CC BY
61
УДК 612.127.2:618.3]578.825.12
ОЦЕНКА АКТИВНОСТИ КАРБОАНГИДРАЗЫ И ЕЕ ВЛИЯНИЯ НА ПРОЦЕССЫ ОКСИГЕНАЦИИ ЭРИТРОЦИТОВ КРОВИ БЕРЕМЕННЫХ ПРИ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ
М.Т.Луценко, И.А.Андриевская
Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания, 675000, г. Благовещенск, ул. Калинина, 22
РЕЗЮМЕ
Цель исследования - разработка гистохимического метода оценки активности карбоангидразы в эритроцитах крови с целью прогнозирования развития гемической гипоксии у беременных при рецидиве цитомегаловирусной инфекции (ЦМВИ) в сроке 8-9 недель. Обследовано 40 женщин, в том числе 25 ЦМВ-серопозитивных беременных с рецидивом ЦМВИ в сроке 8-9 недель, и 15 серонегатив-ных беременных на тех же сроках гестации. Верификация ЦМВ, определение типоспецифиче-ских антител класса IgM и IgG, индекса авидности проводились методом иммуноферментного анализа, выявление ДНК ЦМВ - методом ПЦР, карбоангид-раза в эритроцитах крови - по методу Курата (в модификации М.Т.Луценко, И.А.Андриевской), содержание оксигемоглобина - по методу Эвелина и Мэллой. В результате выявлено уменьшение числа эритроцитов крови беременных при рецидиве ЦМВИ в сроке 8-9 недель до 65,0±2,2% (в контроле - 85,0±3,2%, p<0,001), имеющих реакцию на карбоангидразу на уровне 0,015±0,002 усл. ед. (в контроле - 0,059±0,004 усл. ед., p<0,001), и снижение содержания оксигемоглобина до 93,0±1,5% (в контроле - 99,0±1,0%, p<0,001). Таким образом, развитию гемической гипоксии у беременных при рецидиве ЦМВИ в сроке 8-9 недель способствует угнетение активности карбоангидразы в эритроцитах, что приводит к аккумуляции карбаминовых комплексов, снижению сродства гемоглобина к кислороду и образованию оксигемоглобина.
Ключевые слова: цитомегаловирусная инфекция, гемическая гипоксия, беременность, эритроциты, кар-боангидраза, гемоглобин.
SUMMARY
THE ESTIMATION OF CARBONIC ANHYDRASE AND ITS INFLUENCE ON THE PROCCESSES OF OXYGENATION OF BLOOD ERYTHROCYTES OF PREGNANT WOMEN AT CYTOMEGALOVIRUS INFECTION
M.T.Lutsenko, I.A.Andrievskaya
Far Eastern Scientific Center of Physiology and
Pathology of Respiration, 22 Kalinina Str., Blagoveshchensk, 675000, Russian Federation
The aim of the research is to develop histochemical method of estimation of carbonic anhydrase in blood erythrocytes to predict the development of hemic hypoxia in pregnant women under the relapse of cytomegalovirus infection (CMVI) at the 8-9th weeks. 40
women were examined, including 25 women with CMV-seropositive pregnant women with the relapse of CMVI at the 8-9th weeks and 15 seronegative pregnant women at the same gestation stage. CMV verification, the identification of type-specific antibodies of IgM and IgG, of avidity index was done by the method of immune-enzyme analysis, of CMV DNA by PCR method, of carbonic anhydrase in blood erythrocytes by Kurate method (in the modification of M.T.Lutsenko, I.A.An-driyevskaya), of oxyhemoglobin concentration by the method of Malloy-Evelyn. As a result there was found the decrease of the number of blood erythrocytes in pregnant women under the relapse of CMVI at the 89th weeks till 65.0±2.2% (in the control it was 85.0±3.2%, p<0.001), who had a response to carbonic anhydrase at the level of 0.015±0.002 arb. units (in the control it was 0.059±0.004 arb. units, p<0.001), and the decrease of oxyhemoglobin concentration till 93.0±1.5% (in the control it was 99.0±1.0%, p<0.001). Thus, the development of hemic hypoxia of pregnant women under the relapse of CMVI at the 8-9th weeks is conditioned by the suppression of carbonic anhydrase activity in erythrocytes, which leads to the accumulation of aminoformic complexes, the decrease of hemoglobin oxygen affinity and the formation of oxyhemoglobin.
