Оценка бактерицидной активности и секреции цитокинов лейкоцитами периферической крови на ранней стадии развития ожоговой болезни Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 616-002-008.953-092

ОЦЕНКА БАКТЕРИЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ И СЕКРЕЦИИ ЦИТОКИНОВ ЛЕЙКОЦИТАМИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ НА РАННЕЙ СТАДИИ РАЗВИТИЯ ОЖОГОВОЙ БОЛЕЗНИ

© 2010 А.Л. Бурмистрова1, Ю.Ю. Филиппова1, М.И. Угнивенко2, Н.Е. Самышкина1,

И. А. Кочергина1, И. А. Скорик2

1 Челябинский государственный университет 2 Городская клиническая больница № 6, Челябинск

Поступила в редакцию 30.09.2010

В работе представлены уровни бактерицидной активности нейтрофилов и секреции некоторых цитоки-нов интактными и стимулированными E. coli нейтрофилами и мононуклеарами периферической крови ожоговых больных на стадии синдрома системного воспалительного ответа (ССВО) с оценкой динамики состояния больных по клиническим данным, тяжести течения ожоговой болезни, наличия осложнений и исхода. Установлено, что на стадии ССВО, маркерами летального исхода пострадавших, отнесенных к тяжелому сепсису, являются: дисрегуляция бактерицидной активности нейтрофилов (преобладание внеклеточного киллинга живых E. coli над внутриклеточным); низкие уровни TNF-a в супер-натантах интактных мононуклеаров при 24-часовой инкубации, INF-y - активированных мононуклеа-ров и IL-10 (вне зависимости от стимуляции) по сравнению практически со всеми группами исследования.

Ключевые слова: ожоги, цитокины, синдром системного воспалительного ответа, сепсис

По данным Всемирной организации здравоохранения термические поражения занимают 3 место среди прочих травм, в России на их долю приходится 10-11%. По длительности и тяжести течения ожоговая болезнь лидирует среди различных травм. Одной из ведущих причин летальных исходов ожоговой болезни является сепсис [2]. Сепсис описан как комплексный клинический синдром, включающий синдром системного воспалительного ответа (ССВО), на фоне которого присоединяется инфекция. Исходом данного синдрома может быть тяжелый сепсис, ассоциированный с органной дисфункцией, и септический шок [3]. Следует отметить, что определенные сложности своевременной постановки диагноза сепсис обусловлены тем, что ССВО, лежащий в основе современной концепции сепсиса, развивается у пострадавших с обширными поражениями кожи уже в ранние периоды ожоговой болезни, когда еще нет клинических признаков инфекционного процесса [4]. При ожоговой травме развитие ССВО связано с громадным поступлением в циркуляцию факторов эндогенной природы (речь, прежде всего, идет о молекулярных сигналах повреждения и гибели клеток -

Бурмистрова Александра Леонидовна, доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой микробиологии и иммунологии. E-mail: burmal@csu.ru

Филиппова Юлия Юрьевна, аспирантка. E-mail: filip-pova_yulia_@mail.ru

Угнивенко Максим Игоревич, заведующий отделением реаниматологии и анестезиологии для ожоговых больных Самышкина Наталья Евгеньевна, кандидат медицинских наук, доцент кафедры микробиологии и иммунологии Кочергина Ирина Александровна, аспирантка Скорик Игорь Александрович, главный врач

