осложнённая двусторонней пневмонией, среднетяжёлое течение. Диагноз поставлен на основании клинических симптомов (температура более 37,5°; затрудненное дыхание, одышка (25-30 дыхательных движений в минуту); кашель; ощущение сдавливания в грудной клетке; общая слабость); лабораторных данных; КТ признаков двусторонней вирусной пневмонии с поражением от 30 до 45% лёгочной ткани (КТ 2) и уровня сатурации крови кислородом (менее 95%, но более 92%) по результатам пульсоксиметрии.

Пациенты 1 и 2 групп получали ингаляции малых внеклеточных везикул разных типов (EXO-1 и EXO-2), пациенты 3 группы — плацебо. Все пациенты получали стандартную терапию: гидрохолин или фавипиравир, антибиотики, антикоагулянты, глюкокортикостероиды (ГКС, 12-16 мг/сут. дексаметазона внутривенно за 2 введения, доза ГКС снижалась на 20-25% на введение каждые 1-2 сут.).

Получение малых внеклеточных везикул

Малые внеклеточные везикулы первого типа (EXO-1) получали из клеток, выделенных из пупочного канатика человека методом ферментативной обработки коллаге-назой (Gibco, США). По своим характеристикам (фибро-бластоподобная морфология; наличие поверхностных антигенов CD73, 90 и 105; отсутствие маркеров клеток крови CD 45, 14, 34 (по данным проточной цитофлоу-риметрии); дифференцировка в хондрогенном, остео-генном и адипогенном направлениях в условиях in vitro с применением специальных сред) полученные клетки можно отнести к ММСК.

ММСК пупочного канатика человека, замороженные на 2-3 пассаже, размораживали, отмывали от крио-протектора трехкратно раствором фосфатно-солевого буфера (Биолот, Россия), высевали на чашку Петри

Таблица 1. Методы исследования

№ Название Цель Метод Частота

1 Количество участников с несерьезными и серьезными побочными эффектами Оценка безопасности процедуры Сбор информации о нежелательных реакциях на ингаляцию На протяжении всего исследования

2 Биохимическое исследование крови Оценка эффективности процедуры C-реактивный белок, ЛДГ, КФК, АЛТ, АСТ, общий белок; билирубин, креатинин, ферритин 0, 10 сут.

3 Коагулограмма Оценка эффективности процедуры Фибриноген, АЧТВ, ПТИ 0, 10 сут.

4 Общий анализ крови Оценка эффективности процедуры Le, Neu, Tr 0, 10 сут.

5 Объём остаточных явлений поражения лёгких на КТ в динамике после выписки Оценка эффективности процедуры КТ лёгких На момент постановки диагноза, через 10-14 сут. госпитализации

6 Пульсоксиметрия Оценка эффективности процедуры Сатурация — насыщение крови кислородом Ежедневно в течение госпитализации до и после каждой ингаляции

7 Измерение АД/ЧСС Оценка безопасности процедуры Артериальное давление и частота сердечных сокращений Ежедневно в течение госпитализации до и после каждой ингаляции

8 Температура Оценка эффективности процедуры Температура тела Ежедневно в течение госпитализации

9 ЭКГ Скрининг перед вводом в группу Электрокардиограмма Перед включением в группу

10 Срок госпитализации Оценка эффективности процедуры. Количество сут. госпитализации Однократно оценивается при выписке

11 Физикальное исследование Скрининг перед вводом в группу Масса тела, ИМТ 0, 1, 10 сут., на момент выписки, через 30 сут. после выписки

12 Анализ на С0УЮ-19 Оценка эффективности процедуры ПЦР 0, 10, 12 сут.

Примечание: ЛДГ — лактатдегидрогеназа, КФК — креатинфосфокиназа, АЛТ — аланинаминотрансфераза, АСТ — аспартатаминотрансфераза, АЧТВ — активированное частичное тромбопластиновое время, ПТИ — протромбиновый индекс, Le — лейкоциты, Neu — нейтрофилы, Тг — тромбоциты, ИМТ — индекс массы тела, АД — артериальное давление, ЧСС — частота сердечных сокращений, ПЦР — полимеразная цепная реакция.

диаметром 10 см с плотностью 3х103 клеток на 1 см2 культурального пластика и культивировали в питательной среде А-МЕМ (Биолот, Россия) с добавлением 5% обогащенной тромбоцитами плазмы пуповинной крови (ГБУЗ «МЦ Династия», Россия). При достижении 70% конфлюэнта питательную среду заменяли на свежую в объеме 15 мл, инкубировали в течение 4 сут. для обогащения среды малыми внеклеточными везикулами, кондиционированную среду собирали и фильтровали через фильтры с диаметром пор 0,22 мкм [11].

