CC BY
52
УДК . 577.151:579.864.1
ОЦІНЮВАННЯ АВТОІМУННОГО ТА ДНК-УШКОДЖУВАЛЬНОГО ВПЛИВУ НАНОЧАСТИНОК ЗОЛОТА
1Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ
2Інститут біоколоїдної хімії ім. Ф. Д. Овчаренка НАН України, Київ
3Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кавецького НАН України, Київ
4ДУ «Інститут медицини праці» НАМН України, Київ
Е-mail: tgruzina@mail.ru
Отримано 30.09.2011
Методом хімічної конденсації синтезовано водні дисперсії наночастинок золота середніх розмірів — 7, 17 та 57 нм. Шляхом визначення титру автоантитіл проти дефенсину (mBD-2), шапероніну Hsp60 та серцевого міозину (Myo) досліджено характер автоімунної відповіді організму експериментальних тварин, індукованої інтраперитонеальним уведенням наночастинок золота.
В експериментах in vitro та in vivo виявлено ДНК-ушкоджувальну дію наночастинок золота розміром 7 та 17 нм і відсутність такої під впливом наночастинок розміром 57 нм.
За показниками індукції автоімунної відповіді організму та ДНК-ушкоджувального впливу на тканини лабораторних тварин наночастинками золота різного розміру зроблено висновок, що частинки розміром 57 нм є найбільш перспективними для застосування у технологіях створення засобів діагностики і терапії патологій серцево-судинної системи.
Ключові слова: наночастинки золота, автоантитіла, дефенсин, шаперонін Hsp60, міозин, імунна відповідь, ДНК-ушкоджувальна дія.
B. І. Бобик1
Л. М. Капустян1 Л. М. Морозова1 П. В. Погрібний3
C. М. Дибкова2 Л. С. Рєзніченко2 Т. Г. Грузіна2
З. Р. Ульберг2 В. Ф. Коваленко4 Л. Л. Сидорик1
З огляду на бурхливий розвиток наноме-дицини проблема застосування наночастинок металів як субстанцій нових високоефективних засобів діагностичної та цільової терапії є досить актуальною.
Найбільш перспективними у цьому сенсі є наночастинки золота ^КР). Так, показано ви со ку ефек тивність ви ко рис тан ня їх як контрастних агентів у магнітно-резонансній та рентгенівській комп’ютерній томографії [1, 2], фототермальній терапії онкологічних захворювань [3, 4], а також як векторів цільового доставлення лікарських препаратів, передусім протипухлинних [5-7].
Меншою мірою це торкнулося діагностики та терапії серцево-судинних захворювань, серед яких серцева недостатність вважається однією з найважливіших проблем. Проте активні дослідження, здійснювані у цьому напрямі, свідчать про значні перспек-ти ви ви ко рис тан ня на но час ти нок зо ло та у кардіології [8-10].
Враховуючи вищезазначене, дослідження біологічної дії, зок ре ма вив чен ня ав то -імун но го по тенціалу та мож ли вості кардіо -тропного або кардіотоксичного впливу GNP, є надзвичайно важливим і необхідним для біобез печ но го зас то су ван ня їх у кардіології.
Ме тою ро бо ти бу ло оціни ти ав тоімун ний та ДНК-ушкоджувальний вплив наночастинок золота різного розміру для визначення перспектив їх застосування у кардіології.
Матеріали і методи
Дослідження проводили на мишах-сам-цях лінії ВаІЬ/С віварію Інституту молекулярної біології і генетики НАН України. Усі тварини віком 2-2,5 міс мали масу 18-23 г. Досліджен ня на тва ри нах ви ко ну ва ли згідно з правилами, прийнятими Етичним комітетом ІМБіГ НАНУ. У роботі викорис-то ву ва ли син те зо вані в Інсти туті біоко -лоїдної хімії ім. Ф. Д. Овчаренка НАН
України препарати сферичних наночастинок золота середнього розміру 7, 17 та 57 нм (GNP-1, GNP-2 і GNP-3, відповідно). Розмір та форму наночастинок визначали методами трансмісійної елект рон ної мікрос копії (JEM-1230, JEOL, Японія) та лазерно-кореляційної спектрометрії (Zetasizer-3, Malvern Instruments Ltd, Ве ли коб ри танія).