damage-associated molecular patterns - DAMPs) при отсутствии экзогенных факторов микробного происхождения [5]. В соответствии с принципами гомеостаза эти молекулы должны быть удалены из организма при минимальной выраженности воспалительного процесса или при отсутствии такового, если порог эндогенных антигенов не превышает определенный уровень [5]. Вследствие этого площадь поражения, глубина поражения, орган-мишень будут во многом определять выраженность воспалительного процесса, его характеристики - «время/порядок» и исход. Хорошо известно, что одним из показательных маркеров выраженности воспалительных реакций и функциональной активности клеток врожденного ответа на развитие стресса, является уровень цитокиновой секреции [7]. Первыми клетками, участвующими в этом процессе являются нейтрофилы, для которых характерен немедленный (в т.ч. фагоцитоз) и ранний индуцированный ответы, каждый из которых инициируется через различные рецепторы, но способен сопровождаться секрецией цитокинов [8]). Согласно современным представлениям [6] первыми клетками, вовлеченными в рекрутирование и активацию других эффекторов, в том числе нейтрофи-лов, являются «ползающие» внутри сосуда (исполняющие функции «иммунных надзирателей») моноциты крови, отвечающие на сигналы стресса продукцией «цитокинов тревоги» - TNF-a, IL-1 и хемокинов. Второй сет ответов моноцитов связан с продукцией и секрецией расширенного ассортимента цитокинов в ходе раннего индуцированного ответа, на фоне менее выраженной, по сравнению с нейтрофилами, фагоцитарной реакции.

1722

В то же время необходимо отметить, что, несмотря на огромное количество исследований, посвященных изучению этиологии, патогенеза и терапии сепсиса, сепсис и ССВО во многих отношениях остаются загадкой. До настоящего времени не ясно, является ли сверхактивация компонентов врожденной иммунной системы, сопровождающаяся «цитокиновым штормом», ответом на тяжелую микробную инфекцию или на выраженное поражение тканей (термическая травма). Почему одни пациенты умирают на ранних стадиях развития сепсиса в период ССВО (3-10 день), а другие - на поздних стадиях, которые ассоциируются не только с противовоспалительным профилем цитокинов, но и с состоянием «иммунного паралича» нейтрофилов в ассоциации со снижением их апоптоза и ответа на сигналы, регулирующие их поступление в ткани [9].

Цель исследования - оценить немедленный (фагоцитоз) и ранний индуцированный (ци-токиносекреция) ответы нейтрофилов и моно-нуклеаров периферической крови на живые клетки E. coli в системе in vitro пациентов с ожоговой травмой на стадии ССВО с целью определения предикторов прогноза развития ожоговой болезни: сепсис - тяжелый сепсис - септический шок и гибель/выздоровление пациентов.

Материалы и методы.

Характеристика обследованных пациентов. Обследовано 33 пациента, находившихся на лечении в отделении реанимации областного ожогового центра им. Р.И. Лившица, г. Челябинска с 2007 по 2009 гг. В исследуемую группу вошли 25 мужчин (76%) и 8 женщин (24%). Средний возраст больных составил 36±2 года (от 15 до 61 года). Наиболее частым повреждающим фактором являлось пламя. Все обследованные имели глубокие комбинированные ожоги II-III-IV степени, площадь поражения кожи составляла от 18 до 50% поверхности тела.

Для интегральной оценки тяжести травмы использовали индекс тяжести термического поражения (ИТТП). В исследование были включены пациенты с ИТТП от 30 до 110 условных единиц. Диагноз ССВО, сепсиса, тяжелого сепсиса и септического шока ставился на основании положений Чикагской согласительной конференции (1992). Все пациенты были взяты в исследование на 3-6 дни ожоговой болезни (после периода ожогового шока) - на стадии развития ССВО.

Для решения поставленной цели все больные были разделены на группы по следующим критериям развития у них ожоговой болезни и ее исхода: ССВО - выздоровели, ССВО - сепсис -выздоровели, ССВО - сепсис - тяжелый сепсис -выздоровели/летальный исход, ССВО - септический шок - летальный исход. 1 группа - ССВО -выздоровели, 5 человек; 2 группа - сепсис - выздоровели, 17 человек; 3 группа - тяжелый сепсис - выздоровели, 4 человека; 4 группа - тяжелый сепсис - летальный исход, 2 человека; 5

группа - септический шок - летальный исход, 3 человека. В качестве контроля была взята кровь 11 практически здоровых доноров.