Второй тип малых внеклеточных везикул (ЕХО-2) получали по вышеописанной технологии, но после сбора кондиционированной среды все клетки-продуценты (6-8х106 ММСК) снимали с пластика раствором 0,25% Трипсина-ЭДТА (Биолот, Россия), добавляли в кондиционированную среду и разрушали последовательной трехкратной шоковой заморозкой в жидком азоте с последующей фильтрацией через фильтры (0,22 мкм) для удаления клеточного дебриса.

Концентрацию малых внеклеточных везикул определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА)

с применением набора реактивов ExoELISA-ULTRA Complete Kit CD63 Detection (SBI, США) и методом динамического рассеивания света (DLS, анализатор размеров и концентрации наночастиц АРН-мини, Россия). Средняя концентрация частиц во всех образцах (n=480) составила 1,5 ± 1,0х 1010, объем образца на 1 ингаляцию — 3 мл.

Плацебо представлял собой раствор объемом 3 мл, содержащий питательную среду для культивирования ММСК (А-МЕМ с добавлением 5% обогащенной тромбоцитами плазмы пуповинной крови), не обогащенную малыми внеклеточными везикулами.

Ингаляцию малых внеклеточных везикул проводили 2 раза в сут. с использованием небулайзера типа ANDCN-231 (A&D Company, Япония) в течение 15 мин. через равные промежутки времени (в 8.00 и 20.00 ч.). Курс лечения — 10 сут. До и после процедуры ингаляции проводили пульсоксиметрию, измеряли артериальное давление и частоту сердечных сокращений, оценивали жалобы и общее состояние пациента. Непосредственно после ингаляции пациента наблюдали в течение не менее 60 мин.

Таблица 2. Ранние нежелательные реакции за период наблюдения (1 4 сут.)

Нежелательные реакции Группа 1 n=12 Группа 2 n=12 Контрольная группа n=12

Психиатрические расстройства (агрессия, возбудимость) 0 0 0

Неврологические расстройства (головная боль, головокружение) 1 0 1

Аллергические реакции (отёк Квинке, бронхоспазм, сыпь, судороги) 0 0 0

Резкое изменение артериального давления (повышение или понижение) 0 1 0

Острый тромбоз сосудов 0 0 0

Повышение температуры после ингаляции 0 0 0

Итого: 1 1 1

Таблица 3. Показатели периферической крови

Показатели общего анализа крови/ Ё Е >5 й£ Группа 2 (M ± m) Контрольная группа (M ± m) р

ед. изм. Сут. 0 Сут. 10 Сут. 0 Сут. 10 Сут. 0 Сут. 10

Лейкоциты/109/л 7,5 ± 3,3 5,9 ± 1,3* 6,2 ± 1,9 7,0 ± 1,8* 5,7 ± 1,9 7,8 ± 2,8* >0,05

Нейтрофилы, % 73,8 ± 21,5 55,1 ± 14,7* 72,2 ± 11,2 54,2 ± 14,1* 67,2 ± 11,2 58,5 ± 15,5* >0,05

Тромбоциты/109/л 242,6 ± 135,8 331,3 ± 110,2* 268,1 ± 142,8 324,3 ± 124,7* 206,8 ± 101,1 316,9 ± 105,3* >0,05

Примечание: * р — уровень значимости различий между пациентами 1, 2 и контрольной групп через 10 сут. после начала терапии.

Статистический анализ

Результаты исследования были подвергнуты статистической обработке методами параметрической и непараметрической статистики с использованием программ STATA version 9.0, Statisticafor Windows версии 6.0 и MSOffice Excel 2007. Эффективность терапии оценивали, сравнивая показатели до начала терапии и через 10 сут. после начала терапии, используя критерий Уилкоксона, сравнение данных между основной группой и группой контроля проводили непараметрическим методом с помощью теста Манна-Уитни, при нормальном распределении признака применяли параметрические методы статистики.

Результаты

Оценка безопасности: ранних осложнений, связанных с ингаляцией малых внеклеточных везикул и угрожающих жизни пациентов, не наблюдалось. Ранние нежелательные реакции (сразу после ингаляции) были зафиксированы у 1 (2,7%) пациента из 36: повышение артериального давления после ингаляции (табл. 2). В течение 14 сут. наблюдения нежелательные реакции были выявлены у 2 пациентов (5,5%) в виде периодических головных болей (табл. 2). Достоверных различий по нежелательным реакциям в течение 30 сут. наблюдения во всех группах отмечено не было. В каждой группе за период госпитализации в течение 14 сут. было зафиксировано по одной нежелательной реакции (8,3%, p>0,05).