Препарати наночастинок вводили інтра-перитонеально в 0,5 мл фізіологічного роз-чи ну згідно з про то ко лом індукції міокар ди -топодібної патології [11]. Титр антитіл про ти про теїнів сер це во го міози ну інтакт -них мишей (Myo), як загальноприйнятого мар ке ра роз вит ку міокар ди ту, ан ти ст ресо -во го про теїну Hsp60 і де фен си ну ми шей (mBD-2) у сироватці крові піддослідних тварин визначали на 14-ту, 28-му і 40-ву добу з мо мен ту ос тан нь о го вве ден ня пре па ратів на ноч ас ти нок зо ло та за до по мо гою твер до -фаз но го іму но ен зим но го аналізу (ELISA) з модифікаціями [12]. Контролем слугували миші того самого віку, яким уводили тільки фізіологічний розчин (контроль на стрес).
Ан ти ге ни (на тив ний міозин із сер ця інтактних мишей лінії Balb/c, рекомбінант-ний мо ле ку ляр ний ша пе рон/ша пе ронін Hsp60 і ре комбінант ний бе та-де фен син ми -шей mBD-2) отримували згідно з методиками [13, 14] відповідно.
Застосовували такі модифікації методу ELISA. Антиген (10 мкг/мл) упродовж ночі інку бу ва ли в лун ках полісти роль но го 96-лункового планшета при 4 °С. У контрольні лунки вносили розчин BSA (10 мкг/мл). Для за побіган ня нес пе цифічно му зв’язуванню протеїнів сироватки крові з ад-сор бо ва ним про теїном та плас ти ком ви ко -ристовували розчин PBS з 0,1%-м твін-20 (PBS-т). Сироватки крові експериментальних мишей вносили у лунки планшета з ад-сор бо ва ним ан ти ге ном (у двох пов то рах) та інкубували протягом 1,5 год при 37 °С та 18 год при 4 °С. Зв’язування специфічних авто-ан титіл з від по відним ан ти ге ном де тек ту ва -ли за до по мо гою вто рин них ан титіл кро ля проти IgG миші, мічених пероксидазою хрону (Promega, США). Для візуалізації результатів реакції використовували субстрат для пероксидази хрону АВТС (Sigma, США) у концентрації 0,5 мкг/мл у 50 мM цитратно-го буфера, рН 5,0 з 0,05% -м концентрованим пе рок си дом вод ню, оп тич ну гус ти ну вимірювали за довжини хвилі 405 нм на спект ро фо то метрі Multiscan (Titertek, Ве ли -кобританія). Визначали середнє значення оптичної густини двох повторів кожної сироватки (за умови, якщо відмінність між
повторами не перевищувала 15%). Ан-титілопозитивною вважали сироватку, оптична густина якої у розведенні 1:100 перевищувала середнє значення оптичної густини сироваток інтактних мишей (за того са мо го роз ве ден ня) на два стан да рт них відхилен ня (m+2sd). Усі дослі джу вані си ро -ватки було перевірено на наявність специфічних автоантитіл одночасно.
Статистичну обробку результатів досліджень здійсню ва ли за до по мо гою па ке та програм STATISTICA 6.0 (Stat-Soft, 2001, США). Результати подано у вигляді середніх значень (m) із вказівкою на стандартне відхилення (sd). Для порівняння середніх значень досліджуваних груп використовували U-кри-терій Mанна-Уїтні (Mann-Whitney U-test).
ДНК-уш код жу валь ну дію пре па ратів на -ночастинок визначали in vitro з використанням куль ту ри тес то вих ев каріотич них клітин яєчни ка ки тайсь ко го хом’яка лінії СНЮ-К1 та in vivo на 14-ту добу з моменту введення препаратів піддослідним тваринам, як описано в [15, 16]. Позитивним контролем слугували клітини СНЮ-К1, оброблені N-нітрозометилсечовиною в концентрації 1 мM протягом 24 год. Як негативний контроль використовували клітини СНЮ-К! у розчині ДMСO.