Методы оценки функциональной активности клеток врожденной иммунной системы. У пострадавших, отнесенных к разным группам (в зависимости от проявлений сепсиса), были определены показатели функциональной активности нейтрофилов и мононуклеаров периферической крови, выделенных на двойном градиенте плотности (фиколл-урографин), отражающие бактерицидную активность в отношении живых клеток E. coli и цитокиносекрецию интактных и активированных бактериями ней-трофилов и мононуклеаров. Бактерицидную активность оценивали по выживаемости живых E. coli при взаимодействии с нейтрофилами периферической крови in vitro, используя метод С. Д. Дугласа и П. Г. Куи [1]. Нейтрофилы выделяли из гепаринизированной периферической крови с использованием двойного градиента

(р=1,077/1,093 г/см3), выход клеток составил 95%. В качестве объекта фагоцитоза применяли E. coli АТСС штамм 25922 (получен из ГИСК им. Л.А. Тарасевича), однодневную культуру, в соотношении: нейтрофил: E. coli - 1:10. В качестве контроля была оценена общая выживаемость E. coli без взаимодействия с нейтрофилами.

Цитокиносекреция - уровень цитокинов: IL-6, TNF-a, IL-8, INF-y, IL-1ß, IL-1Ra («Вектор-Бест», Новосибирск) в супернатантах нейтрофи-лов доноров и ожоговых больных (при стимуляции живыми E.coli и без стимуляции) через 2 и 24 часа культивирования определяли методом твердофазного ИФА. Уровень цитокинов: IL-6, TNF-a, IL-8, INF-y, IL- 1ß, IL-1Ra («Вектор-Бест», Новосибирск) и IL-10 («Biosourse», USA) в супернатантах интактных и активированных живыми E.coli мононуклеаров доноров и ожоговых больных определяли только через 24 часа культивирования. Для оценки статистически значимых различий был проведен многофакторный дисперсионный анализ с использованием пакета прикладных программ «SPSS 18.0». Различия считались статистически значимыми при p<0,05.

Результаты и обсуждение.

Оценка бактерицидной активности ней-трофилов. Первый этап работы заключался в исследовании общей и внутриклеточной выживаемости живых E. coli при взаимодействии с нейтрофилами ожоговых больных на стадии ССВО в системе in vitro (рис. 1). Общую выживаемость живых E. coli при взаимодействии с нейтрофилами периферической крови in vitro оценивали через 2 часа инкубации. Данные свидетельствуют о наличие высокой активности ответа нейтрофилов ожоговых больных на стадии ССВО, в последующем перешедших в стадию тяжелого сепсиса, но с благоприятным исходом -выздоровление (группа 3).

1723

ной и внутриклеточной выживаемости) может свидетельствовать о дисрегуляции сигнальных путей трансдукции, вызванных запороговым сигналом стресса, что приводит к детерминации дегрануляции (внеклеточная выживаемость) над процессом фагоцитоза, включая захват и переваривание живых микробных клеток, либо о переходе части фагоцитов - нейтрофилов в толерантное состояние, т.е. к выходу их из сетевой структуры межклеточных взаимодействий, характерной для функционирования врожденной иммунной системы, и об уклонении части нейтрофилов от функций защиты (см. группу 4). Наши данные согласуются с результатами, полученными Шлык И.В. с соавторами [4] о нарушении поглотительной способности нейтрофилов и снижении числа нейтрофильных гранулоцитов, содержащих дефензины, у ожоговых больных в стадии сепсиса.

Секреция цитокинов. Второй этап работы был связан с оценкой уровня цитокиновой секреции выделенных из периферической крови клеток врожденной иммунной системы - ней-трофилов и мононуклеаров - интактных и активированных живыми E.coli через 2 часа культивировании (только нейтрофилы) и 24 часа (для нейтрофилов и мононуклеаров). При оценке уровня цитокинов в супернатантах (2, 24 часа) нейтрофилов интактных и активированных живыми E.coli были отмечены большие разбросы значений, не зависимо от состояния исследуемого лица - условно здоровый/ожоговая болезнь (что отмечено в инструкции производителя тест-систем). Данный факт не позволяет обсуждать полученные результаты. Уровни цитокинов в супернатантах мононуклеаров (интактных и активированных живыми E.coli), определяли через 24 часа инкубации (табл. 1). Как и при изучении уровня цитокинов в супернатантах культивированных нейтрофилов, при работе с мононуклеа-рами были установлены большие разбросы показателей (что отмечено в инструкции производителя тест-систем).

