CC BY
36
УДК 579.64+579.222.3
Журавлева А.С., Писаревская В.А., Бехбудзада Н.Б.-О., Шагаев А.А., Марквичев Н.С.
ОЦЕНКА АМИЛОЛИТИЧЕСКОЙ И ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЕЙ FUSARIUMОХУЗРОЯиМПРИ ПОВЕРХНОСТНОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ
Журавлева Александра Сергеевна, магистрант 1-го года обучения кафедры биотехнологии; sashka.zhuravliova@yandex.ru;
Писаревская Виолетта Алексеевна, студент 3-го года обучения кафедры биотехнологии; Бехбудзада Нурлан Бешир-оглы, аспирант 4-го года обучения кафедры биотехнологии; Шагаев Антон Александович, аспирант 3-го года обучения кафедры биотехнологии; Марквичев Николай Семёнович, кандидат технических наук, доцент кафедры биотехнологии; ФГБОУ ВО «Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева», Россия, Москва, 125480, ул. Героев Панфиловцев, д. 20.
В статье рассматривается метод визуального определения амилолитической и целлюлолитической активностей фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum поверхностным способом, а также его применимость для исследования процессов, связанных с фитопатогенезом. Даётся сравнение результатов оценки гидролитических активностей на основании визуальных различий.
Ключевые слова: ферментативная активность, фитопатогенез, поверхностное культивирование.
EVALUATION OF THE AMYLOLYTIC AND CELLULOLYTIC ACTIVITIES OF FUSARIUM OXYSPORUM IN SURFACE CULTIVATION
Zhuravleva A.S., Pisarevskaya V.A., Bechbudzada N.B.-O., Shagaev A.A., Markvichev N.S. D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russian Federation
The article discusses the method of visual determination of the amylolytic and cellulolytic activities of the phytopathogenic fungus Fusarium oxysporum by the surface method, as well as its applicability for the study of processes associated with phytopathogenesis. The results of the assessment of hydrolytic activities based on visual differences are compared.
Key words: enzymatic activity, phytopathogenesis, surface cultivation.
Введение
Одной из наиболее распространённых и насущных проблем в агропромышленности являются инфекционные заболевания выращиваемых культурных растений, среди которых наиболее распространены фузариозы - увядание растений, в особенности молодых саженцев, гниение корней и стебля. Известно, что фитопатогенные грибы, в том числе и Fusarium spp, секретируют различные соединения в процессе фитопатогенеза. Среди них выделяют токсины, угнетающие развитие растения различными способами [1], например, нарушением трансмембранного потенциала клеток, за счёт чего нарушаются процессы массообмена [2,3], или ингибированием активности важных для жизнедеятельности ферментов, среди которых могут быть даже ферменты цикла трикарбоновых кислот или включения в него пирувата [4]. Кроме того, в процессе фитопатогенеза патогенные
микроорганизмы способны секретировать ряд гидролаз, расщепляющих полимеры растительной ткани, среди которых белки, целлюлоза, гемицеллюлоза, крахмал и т.д. Гидролизованные соединения до олиго- и мономеров являются источником питания для развивающегося на растении фитопатогена. Возможно, одними из самых важных ферментов микромицетов, вызывающих увядание растений, являются целлюлазы и гемицеллюлазы, разрушающие основной каркас растительной ткани. Это приводит к гниению корневой шейки и стебля и нарушению транспорта веществ от корней к побегу.
Так, многие штаммы фузаревых грибов являются промышленными продуцентами целлюлаз, при этом существуют исследования, доказывающие, что целлюлоза сама является индуктором целлюлолитической активности [5]. Более того, фитопатогены также часто деградируют запасающие вещества, такие как крахмал, секретируя для этого амилазу. Доказано, что у некоторых штаммов фитопатогенов вирулентность инфекционного агента и его амилолитическая активность коррелируют [6].
По причине того, что гидролитические ферменты являются неотъемлемой частью процесса заражения растения инфекционными агентами, необходимо разработать или протестировать уже имеющуюся методику по оценке ферментативной активности штамма Fusarium oxysporum, используемый нами для разработки теории фитопатогенеза. Однако классические методы с глубинным культивированием и определением гидролитической активности культуральной жидкости не могут смоделировать процессы, происходящие в естественных условиях, когда микроорганизмы растут и развиваются поверхностно. Поэтому данная работа направлена на определение активности гриба, выращенного поверхностно, а именно - на агаризованной питательной среде. Были выбраны
целлюлолитическая и амилолитическая активности для проверки применимости методов к данному штамму.