ДНК-уш код жу валь ний вплив на но час -тинок золота in vivo визначали на органних клітинах, виділених із печінки, нирок, селезінки, головного мозку, серця та легенів експериментальних тварин згідно з [16, 17].
Mікроскопію мікропрепаратів здійснювали за допомогою флуоресцентного мікроскопа (ЛЮMАM Р8, Росія) з використанням фільт ра збуд жен ня 490 нм, дих роїчно го дзеркала 510, відтинаючого фільтра 530 нм. Збільшення — x 200-400. На кожен мікро-препарат аналізували не менш ніж 100 «ДНК-комет» без накладень «хвостів». В аналізі не враховували апоптичні клітини, які виявлялися на мікропрепаратах у вигляді «ДНК-комет» з широким дифузним «хвостом» і практично відсутньою «головою», — так звані «їжачки».
Аналіз «ДНК-комет» проводили як візуально, так і шляхом комп’ютерної обробки цифрових зображень за допомогою програми COMET-CASP. При цьому визначали такі па ра мет ри «ко мет»: індекс «ДНК-ко мет» (ідНК), «довжина хвоста», «% ДНК у хвості», «момент хвоста».
Здійсню ючи візу аль ний аналіз,
«ДНК-комети» розподіляли на п’ять умовних типів із відповідним для кожного числовим значенням від 0 до 4. Ступінь ушкодження ДНК при цьому виражали як індекс
«ДНК -комет» (ідК), який обчислювали за формулою:
ідк (0n0 + 1n1 + 2n2 + 3n3 + 4n4)/L,
де n0 - n4 — чис ло «ДНК -ко мет» кож но го типу, S — сума «ДНК-комет».
Статистичну обробку результатів проводи ли за кож ною екс пе ри мен таль ною точ кою, порівнюючи показники ушкодження ДНК в дослідних та контрольних групах. Критерієм позитивного результату слугував статистично достовірний відтворюваний ефект.
Ре зуль та ти та об го во рен ня
На но час тин ки зо ло та здатні до ак тив ної взаємодії з мо тор ни ми про теїна ми [18], інтен сифікації про це су транс фор мації енергії [19] та прояву шапероноподібної дії [20]. То му зас то су ван ня на но час ти нок зо ло -та у діагностиці й терапії патологій різного ґенезу, в тому числі серцево-судинної системи, потребує докладного вивчення молекулярних механізмів їхнього впливу на організм.
Ро зуміння цих про цесів, особ ли во за -лежності їх від природи, способу синтезу, роз міру та інших фізи ко-хімічних ха рак те -рис тик на но час ти нок, не тіль ки відкри ває мож ли вості для всебічно го оціню ван ня по -тенційних ризиків застосування наномате-ріалів, але й дає змогу створювати принципово нові унікальні технології спрямованого впливу на патологічні процеси на молекулярному рівні.
Препарати наночастинок золота середніх розмірів 7, 17 та 57 нм, використані для досліджень, бу ли син те зо вані ме то дом хіміч ної конденсації. На відміну від багатьох фізичних ме тодів, цей спосіб син те зу доз во ляє от ри му -вати монодисперсні за розміром біосумісні препарати наночастинок золота у водному розчині. На рис. 1 наведено дані лазерно-кореляційної спектрометрії та трансмісійної електронної мікроскопії для наночастинок золота середнього розміру 17 нм.
З метою визначення перспектив використання синтезованих наночастинок золота у розробленні засобів діагностики і терапії патологій серцево-судинної системи оцінювали характер їхнього впливу на організм модельних тварин за змінами у сироватці крові рівня ав то ан титіл про ти де фен си ну, ан ти ст ре со во го про теїну (ша пе роніну) Hsp60 та серцевого міозину, а також за показ ни ка ми ДНК-уш код жу валь ної дії на клітини потенційних органів-мішеней.
