CC BY
46
ID: 2012-06-1003-A-1579 Оригинальная статья
Тучина Е.С., Петров П.О.
Оценка антибактериальной активности двух модификаций индоцианинового зеленого при воздействии
лазерного инфракрасного (808 нм) излучения
ФГБОУ ВПО Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского
Резюме
В работе рассматривается чувствительность трех представителей рода Staphylococcus к комплексному действию лазерного инфракрасного (808 нм) излучения и двух модификаций красителя индоцианинового зеленого.
Ключевые слова: лазерное излучение, индоцианиновый зеленый, стафилококки
Введение
Краситель индоцианиновый зеленый активно используется в самых различных областях медицины: онкологии,
офтальмологии, кардиологии, хирургии, дерматологии, в косметологии. Важным является также очень низкая токсичность и быстрое выведение данного красителя из организма [1,2].
Индоцианиновый зеленый является перспективным красителем для применения в фотодинамической терапии, поскольку его максимум поглощения находится в пределах от 780 до 850 нм, что соответствует максимуму испускания инфракрасных лазеров [3].
Механизм угнетающего действия индоцининового зеленого не достаточно изучен. По мнению разных авторов, данный краситель обладает достаточно сильным фототоксическим действием, что можно отнести за счет его фотодинамического эффекта [2-5] или образования цитотоксических конечных продуктов под действием света [6].
Представляло интерес оценить антимикробную эффективность двух модификаций индоцианового зеленого при воздействии лазерного инфракрасного (808 нм) излучения на стафилококки.
Материалы и методы
В работе использовали две модификации красителя индоцианина зеленого (Sigma-Aldrich Co., USA) с максимумами поглощения на длинах волн 775 нм (ИЗ-775) и 800 нм (ИЗ-800) соответственно. Для экспериментов были выбраны концентрации красителей 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1%.
В качестве модельных микроорганизмов были выбраны: Staphylococcus aureus 209P, S.epidermidis (метициллин-чувствительный (MS) и метициллин-устойчивый (MR) штаммs). Микроорганизмы были получены из коллекции Государственного Института Стандартизации и Контроля им. Л.А. Тарасевича и Саратовского государственного медицинского университета. Бактерии выращивали при температуре 37 °С на универсальной плотной питательной среде (ГРМ-агар, Оболенск, Россия).
В качестве источника инфракрасного излучения применяли диодный лазер с максимумом спектра испускания Л=808±15 нм, плотностью мощности излучения - 60 мВт/см2. Во всех экспериментах использовали непрерывный режим излучения. Время облучения составляло от 5 до 30 мин.
Бактериальную взвесь готовили в стерильном физиологическом растворе до конечной концентрации 103 мк/мл. Из разведения микроорганизмов 105 мк/мл 0.1 мл взвеси вносили в 0.9 мл раствора красителя, инкубировали в течение 15 мин без доступа света. Из конечного разведения, а также из раствора фотосенсибилизатора бактериальну взвесь в объеме 0.1 мл вносили в ячейки планшета .
Источник излучения располагали над ячейками планшета; воздействие проводили последовательно увеличивая время облучения. После воздействия взвеси бактерий переносили на чашки Петри с плотной питательной средой и равномерно распределяли по поверхности стерильным шпателем. Учет результатов проводили путем подсчета числа колониеобразующих единиц (КОЕ) через 24 - 72 часа после инкубации при 37°С. Контролем служили взвеси бактерий не обработанные сенсибилизатором и не подвергнутые облучению.
Результаты
На первом этапе исследований оценивали чувствительность модельных микроорганизмов к действию различных концентраций ИЗ-775 и ИЗ-800 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1% по изменению числа КОЕ (табл. 1).
Таблица 1. Действие различных концентраций индоцианинового зеленого на число КОЕ стафилококков, %
Вид бактерий Контроль (физ. р.-р.) ИЗ-800, % ИЗ-775, % 0.0001 0.001 0.01 0.1 0.0001 0.001 0.01 0.1
S. aureus 99.06± 3.24 97.61± 2.39 62.14± 4.96 42.03± 3.62 28.24± 2.76 99.55± 2.49 95.70± 2.17 62.03± 3.12 58.24± 4.72
S. epidermidis MS 98.98± 2.12 93.52± 2.49 65.70± 4.17 35.71± 3.41 26.03± 4.47 97.43± 2.37 98.09± 3.10 45.71± 3.21 3 .4 3. ± 3 .0 6. 6
S. epidermidis MR 99.12± 2.21 95.55± 3.45 60.09± 4.12 33.72± 4.92 25.71± 4.25 98.41± 2.42 97.45± 2.52 65.72± 3.92 65.71± 3.21
Установлено, что оптимальными концентрациями используемых веществ, которые вызывают наименьшую гибель микроорганизмов, являются 0.001% для ИЗ-775 и 0.0001% для ИЗ-800.