Экспериментальная часть
В качестве модельного фитопатогена в опыте использовалась культура микроорганизма, предоставленная коллекцией микроорганизмов кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева Fusarium oxysporum штамм F2106. Данный гриб является одним из наиболее распространённых заболеваний культурных растений, чем обусловлен выбор его для изучения ферментативной активности грибных инфекций в рамках исследования процесса фитопатогенеза.
Для проведения анализа гидролитической активности микромицета использовали
агаризованные питательные среды, содержащие минеральные соли Чапека (KNO3 - 2,5 г/л, KH2PO4 -1 г/л, MgSO4*7H2O - 0,5 г/л, NaCl - 10 г/л) и источник углерода, соответствующий определяемому комплексу ферментов: для определения целлюлолитической активности - 5 г/л карбоксиметилцеллюлозы (далее - КМЦ), для амилолитической активности - 2 г/л водорастворимого крахмала. Агар вносили в обе среды в одинаковой концентрации - 18 г/л. Стерилизацию сред осуществляли
автоклавированием при 1 ати на протяжении получаса.
Fusarium oxysporum сеяли на агаризованную питательную среду уколом микробиологической иглой в центр чашки Петри и культивировали при 28°С на протяжении 4 суток. Выросшие колонии окрашивали различными способами в зависимости от определяемой ферментативной активности. Для оценки целлюлолитической активности готовили водный раствор красителя Конго красный (2 г/л), который вносили в чашку Петри с выросшей на КМЦ колонией Fusarium oxysporum, полностью покрывая её поверхность и инкубировали 15 минут. Затем раствор красителя смывали при помощи 1М раствора NaCl. Для оценки амилолитической активности в чашку с колонией Fusarium oxysporum, выросшей на крахмале, вносили 1%масс раствор иода в 2%масс KI, который мгновенно окрашивает поли- и олигосахариды, содержащиеся в среде. Согласно с описанной методикой [7-9], в обоих методах в случае наличия активности вокруг колонии микромицета должна образоваться зона просветления, величина которой пропорциональна ферментативной активности выделяемых экзоферментов. Измеряли диаметр колонии и зону просветления вокруг неё.
На 4 сутки поверхностного культивирования на питательной среде с КМЦ выросла колония Fusarium oxysporum диаметром 37 мм, а на питательной среде с крахмалом - 35 мм. Окрашивание агаризованных сред с колониями микроорганизма показало различные результаты. Так, окрашивание КМЦ-содержащей среды красителем Конго красный дало результат, представленный на рис.1: зона просветления составляла приблизительно 1 -1,5 мм вокруг колонии, при этом под самой колонией (не считая крайний, самый молодой мицелий) просветления не наблюдалось.
Рис. 1. Определение целлюлолитической активности Fusarium oxysporum
Оценка амилолитической активности
представлена на рис.2: зона просветления в данном случае, наоборот, наблюдается под самой колонией и в диаметре составляет приблизительно 32-33 мм, что на 2-3 мм меньше диаметра самой колонии.
Рис.2. Определение амилолитической активности Fusarium oxysporum
Обсуждение результатов и заключение
В соответствии с полученными в ходе эксперимента данными можно сделать несколько выводов. Во-первых, данный метод действительно пригоден для визуальной оценки ферментативной активности грибов, в том числе исследуемого штамма. Соответственно, для дальнейшей разработки теории фитопатогенеза, которую целесообразно проводить в условиях, приближённых к естественным (что также подразумевает поверхностное культивирование), можно проводить более сложные опыты с использованием описанных методик. Во-вторых, можно интерпретировать полученные первичные данные по различному проявлению ферментативных активностях и их различий. Следует
отметить, что сами методики различны, поэтому результат окрашивания среды с крахмалом более ярко выражен, нежели среды с КМЦ. Под колонией, выросшей на крахмале нет никакого окрашивания, что свидетельствует о практически его полном гидролизе. В случае со средой с КМЦ продукты деградации целлюлозы не окрашиваются Конго красным, однако данный краситель взаимодействует с клеточной стенкой гриба, что объясняет наличие красной окраски под колонией.