Таблица 1. Секреция ТОТ-а, ЮТ-у и 1Ь-10 интактными и стимулированными мононуклеарами периферической крови доноров и ожоговых больных

Группы TNF-a пг/мл (24 часа) INF-y пг/мл (24 часа) IL-10 пг/мл (24 часа)

МоИ MQE.coli МоИ МоЕ.тН МоИ МоЕ.тН

доноры 1917±698,2 3131±1607 11,85±5,97 17,54±3,70 41,77±25,03 0,01±0,001

ССВО-выздоровели 2951±1457 2072±580,7 13,6±6,12 9,4±2,18 48,20±22,01 7,94±5,72

сепсис-выздороведи 2115±722,9 8378±1898 9,80±2,35 11,50±2,09 20,50±11,99 18,40±8,68

тяжелый сепсис-выздоровели 3664±2824 5662±3312 13,28±5,75 18,51±3,31 34,18±34,01 30,06±29,17

тяжелый сепсис-летальный исход 160,8±138,0* 1651±1243 21,15±0,19 1,88±0,85* 1,49±1,480 0,21±0,200

септический шок-летальный исход 1593±494,1 4057±3056 2,87±1,49 9,03±5,72 4,35±3,45 12,22±12,20

Примечание: показатели уровней других цитокинов различий не имели. МоИ - интактные мононуклеары, МоЕ.ойИ - мононуклеары, стимулированные живыми E.coli; * - различия между больными, перешедшими в стадию тяжелого сепсиса с летальным исходом и остальными исследуемыми группами (р<0,5); 0 - различия между больными, перешедшими в стадию тяжелого сепсиса с летальным исходом и пациентами групп «ССВО-выздоровели, сеп-сис-выздоровели» (р<0,5)

Рис. 1. Общая выживаемость E.coli при взаимодействии с нейтрофилами доноров и ожоговых больных in vitro (х 103 КОЕ/мл)

Рис. 2. Внутриклеточная выживаемость E.coli при взаимодействии с нейтрофилами доноров и ожоговых больных in vitro (х 103 КОЕ/мл)

Примечание: 0 - доноры; 1 - ССВО - выздоровели; 2 -сепсис - выздоровели; 3 - тяжелый сепсис - выздоровели; 4 - тяжелый сепсис - летальный исход; 5 - септический шок - летальный исход; * - различия между донорами и больными (р<0,5); 0 - различия между больными, выздоровевшими после тяжелого сепсиса и пациентами, выздоровевшими после ССВО, сепсиса и пациентами с тяжелым сепсисом с летальным исходом (р<0,5)

Внутриклеточная выживаемость E. coli в нейтрофилах периферической крови на стадии ССВО у 1, 2, 3, 4 и 5 групп ожоговых больных недостоверно снижена по сравнению с группой доноров (рис. 2). Значимые различия наблюдались только в 4 и 5 группах (т.е. в группах с летальным исходом). Диссонанс данных по внеклеточной и внутриклеточной выживаемости живых E.coli в этих группах (соотношение внеклеточ-

1724

Тем не менее, обращает внимание факт наличия у больных 4 группы (ССВО - тяжелый сепсис, имеющих в последующем неблагоприятный исход - летальный) достоверно низких уровней ТОТ-а в супернатантах интактных мо-нонуклеаров и ЮТ-у- активированных мононук-леаров по сравнению со всеми группами исследования. Кроме того, на стадии ССВО у пострадавших, отнесенных к тяжелому сепсису с летальным исходом (группа 4), наблюдается достоверное снижение уровня 1Ь-10 (вне зависимости от стимуляции) в супернатантах мононуклеаров по сравнению с аналогичными показателями в группах пациентов «ССВО - выздоровели» и «сепсис - выздоровели».