Так, отримані дані засвідчили, що титр ан титіл про ти де фен си ну ми шей mBD-2 в си -
А Б
Рис. 1. Розподіл за гідродинамічним діаметром (А) та електронно-мікроскопічне зображення (Б) наночастинок золота середнього розміру 17 нм
роватці крові піддослідних тварин, визначений на 14-ту, 28-му і 40-ву добу після остан-нь о го вве ден ня пре па ратів на но час ти нок золота, не змінювався під впливом наночас-тинок золота середнього розміру 7 та 17 нм (рис. 2, криві mBD-2-GNP-1 та mBD-2-GNP-2, відповідно), порівняно з контрольними значеннями.
Нез нач не підви щен ня тит ру ан титіл до де фен си ну спос теріга лось на 28-му до бу після останнього введення препарату лише під впли вом на но части нок се реднь о го розміру 57 нм (крива mBD-2-GNP-3).
Визначення рівня автоантитіл проти анти ст ре со во го про теїну Hsp60 ви я ви ло ти по -вий характер імунної відповіді під впливом наночастинок золота розміром 7 нм (рис. 3, крива Hsp60-GNP-1).
Рис. 2. Рівень ав то ан титіл про ти де фен си ну (mBD-2), визначений у сироватці крові мишей після введення препаратів наночастинок золота середнього розміру 7 нм (mBD-2-GNP-1), 17 нм (mBD-2-GNP-2) та 57 нм (mBD-2-GNP-3).
Як контрольний антиген використовували бичачий сироватковий альбумін (BSA-GNP-1, BSA-GNP-2, BSA-GNP-3)
Рис. 3. Рівень ав то ан титіл про ти Hsp60, виз на че ний у си ро ватці крові ми шей після введення препаратів наночастинок золота
середнього розміру 7 нм (Hsp60-GNP-1),
17 нм (Hsp60-GNP-2) та 57 нм (Hsp60-GNP-3). Як контрольний антиген використовували бичачий сироватковий альбумін (BSA-GNP-1, BSA-GNP-2, BSA-GNP-3)
Під впливом наночастинок розміром 17 нм спос теріга ло ся змен шен ня тит ру ав то ан -титіл проти Hsp60 на 14-ту добу майже до рівня конт ро лю з по даль шим підви щен ням до по чат ко во го рівня на 28-му до бу екс пе ри -менту та зменшенням на 40-ву добу знову до рівня контрольної реакції на BSA (рис. 3, кри ва Hsp60-GNP-2).
Найбільш виражені зміни з часом у титрі автоантитіл проти Hsp60 фіксували за дії на но час ти нок се реднь о го розміру 57 нм (рис. 3, крива Hsp60-GNP-3). Лаг-фаза утво-рен ня досліджу ва них ав то ан титіл під впли -вом наночастинок цього розміру становила 14 діб, після чого кількість антитіл досягала максимуму на 28-му добу і залишалась майже на цьому рівні на 40-ву добу після останнього введення препарату наночастинок.
Титр ав то ан титіл про ти сер це во го міози -ну під впли вом на но час ти нок зо ло та се -реднього розміру 7 нм (рис. 4, крива Myo-GNP-1), як і в разі характеру зміни рівня ав то ан титіл про ти ан ти ст ре со во го про -теїну Hsp60 (рис. 3, крива Hsp60-GNP-1), ха рак те ри зу вав ся ти по вою кри вою імун ної відповіді.
Проте, на відміну від рівня антитіл до Hsp60, максимальну кількість анти-Myo-ав-тоантитіл реєстрували у сироватці крові на 28-му до бу після ос тан нь о го вве ден ня пре па -рату наночастинок GNP-1.
Під впливом наночастинок розміром 17 нм (препарат GNP-2) вміст анти-Myo-автоан-титіл на 40-ву до бу після ос тан нь о го вве ден -ня наночастинок знижувався до рівня контрольних значень (рис. 4, крива Myo-GNP-2).
Рис. 4. Рівень ав то ан титіл до сер це во го міози ну (Myo), визначений у сироватці крові мишей після введення препаратів наночастинок золота середнього розміру 7 нм (Myo-GNP-1), 17 нм (Myo-GNP-2) та 57 нм (Myo-GNP-3).