Показатели сатурации у пациентов всех групп на 10 сут. пришли к норме. В течение первых сут. показатель сатурации у пациентов 1, 2 и контрольной групп составил 93,4 ± 0,2; 93,80± 0,4 и 93,2 ± 0,2 соответственно, а на 10 сут. - 98,6 ± 0,1; 98,3 ± 0,1 и 97,8 ± 0,2 соответственно. Таким образом, значимой разницы показателей сатурации между пациентами всех групп до начала лечения и через 10 сут. после начала терапии выявлено не было.

При оценке показателей абсолютного содержания лейкоцитов и тромбоцитов, а также относительного содержания субпопуляции нейтрофилов у пациентов в группах 1, 2 и контрольной группе, не было обнаружено значимой разницы между группами до начала терапии и через 10 сут. после начала терапии (табл. 3).

При оценке биохимических показателей крови была выявлена значимая разница по показателю С-реактивного белка (СРБ) между пациентами 1, 2 групп и пациентами контрольной группы через 10 сут. после начала терапии (табл. 4). Значимых различий по остальным показателям между группами до начала терапии и через 10 сут. после начала терапии обнаружено не было. У пациентов во всех группах наблюдалась нормализация изменённых биохимических показателей крови (ЛДГ, КФК, АЛТ, АСТ, ферритин) через 10 сут. после начала лечения.

При оценке показателей коагулограммы крови у пациентов в группах 1, 2 и контрольной группе не было выявлено значимой разницы между группами до начала терапии и через 10 сут. после начала терапии. У пациентов во всех группах наблюдалась нормализация изменённых показателей коагулограммы через 10 сут. после начала лечения (табл. 5).

У всех пациентов температура тела нормализовалась к 7-10 сут. после начала лечения, значимой разницы между группами выявлено не было. Показатели артериального давления и пульса менялись незначительно, значимой разницы между группами обнаружено не было.

Через 10 сут. после начала терапии по результатам оценки данных КТ наблюдалась положительная динамика, все пациенты выписывались из больницы с поражением лёгочной ткани менее 10%. Значимых изменений между группами по срокам госпитализации выявлено не было, средний срок госпитализации составил 15,4 ± 2,3 сут., минимальный срок госпитализации — 10 сут., а максимальный — 21 сут. Анализ на COVID на 10 сут. у всех пациентов был отрицательный.

Таблица 4. Показатели биохимического анализа крови

Показатели биохимичекского

Группа 1 (M ± m)

Группа 2 (M ± m)

Контрольная группа (M ± m)

анализа крови/ед. изм. Сут. 0 Сут. 10* Сут. 0 Сут. 10* Сут. 0 Сут. 10*

СРБ/мг/л 80,5 ± 22,7 3,5 ± 0,9 75,2 ± 12,6 3,8 ± 0,7 63,9 ± 12,1 11,3 ± 2,5 <0,05

ЛДГ/Ед/л 712,0 ± 348,8 407,6 ± 148,2 682,5 ± 418,7 346,1 ± 153,2 603,3 ± 291,9 382,8 ± 153,3 >0,05

КФК/Ед/л 134,4 ± 137,7 84,8 ± 53,6 151,5 ± 217,1 51,2 ± 34,5 204,4± 189,3 88,9 ± 88,2 >0,05

АЛТ/МЕ/л 47,5 ± 40,5 45,6 ± 40,7 46,3 ± 26,1 31,0 ± 16,9 31,2 ± 14,6 28,7 ± 16,3 >0,05

АСТ/МЕ/л 50,1 ± 49,6 26,3 ± 15,3 40,2 ± 24,3 23,1 ± 12,9 31,4 ± 16,1 22,2 ± 8,9 >0,05

Белок общий/г/л 70,6 ± 7,6 71,9 ± 7,0 73,2 ± 5,7 66,4 ± 5,5 71,3 ± 3,4 62,7 ± 17,0 >0,05

Билирубин общий/ мкмоль/л 10,1 ± 3,9 9,4 ± 4,6 9,3 ± 3,6 9,4 ± 3,4 11,1 ± 5,7 9,5 ± 4,6 >0,05

Креатинин/ мкмоль/л 68,5 ± 7,6 68,3 ± 7,9 78,3 ± 25,3 64,7 ± 16,5 71,8 ± 14,1 61,7 ± 10,4 >0,05

Ферритин/ мкг/л 462 ± 220,6 257,7 ± 135,6 373,7 ± 175,8 234,3 ± 60,3 474,0± 187,8 232,2 ± 74,5 >0,05

Примечание: * p — уровень значимости различий между пациентами 1, 2 и контрольной групп через 10 сут. после начала терапии; СРБ — С-реактивный белок, ЛДГ — лактатдегидрогеназа, КФК — креатинфосфокиназа, АЛТ — аланинаминотрансфераза, АСТ — аспартатаминотрансфераза.