Более того, наблюдались явные различия в показателях целлюлолитической и амилолитической активностях. В случае с ферментами, гидролизующими целлюлозу, зона просветления опережала рост колонии. В случае с деградацией крахмала зона просветления, наоборот, отставала от роста колонии. Можно предположить, что это является следствием различных темпов секреции фитопатогеном различных гидролаз. Наиболее активный синтез ферментов происходит на самом краю колонии, так как около её центра ферменты уже гидролизовали определённое количество
полисахарида, достаточное для развития гриба. В данном случае целлюлазы выделялись в толщу агара за пределы колонии, то есть, они секретировались в первую очередь, в отличие от амилаз. Амилазы секретировались после прорастания мицелия на данной области субстрата. С другой стороны, можно предположить, что на концах новообразованных гиф также секретируются амилазы, но со значительно более низкой интенсивностью, разлагая амилозу и образуя в качестве продуктов гидролиза всё еще длинные цепи молекул. Но с уменьшением концентрации крахмала интенсивность окраски постепенно снижалась бы, так как цветная реакция крахмала с иодом очень чувствительна [10], чего не наблюдалось в ходе проведённого эксперимента. Полученные результаты могут быть свидетельством того, что более важная и первостепенная роль в процессе фитопатогенеза принадлежит целлюлазам. Это предположение логично ещё и с точки зрения содержания двух различных полисахаридов в организме растения: целлюлоза содержится в любых тканях растения, в то время как крахмал несёт функцию запасающего вещества и накапливается в корнеплодах и незрелых плодах. Fusarium oxysporum вызывает увядание и корневую гниль растений, проникая в стебель, где содержится большее количество целлюлозы, разрушение которой приведёт к гибели растения, а микромицет переключится на сапротрофный тип питания.
Полученные результаты не противоречат действительности, поэтому описанный метод можно применять по отношению к различным штаммам
фитопатогенов для исследования их гидролитических активностей и для более глубокого исследования процессов секреции ферментов в ходе фитопатогенеза.
Список литературы
1. Л. И. Домрачева, А. И. Фокина, С. Г. Скугорева Почвенные грибы рода Fusarium и их метаболиты: опасность для биоты, возможность использования в биотехнологии (обзор) / ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ ЭКОЛОГИИ. - 2021. - №1. - С.6-15.
2. Filek, M., Sieprawska, A., Koscielniak, J., Oklestkova, J., Jurczyk, B., Telk, A., Janeczko, A. The role of chloroplasts in the oxidative stress that is induced by zearalenone in wheat plants - The functions of 24-epibrassinolide and selenium in the protective mechanisms // Plant Physiology and Biochemistry. -2019. - Vol. 137. - P. 84-92
3. Singh, V. K., Singh, H. B., Upadhyay, R. S. Role of fusaric acid in the development of "Fusarium wilt" symptoms in tomato: Physiological, biochemical and proteomic perspectives // Plant Physiology and Biochemistry. - 2017. - Vol. 118. - P. 320-332
4. Thiel P. G. A molecular mechanism for the toxic action of moniliformin, a mycotoxin produced by fusarium moniliforme // Biochemical Pharmacology. -1978. - Vol. 27. - № 4. - P. 483-486.
5. Чепчак Т.П., Олишевская С.В., Курченко И.Н. Целлюлозолитическая активность штаммов Fenellia flavipes и Fusarium oxysporum // Микробиологический журнал. - 2013. - Т. 75. - №6
6. Gawade, D. B., Perane, R. R., Suryawanshi, A. P., Deokar, C. D. Extracellular enzymes activity determining the virulence of Rhizoctonia bataticola, causing root rot in soybean // Physiological and Molecular Plant Pathology. - 2017. - Vol. 100. - P. 49-56
7.G.L. Maria Antimicrobial and enzyme activity of mangrove endophytic fungi of southwest coast of India / G.L. Maria, K.R. Sridhar, N.S. Raviraja // Journal of Agricultural Technology. - 2005. - P. 67-80
8.К. А. Вырасткова ИССЛЕДОВАНИЕ ПРИРОДНЫХ ИЗОЛЯТОВ МИКРОМИЦЕТОВ НА ЦЕЛЛЮЛОЗОЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ / К. А. Вырасткова, И. Г. Широких // Биологические науки. - 2017. - №1.
9.Teather R. M., Wood P. J. Use of congo-red polysaccharide interaction in enumeration and characterization of cellulozalytic bacteria the bovine rumen // Appl. Environ Microbiol. - 1982. - V. 43. - P. 777-780.
10. Г.М. Крючкова Практикум по неорганической и органической химии / Г.М. Крючкова. - Москва: изд. «Медицина», 1970. - 164 с.