Як контрольний антиген використовували бичачий сироватковий альбумін (BSA-GNP-1, BSA-GNP-2, BSA-GNP-3)
Продукція анти-Myo-автоантитіл під впливом наночастинок розміром 57 нм характеризувалась двома фазами, які за характером імунної відповіді схожі з картиною первинно го та вто рин ного імун но го відгу ку (рис. 4, кри ва Myo-GNP-3). Дру гу фа зу підви щен ня продукції рівня анти-Myo-автоантитіл можна пов’язати з індукцією і прогресією автоімунної відповіді у піддослідних тварин, імунізованих препаратом наночастинок середнього розміру 57 нм (GNP-3).
Таким чином, імунізація піддослідних тварин наночастинками золота розміром 7 та 17нм призводила до типової імунної відповіді. Наприкінці експерименту рівень досліджених автоантитіл досягав рівня вихідних або контрольних величин. Унаслідок впливу наночастинок золота середнього розміру 57 нм спостерігалось підвищення рівня продукування автоантитіл проти антистресового протеїну Hsp60 та серцевого міозину поряд із відсутністю виражених змін титру автоантитіл проти дефенсину протягом усього експерименту.
Досліджен ня ДНК-уш код жу валь но го
впливу наночастинок золота середніх розмірів 7, 17 та 57 нм, виконані методом лужного гель-електрофорезу ізольованих евкаріотич-них клітин in vitro, про де мо н стру ва ли таке.
У зразках евкаріотичних клітин лінії СНO-К1, оброблених наночастинками золота дискретних розмірів 7 та 17 нм, було зафік-со ва но пер винні уш код жен ня ДНК. На рис. 5 подано електрофоретичні зображення типу «ДНК-комет», що характеризують первинні уш код жен ня ДНК під впли вом ви ще -згаданих наночастинок.
А Б
Рис. 5. Електрофоретичні зображення («ДНК-комети») ушкодженої ДНК евкаріотичних клітин лінії СНО-К1 унаслідок впливу на но час ти нок зо ло та розміром ~7 нм (А) та ~17 нм (Б)
Виходячи з даних табл. 1, показники ушкодження ДНК евкаріотичних клітин СНO-K1 («індекс ДНК-комет», ідк) під впливом ви -вчених наночастинок золота розміром 7 та 17 нм сягають значень, близьких до ІдК пози тив но го конт ро лю.
Досліджен ня in vitro ДНК-уш код жу -вального впливу наночастинок золота розміром 57 нм показали відсутність такої власти вості у цих на но час ти нок, оскіль ки в зразках евкаріотичних клітин лінії СНO-K1 первинних ушкоджень ДНК не фіксували. На рис. 6 наведено електрофоретичне зобра-жен ня неуш код же ної ДНК клітин лінії СНO-K1 під впливом наночастинок розміром 57 нм. Індекс ДНК-комет при цьому сягав значень ідк негативного контролю.
Аналізуючи вищенаведені експериментальні дані що до ДНК-уш код жу валь но го впливу наночастинок золота стосовно евкаріотичних клітин лінії GKO-K^ можна зробити висновок про наявність залежності такої дії
Таблиця 1. Оцінювання ДНК-ушкоджувального впливу наночастинок золота in vitro
Зразки евкаріотичних клітин Індекс ДНК-комет (ІДК)
Негативний контроль 0,02±0,001
Позитивний контроль 3,9±0,05
Oброблені наночастинками золота ~ 7 нм 2,3±0,02
Oброблені наночастинками золота ~ 17 нм 2,2±0,06
Oброблені наночастинками золота ~ 57 нм 0,02±0,001
Рис. 6. Електрофоретична картина неушкодже-ної ДНК евкаріотичних клітин лінії СНО-К1 наночастинками золота розміром 57 нм
від їхнь о го розміру. Так, екс пе ри мен та ми in vitro продемонстровано наявність ДНК-уш-код жу валь них влас ти вос тей на но час ти нок золота розміром 7 та 17 нм та відсутність їх для наночастинок золота розміром 57 нм. ДНК-ушкоджувальна дія наночастинок золота розміром 7 та 17 нм ймовірно зумовлена їхньою здатністю проникати через пори ядерної мембрани і спричиняти первинні ушкодження ДНК у вигляді однонитчастих розривів.