Выводы: наиболее информативными иммунологическими маркерами воспаления, которые можно использовать в прогнозе развития и исхода ожоговой болезни на стадии ССВО являются:

1. дисрегуляция бактерицидной активности нейтрофилов: преобладание внеклеточного кил-линга живых бактерий Е.еоН над внутриклеточным;

2. низкие уровни цитокинов на стадии ССВО у пострадавших, отнесенных к тяжелому сепсису с летальным исходом: ТОТ-а в супернатантах интактных мононуклеаров при 24-часовой инкубации, ЮТ-у - активированных мононуклеаров и 1Ь-10 (вне зависимости от стимуляции) по сравнению практически со всеми группами исследования.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Дуглас, С.Д. «Исследование фагоцитоза в клинической практике» Пер. с англ. / С.Д. Дуглас, П.Г. Куиг. - М.: Медицина, 1983. С. 92-96.

2. Тарасов, А.Е. Иммунологические аспекты ожоговой болезни в клинике и эксперименте - Автрореф. дис. канд. мед. наук. М., 2008. 40 с.

3. Черешнев, В.А. Системное воспаление как иммуно-патобиологический феномен / В.А. Черешнев, Е.Ю. Гусев // Цитокины и воспаление. 2002. Т. 1, № 2. C. 17.

4. Шлык, И.В. Ожоговый сепсис: особенности развития и ранней диагностики / И.В. Шлык, Ю.С. Полу-шин // Вестник анестезиологии и реаниматологии. 2009. Т.6, №5. С.16-24.

5. Bianchi, M. DAMPs, PAMPs and alarmins: all we need to know about danger // Journal of Leuk. Biol. 2007. V. 81. P. 1-5.

6. Rickey, M. Intravascular immunity: the host-pathogen encounter in blood vessels / M. Rickey, P. Kubes // Nature Reviews Immunology. 2009. V. 9. P. 364-375.

7. Rotchkiss, R. The pathophysiology and treatment of sepsis / R. Rotchkiss, I. Karl // The new England journal of Medicine. 2003. V. 9. P. 138-150.

8. Nathan, С. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities // Nature Reviews Immunology. 2006. V. 6. P. 173-182.

9. Rittirsch, D. Harmful molecular mechanisms in sepsis / D. Rittirsch, M. Flierrl, P. Ward // Nature Reviews Immunology. 2008. V. 8. P. 776-787.

ESTIMATION OF BACTERICIDAL ACTIVITY AND CYTOKINES SECRETION BY LEUCOCYTES OF THE PERIPHERIC BLOOD AT EARLY STAGE OF DEVELOPMENT OF THE BURN DISEASE

© 2010 A.L. Burmistrova1, Yu.Yu. Filippova1, M.I. Ugnivenko2, N.E. Samyshkina1,

I.A. Kochergina1, I.A. Skorik2

1 Chelyabinsk State university 2 City Hospital N6, Chelyabinsk

In work are presented the levels of bactericidal activity of neutrophils and secretion of some intact cytokines and stimulated of E. coli by neutrophils and mononuclears of peripheric blood of burn patients at a stage of systemic inflammatory response (SIRS) syndrome with an estimation of dynamics of patients condition on clinical data, gravity of burn disease current, presence of complications and outcome. It is established, that at SIRS stage markers of lethal outcome of the victims, carried to serious sepsis, are: dysregulation of bactericidal activity of neutrophils (prevalence extracellular killing of alive E. coli above intracellular); low levels TNF-a in supernatants of intact mononyclears at 24-hour incubation, INF--activated mononuclears and IL-10 (without dependence from stimulation) in comparison practically with all groups of research.

Key words: burns, cytokines, systemic inflammatory response syndrome, sepsis

Alexandra Burmistrova, Doctor of Medicine, Professor, Head of the Department

of Microbiology and Immunology. E-mail: burmal@csu.ru

Yuliya Filippova, Post-graduate Student. E-mail: filippova_yulia_@mail.ru

Maxim Ugnivenko, Chief of Reanimatology and Anesthesiology Unit for Burn Patients

Nataliya Samyshkina, Candidate of Biology, Associate Professor at the Department

of Microbiology and Immunology

Irina Kochergina, Post-graduate Student

Igor Skorik, Head Physician

1725