Таблица 5. Показатели коагулограммы

Показатели Группа 1 Группа 2 Контрольная группа

коагулограммы/ (M ± m) (M ± m) (M ± m) р

ед. изм. Сут. 0 Сут. 10* Сут. 0 Сут. 10* Сут. 0 Сут. 10*

ПТИ (%) 73,1 ± 39,0 76,1 ± 39,1 65,5 ± 39,6 71,1 ± 37,3 66,9 ± 43,6 60,3 ± 39,1 >0,05

АЧТВ/сек 34,6 ± 7,5 35,7 ± 5,4 34,7 ± 5,3 34,2+8,2 37,6 ± 4,3 34,1 ± 6,1 >0,05

Фибриноген/г/л 5,8 ± 1,3 4,0 ± 1,2 5,7 ± 1,6 3,5+1,1 5,9 ± 1,1 3,5 ± 1,2 >0,05

Примечание: * р — уровень значимости различий между пациентами 1, 2 и контрольной групп через 10 сут. после начала терапии; ПТИ — протромбиновый индекс, АЧТВ — активированное частичное тромбопластиновое время.

Таблица 6. Нежелательные реакции через 30 сут. после госпитализации

Нежелательные реакции

Группа 1 n=10

Группа 2 Контрольная группа

n=7 n=10

Общая слабость Головная боль Снижение памяти Одышка

Итого нежелательных реакций

Нет жалоб

1 1 4 0 6 4

3 0 1 0

4 3

1 0

5 0

6 4

Через 30 сут. после выписки из стационара все пациенты были приглашены на приём к врачу терапевту в поликлинику для оценки общего состояния и осмотра с пульсоксиметрией. Из 36 пациентов на осмотр пришли 27 человек, у всех пациентов при осмотре показатели артериального давления, пульса, сатурации были в норме. Во всех группах каждый второй пациент предъявлял жалобы (табл. 6).

Обсуждение

Настоящее исследование было проведено с целью оценки безопасности и эффективности ингаляционного

метода введения малых внеклеточных везикул пациентам с новой коронавирусной инфекцией С0УЮ-19, осложненной двусторонней пневмонией. Полученные данные свидетельствуют, что применение ингаляционного метода введения малых внеклеточных везикул данным пациентам не приводит к осложнениям в краткосрочном и долгосрочном периодах.

Показатели сатурации у пациентов во всех группах на 10 сут. после начала терапии пришли к норме. Результаты показателей общего анализа крови и нейтрофилов статистически не различались, что может быть связано с большой разницей этих показателей на начальном этапе. Показатели коагулограммы

не выявили каких-либо статистически значимых различий между группами на 10 сут. терапии, что связано с активной антикоагулянтной терапией, проводимой в клинике. В биохимических показателях крови установлены значимые различия только по СРБ, который нормализовался к 10 сут. после начала лечения у пациентов в 1 и 2 группах, однако оставался значимо повышенным у пациентов в контрольной группе. Отсутствие значимых различий по другим показателям крови возможно связано с небольшой выборкой, а также отсутствием выраженного иммуновоспалительного компонента при среднетяжёлом течении болезни. Малые внеклеточные везикулы могут ингибировать CD4+ и CD8+Т-клетки и NK-клетки [6, 12], а также менять поляризацию макрофагов с M1 (про-воспалительный профиль) на M2 (противовоспалительный профиль). Точками приложения малых внеклеточных везикул являются TGF-p-рецептор 1, допамин-связанный белок 1, methyl-CpG-связанный протеин 2, PTEN, сема-форин 3А, STAT3, Cyclin G1, IGF1R, а также P4HA1, NLRP3 и Bcl-2, что определяет их иммунорегулиру-ющую функцию и ведет к блокированию чрезмерной воспалительной реакции «цитокинового шторма» [7, 1 3]. Таким образом, для получения дополнительных сведений об эффективности ингаляционного метода введения малых внеклеточных везикул пациентам

ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]:

1. Akbari A., Rezaie J. Potential therapeutic application of mesenchymal stem cell-derived exosomes in SARS-CoV-2 pneumonia. Stem Cell Research & Therapy 2020; 11: 356.