ДНК-ушкоджувальний вплив наночастинок золота середніх розмірів 7, 17 та 57 нм було досліджено методом лужного гель-елект-ро фо ре зу і в екс пе ри мен тах in vivo на ізольованих клітинах органів-мішеней лабораторних мишей. При цьому показано, що наночастинки золота розміром 57 нм, за умов їх інтраперитонеального введення, не виявляли ДНК-ушкоджувальної дії на клітини голов но го моз ку, ле гень, ни рок, печінки, се -лезінки та серця. Так, показники ушкоджень ДНК « ідк» перебували на рівні аналогічних показників негативного контролю (табл. 2). При цьому електрофоретичні зображення типу «ДНК-комет» були відсутні.
Щодо ДНК-ушкоджувального впливу наночастинок золота середнього розміру 7 нм слід зазначити, що показники ушкоджень ДНК в головному мозку, легенях, нирках та печінці були в 2-6 разів вищі за аналогічні показ ни ки в кліти нах ор ганів ми шей конт роль -ної групи. ІДК клітин серця мишей, яким уводили наночастинки золота 7 нм, був на рівні негативного контролю, а ІдК клітин селезінки такої дослідної групи перевищував ІдК контрольної групи в 9 разів. Таким чином, наночас тин ки зо ло та розміром 7 нм ви яв ля ли ДНК-ушкоджувальні властивості in vivo.
Під впливом наночастинок розміром 17 нм у клітинах головного мозку, легень, нирок та печінки тварин дослідної групи показники ушкоджень ДНК перевищували значення показників контрольної групи в 6, 5, 9 та 4 рази відповідно (табл. 2). ІдК клітин серця тварин, яким уводили наночастинки золота розміром 17 нм, перевищував ІдК контрольної групи в 25 разів, а ІДК клітин селезінки — у 85 разів. Таким чином, наночастинки золота 17 нм виявляли виражену ДНК-ушкоджувальну дію in vivo.
Oтримані результати дозволяють стверджувати, що за дослідженими показниками ав тоімун но го та ДНК-уш код жу валь но го впливу серед вивчених наночастинок золота, отриманих методом хімічної конденсації, наночастинки розміром 57 нм є найбільш перспективними для застосування у технологіях створення засобів діагностики і терапії пато-логій сер це во-су дин ної сис те ми.
Таблиця 2. Оцінювання ДНК-ушкоджувального впливу наночастинок золота in vivo
Групи тварин Показник ДНК-ушкоджувальної дії в органах мишей (ідК)
головний мозок легені нирки селезінка серце печінка
Перша (уведено наночастинки золота ~7 нм) 0,011±0,005 0,034±0,006 0,045±0,005 0,132±0,01 0,050±0,001 0,015±0,004
Друга (уведено наночастинки золота ~17 нм) 0,030±0,001 0,025±0,001 0,115±0,01 1,275±0,5 0,125±0,02 0,024±0,001
Третя (уведено наночастинки золота ~57 нм) 0,007±0,001 0,005±0,007 0,017±0,004 0,020±0,002 0,005±0,005 0,007±0,006
Контрольна(без уведення наночастинок золота) 0,005±0,001 0,005±0,001 0,015±0,005 0,015±0,005 0,005±0,001 0,005±0,001
Виявлені особливості характеру імунної відповіді організму на присутність наночастинок золота різного розміру свідчать про необхідність подальших досліджень моле-куляр них ме ханізмів їх впли ву.
Автори висловлюють вдячність співробітникам Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Ка-
ЛІТЕРАТУРА
1. Hainfeld J. F., Slatkin D. N., Focella T. M. Gold nanoparticles: a new X-ray contrast agent // Br. J. Radiol. — 2006. — N 79. — P. 248-253.
2. Xu C., Tung G. A., Sun S. Size- and concentration effect of gold nanoparticles on X-ray atenuation as measured on computed tomography // Chem. Mater. — 2008. — V. 20, N 13. — P. 4167-4169.
3. Letfullin R. R., Joenathan C., George T. F. Laser-induced explosion of gold nanoparticles: potential role for nanophotothermolysis of cancer // Nanomedicine. — 2006. — V. 1, N 4. — P. 473-480.