Исходя из полученных данных, на следующем этапе работы использовали длительность предварительной инкубации бактериальных клеток с наночастицами, равную 15 мин, экспозицию излучения 5, 10, 15 и 30 мин. В качестве фотосенсибилизаторов использовали две модификации индоцианина зеленого: ИЗ-775 с концентрацией 0.001%, ИЗ-800 с концентрацией 0.0001%.
Bulletin of Medical Internet Conferences (ISSN 2224-6150)
2012. Volume 2. Issue 6
Установлено, что инфракрасное лазерное излучение незначительно подавляет рост микроорганизмов. Для всех исследованных штаммов снижение числа КОЕ отмечено в пределах от 10 до 35% при варьировании времени облучения от 5 до 30 мин.
P°1
о
w 100 -
so -
60 -
40 -
20 -
0 -
S. aureus
о
10
15
30
Время, мин
3 Контроль ПИЗ-775 ИИЗ-800
Рис. 1. Изменение численности S. aureus 209 Р при воздейстии лазерным инфракрасным (808 нм) излучением
0Í
О
ы
120 100 Н S0 60 --10 -20 0
S. epidermidis MS
■
та
та
та
т
О Контроль
30
Врем Д. Ы11Н
5 10
□ 113-775
Рис. 2. Изменение численности 5. ерШегтШ'я МБ при воздейстии лазерным инфракрасным (808 нм) излучением
4='
-
120 п
т g 100
so -
60 -
40
20 -0 —*
S.epidermidis MR
■SB
g
Dl
10
15 ЗО
Врем л, мин
□ ИЗ-SOG
Я Контроль □ ИЗ-775
Рис. 3. Изменение численности 5. ерШегтШ'я МР при воздейстии лазерным инфракрасным (808 нм) излучением
www.medconfer.com
© Bulletin of Medical Internet Conferences, 2012
Сходный характер подавления роста микроорганизмов ИК-излученим в сочетании с обработкой клеток ИЗ-775 отмечен для S. aureus 209 P и S. epidermidis MS (рис. 1, 2). Уменьшение показателя КОЕ происходило примерно на 40 - 85%. Метициллин-устойчивый штамм эпидермального стафилококка был более подвержен фотодинамическому воздействию ИК-излучения и красителя ИЗ-775. Сокращение числа КОЕ показано на 65 - 87% по сравнению с контролем (рис. 3).
Наибольшую устойчивость к воздействию ИК-излучения в сочетании с красителем ИЗ-800 продемонстрировал S. aureus 209 P (рис. 1). Снижение показателя КОЕ по сравнению с контролем отмечено на 30 - 65%. Для двух штаммов S. epidermidis была установлена сходная тенденция в чувствительности к фотодинамическому воздействию ИК-излучения и красителя ИЗ-800. Сокращение числа КОЕ выявлено на 40 - 87% (рис. 2, 3).
Таким образом, использованные в работе модификации индоцианина зеленого являются эффективными фотосенсибилизаторами при фотодинамическом воздействии инфракрасного лазерного излучения с длиной волны 808 нм на стафилококки. При малой длительности облучения (5-10 мин) большей подавляющей способностью обладал индоцианин зеленый с длиной волны 775 нм. Сокращение численности бактерий, обработанных как ИЗ-775, так и ИЗ-800, после 30 мин воздействия инфракрасного лазерного излучения имело сходный уровень для всех исследованных штаммов (в среднем 85%).
Литература
1. Abels C., Fickweiler S., Weiderer P., Baumler W., Indocyanine green and laser irradiation induce photooxidation // Arch. Dermatol. Res. - 2000 - V. 292.
- p. 404-411.
2. Fickweiler S., Rolf-Markus Szeimies R.-M., Baumler W., Steinbach P., Karrer S., Goetz A.E., Abels C., Hofstaidter F., Landthaler M. Indocyanine green: Intracellular uptake and phototherapeutic effects in vitro // J. Photochem. Photobiol. B. - 1997. - V. 38. - P. 178-183.
3. Baumler W., Abels C., Karrer S., Weiss T., Messmann H., Landthaler M., Szeimies R.M. Photo-oxidative killing of human colonic cancer cells using indocyanine green and infrared light. // Br. J. Cancer. - 1999. - V. 80. -P. 360-363.
4. Urbanska K., Romanowska-Dixon B., Matuszak Z., Oszajca J., Nowak-Sliwinska P., Stoche G., Indocyanine green as a prospective sensitizer for photodynamic therapy of melanomas // Acta Biochimica Polon. - 2000. - V. 49. - № 2. - P. 387-391.
5. Xu R.X., Huang J., Xu J.S., Sun D., Hinkle G.H., Martin E.W., Povoski S.P. Fabrication of indocyanine green encapsulated biodegradable microbubbles for structural and functional imaging of cancer. // J. Biomed. Opt. - 2009. - V.14. - № 3. P.034020-034026.
6. Engel E., Schraml R., Maisch T., Kobuch K., Konig B., Szeimies R.-M., Hillenkamp J., Baumler W. Vasold R. Light-Induced Decomposition of Indocyanine Green // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 2008. - V.49. - № 5. - P.1777-1783.