2. Alzahrani F., Saadeldin, I., Ahmad A. et al. The Potential Use of Mesenchymal Stem Cells and Their Derived Exosomes as Immunomodulatory Agents for COVID-19 Patients. Stem Cells International 2020; 5: 1-11.

3. Yu B., Zhang X., Li X. Exosomes Derived from Mesenchymal Stem Cells. International Journal of Molecular Sciences 2014; 15(3): 4142-57.

4. Rezakhani L., Kelishadrokhi A., Soleimanizadeh A. et al. Mesenchymal stem cell (MSC)-derived exosomes as a cell-free therapy for Patients Infected with COVID-19: Real Opportunities and Range of Promises. Chemistry and Physics of Lipids 2020; 234: 105009.

5. Khalaj K., Figueira R., Antounians L. et al. Systematic review of extracellular vesicle-based treatments for lung injury: are EVs a potential therapy for COVID-19? Journal of Extracellular Vesicles 2020; 9(1): 1795365.

6. Pinky, Gupta S., Krishnakumar V. et al. Mesenchymal Stem Cell Derived Exosomes: a Nano Platform for Therapeutics and Drg Delivery in Combating COVID-19. Stem cell reviews and reports 2021; 17(1): 33-43.

7. Sengupta V., Sengupta S., Lazo A. et al. Exosomes Derived from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells as Treatment for Severe COVID-19. Stem cells and development 2020; 29(12): 747-54.

8. Kim H., Choi D., Yun S. et al. Proteomic analysis of microvesicles derived from human mesenchymal stem cells. J. Proteome Res. 2012; 11(2): 839-49.

с С0УЮ-19, необходимо провести расширенное исследование с большей группой пациентов с тяжёлым течением заболевания, так как пациенты с С0УЮ-19 со среднетяжёлым течением заболевания хорошо отвечают на проводимую стандартную терапию.

Выводы

Исследование показало безопасность использования ингаляционного метода введения малых внеклеточных везикул пациентам с новой коронавирусной инфекцией С0УЮ-19, осложненной двусторонней пневмонией, со среднетяжёлым течением: на протяжении всего исследования каких-либо серьёзных нежелательных реакций на ингаляцию малых внеклеточных везикул или плацебо выявлено не было. Отмечена хорошая переносимость ингаляций, положительные субъективные ощущения пациентов после процедуры. Все пациенты хорошо ответили на стандартную терапию: через 1 0 сут. после начала лечения нормализовались температура тела и показатели общего и биохимического анализа крови (кроме СРБ в контрольной группе), восстановилась сатурация, была отмечена положительная динамика по данным КТ лёгких, все пациенты выписаны на 15,4 ± 2,3 сут. Через 30 сут. после выписки у каждого второго пациента наблюдались астенические симптомы.

9. Witwer K., Van Balkom B., Bruno S. et al. Defining mesenchymal stromal cell (MSC)-derived small extracellular vesicles for therapeutic applications. J. Extracell. Vesicles 2019; 8(1): 1609206.

10. Brave H., MacLoughlin R. State of The Art Review of Cell Therapy in the Treatment of Lung Disease, and The Potential for Aerosol Delivery. International Journal of Molecular Sciences 2020; 21: 6435.

11. Волчков С.Е., Тюмина О.В. Способ получения и концентрирования микроРНК-содержащих экзосом мультипотентных мезенхимально-стромальных клеток для применения в косметических и лекарственных средствах для стимуляции регенеративных процессов и замедления процессов старения. Патент РФ на изобр. № 2710368. 26 декабря 2019. [Volchkov S.E., Tiumina O.V. Method of producing and concentrating microrna-containing exosomes of multipotent mesenchymal stromalcells for use in cosmetic and medicinal agents for stimulating regenerative processes and slowing down aging processes. Patent of the Russian Federation for invention № 2710368. 26 december 2019].

12. Jayaramayya K., Mahalaxmi I., Subramaniam M. et al. Immunomodulatory effect of mesenchymal stem cells and mesenchymal stem-cell-derived exosomes for COVID-19 treatment. BMB Rep. 2020; 53(8): 400-12.

13. Al-Khawaga S., Essam M. Potential application of mesenchymal stem cells and their exosomes in lung injury: an emerging therapeutic option for COVID-19 patients. Stem cell research & therapy 2020; 11(1): 437-15.