4. Pissuwan D., Valenzuela S. M., Cortie M. B. Therapeutic possibilities of plasmonically heated gold nanoparticles // Trends Biotechnol. — 2006. — V. 24, N 2. — P. 62-67.
5. Paciotti G. F., Myer L., Weinreich D. Colloidal gold: novel nanoparticle vector for tumor directed drug delivery // Drug Deliv. — 2004. — V. 11, N 3. — P. 169-183.
6. Fu W., Shenoy D., Li J. Hetero-bifunctional poly(ethylene glycol) modified gold nanoparticles as an intracellular tracking and delivery agent // NSTI-Nanotech. — 2005. — V. 1. — P. 324-327.
7. Cai W., Gao T., Hong H. Application of gold nanoparticles in cancer nanotechnology // J. Nanotech. Sci. Appl. — 2008. — N 1. — P. 17-32.
8. Weakley S. M., Wang X., Mu H. Ginkgolide A-gold nanoparticles inhibit vascular smooth muscle proliferation and migration in vitro and reduce neointimal hyperplasia in a mouse model // J. Surgical Research. — 2011. — doi:10.1016/j.jss.2011.03.018.
вецького НАН України к.б.н. Солдаткіній M. O. та к.б.н. Журавель O. К. за наданий препарат мишачого бета-дефенсину mBD-2.
Ро бо ту ви ко на но за фінан со вої підтрим ки Ціль о вої комп ле кс ної прог ра ми фун да мен -тальних досліджень НАН України «Фунда-мен тальні проб ле ми на но ст рук тур них сис -тем, наноматеріалів, нанотехнологій».
9. Guo Z. R., Gu C. R., Fan X. Fabrication of anti-human cardiac troponin I immunogold nanorods for sensing acute myocardial damage // Nanoscale Res. Lett. — 2009. — N 4. — P. 1428-1433.
10. Cormode D. P., Roessl E., Thran A Atherosclerotic Plaque Composition: Analysis with Multicolor CT and Targeted Gold Nanoparticles // Radiology. — 2010. — N 256. — P. 774-782.
11. Smith S. C., Allen P. M. Myosin-induced Acute Myocarditis is a T-Cell-Mediated Disease // J. Immunol. — 1991. — V. 147, N 7. — P. 2141- 2147.
12. Terminck T., Bleux C., Gregoin J. Comparison between autoantibodies arising during Trypanosoma cruzi infection in mice and natural autoantibodies // Ibid. — 1990. — V. 144. — P. 1504-1511.
13. Капустян Л. Н., Киямова Р. Г., Гришкова В. С. и др. Получение рекомбинантного GroEL и его иммунологическая кросс-реактивность с Hsp60 // Біополімери та клітина. — 2006 — Т. 22, № 2. — С. 17-120.
14. Margossian S. Reversible dissotiation of dog cardiac myosin regulatory light chain 2 and its influence on ATP hydrolysis // J. Biol. Chem. — 1985. — V. 260. — P. 13747-13754.
15. Methods in Molecular Biology. In Situ Detection of DNA Damage. Methods and protocols / Edit. by V. Didenko. — Humana Press, 2002. — 279 р.
16. Методичні рекомендації «Юцінка біобезпеки наноматеріалів органічної та неорганічної природи методом визначення генотоксичного впли ву луж ним гель-елект ро фо ре зом
ізольованих еукаріотичних клітин», затверджені Державним науково-контрольним інститутом біотехнології і штамів мікроорганізмів Mіністерства аграрної політики України та Державним комітетом ветеринарної медицини України (Постанова № 661 від 14.
05. 2009 та Постанова № 1 від 23-24 грудня 2009 р.).
17. Пат. на корисну модель МПК (2009) G01N33/00 G01N33/48. Спосіб оцінки гено-токсичних властивостей наноматеріалів / С. M. Дибкова, O. В. Годовський, M. Є. Ро-манько, Т. Г. Грузіна, З. Р. Ульберг, В. O. Ушкалов, А. M. Головко. — Заявл. 10.09.2009;
ОЦЕНКА АУТОИММУННОГО И ДНК-ПОВРЕЖДАЮЩЕГО ВЛИЯНИЯ НАНОЧАСТИЦ ЗОЛОТА
В. И. Бобик1, Л. Н. Капустян1, Л. М. Морозова1, П. В. Погребной3, С. Н. Дыбкова2,
Л. С. Резниченко2, Т. Г. Грузина2,
З. Р. Ульберг2, В. Ф. Коваленко4, Л. Л. Сидорик1
1Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев 2Институт биоколлоидной химии им. Ф. Д. Овчаренко НАН Украины, Киев 3Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р. Е. Кавецкого НАН Украины, Киев 4ГУ «Институт медицины труда»
НАМН Украины, Киев
E-mail: tgruzina@mail.ru
Методом химической конденсации синтезированы водные дисперсии наночастиц золота средних размеров 7, 17 и 57 нм. Путем определения титра аутоантител против дефенсина (mBD-2), шаперонина Hsp60 и сердечного миозина (Myo) исследован характер аутоиммунного ответа организма экспериментальных животных, индуцированного интраперитонеальным введением наночастиц золота. В экспериментах in vitro и in vivo выявлено повреждение ДНК наночастицами золота размером 7 и 17 нм и отсутствие ДНК-повреждающего действия под влия-ни ем на но час тиц раз ме ром 57 нм.
На основании показателей аутоиммунного ответа организма и ДНК-повреждающего влияния на ткани лабораторных животных наночастиц золота разного размера сделан вывод, что частицы размером 57 нм являются наиболее перс пек тив ны ми для ис поль зо ва ния в тех но ло -гиях создания средств диагностики и терапии патологий сердечно-сосудистой системы.
Ключевые слова: наночастицы золота, аутоантитела, дефенсин, шаперонин Hsp60, миозин, иммунный ответ, повреждение ДНК.
Oпубл. 25.03. 2010, Бюл. № 6. — 4 с.
18. Kaur H., Chaudhary А., Kaur I. et al. Transportation of drug-gold nanocomposites by actinomyosin motor system // J. Nanopart. Res. — 2011. — V. 13. — P. 2295-2303.
19. Ульберг З. Р., Грузіна Т. Г., Дибкова С. М., Рєзніченко Л. С. Біобезпечні наночастинки металів в наномедицині та нанобіотехно-логії // Вісн. пробл. біол. мед. — 2010. — № 4. — С. 72-77.
20. Fei L., Perrett S. Effect of nanoparticles on protein folding and fibrillogenesis // Int. J. Mol. Sci. — 2009. — V. 10. — P. 646-655.
ESTIMATION OF AUTOIMMUNE AND DNA-DAMAGE INFLUENCE OF GOLD NANOPARTICLES
V. I. Bobyk1, L. M. Kapustyan1, L. M. Morozova1, P. V. Pogribny3, S. M. Dybkova2,
L. S. Rieznichenko2, T. G. Gruzina2, Z. R. Ulberg2, V. P. Kovalenko4, L. L. Sydoryk1
institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
2Ovcharenko Institute of Biocolloidal Chemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv 3Kavetsky Institute of Experimental Pathology, Oncology and Radiobiology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
4SO «Institute of Medicine of Work» of National Academy of Medical Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: tgruzina@mail.ru
Water dispersions of gold nanoparticles with average sizes 7, 17 and 57 nm have been synthesized by the method of chemical condensation. The character of autoimmune response of model animals’ organisms induced by intraperitoneal injection of the gold nanoparticles has been studied via the determination of autoantibodies titre against defensin (mBD-2), chaperonin Hsp60 and heart myosin (Myo).
The DNA-damage action of gold nanoparticles with average sizes 7 and 17 nm as well as absence of one under the influence of 57 nm nanoparticles have been revealed in vitro and in vivo.
On the basis of the parameters of organism autoimmune response and DNA-damage influence on tissues of the laborator animals with gold nanoparticles of different size it was made a conclusion that 57 nm particles were the most perspective for using in technologies of cardio-vascular pathologies diagnostic and treatment preparations creation.
Key words: gold nanoparticles, autoantibodies, defensin, chaperonin Hsp60, myosin, immune response, DNA-damage action.