Key words: cytomegalovirus infection, hemic hypoxia, pregnancy, erythrocytes, carbonic anhydrase, hemoglobin.
Одним из ферментов, принимающим непосредственное участие в связывании и выведении из организма углекислого газа, образующегося в процессе тканевого дыхания, является карбоангидраза [3, 6]. Фермент обеспечивает поддержание концентрации СО2 в тканях на физиологическом уровне, регулирует постоянство концентрации анионов крови, влияет на транспорт кислорода к тканям, формирует тип обмена веществ. Участвуя во многих физиологических процессах, карбоангидраза обеспечивает оптимальное состояние внутренней среды организма. В норме активность карбоангидразы крови довольно постоянна, но при некоторых патологических состояниях, таких как анемия, заболевания легких и беременность, может изменяться, что нарушает процесс оксигенации эритроцитов.
Для определения активности карбоангидразы в настоящее время применяют радиологические, иммуно-электрофоретические, колориметрические и титриметрические методы. Определение производят в цельной крови, взятой с гепарином, или в гемолизиро-ванных эритроцитах. Для клинических целей используют колориметрические методы определения
активности карбоангидразы (например, модификации метода Бринкмана), основанные на установлении времени, необходимого для сдвига рН инкубационной смеси с 9,0 до 6,3 в результате гидратации СО2 [1].
В настоящей работе рассматривается возможность применения гистохимического метода, что позволит повысить точность функциональной и количественной оценки продуктов реакции на карбоангидразу в натив-ных эритроцитах, а, следовательно, своевременно на доклиническом уровне определять угрозу формирования гемической гипоксии у беременных при рецидиве цитомегаловирусной инфекции (ЦМВИ).
Материалы и методы исследования
Обследовано 40 беременных, в том числе 25 серо-позитивных с рецидивом ЦМВИ (титр антител IgG 1:1600) в сроке 8-9 недель (основная группа) и 15 ЦМВ-серонегативных беременных на тех же сроках ге-стации (контрольная группа).
Критерии включения в основную группу: лабора-торно подтвержденный молекулярно-биологическими и серологическими методами исследования рецидив ЦМВИ в сроке 8-9 недель, наличие в периферической крови беременных на момент исследования титра антител класса IgG к ЦМВ 1:1600, стойкая клиническая ремиссия герпесвирусной инфекции. К критериям исключения относили первичную ЦМВИ, обострение других воспалительных заболеваний экстрагениталь-ной патологии и инфекций, передающихся половым путем.
Рецидив ЦМВИ устанавливали на основании результатов комплексного исследования периферической крови: при наличии антител класса IgM или четырехкратного и более нарастания титра антител класса IgG к ЦМВ в парных сыворотках в динамике через 10 суток, при индексе авидности антител класса IgG к ЦМВ более 65%, а также в случае выявления ДНК ЦМВ методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в крови, моче, в соскобах с буккального эпителия или слизистой оболочки шейки матки.
Исследования выполнены в лаборатории механизмов этиопатогенеза и восстановительных процессов дыхательной системы при неспецифических заболеваниях легких и акушерском отделении патологии беременности при ДНЦ ФПД, Городской клинической больнице г. Благовещенска с учетом требований Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki, 2008) и Правил клинической практики в Российской Федерации, утвержденных приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. №266. Работа одобрена комитетом по биомедицинской этике при ДНЦ ФПД (решение №88 от 12.01.2015 г.) в соответствии с принципами конвенции о биомедицине и правах человека, а также общепризнанными нормами международного права. Все женщины подписали письменное информированное согласие.
У обследуемых беременных взятие крови проводили из локтевой вены в стандартные вакуумные про-
бирки с коагулянтом в количестве 5 мл для получения образцов мононуклеарных клеток. Для серологических исследований использовали кровь, не содержащую антикоагулянты. Выделение мононуклеарных клеток крови для ПЦР проводилось с использованием раствора фиколл-урографина плотностью 1,077 г/мл (ООО «НПО ДНК-технология», Россия). Серологические исследования проводили в парных сыворотках с интервалом 10-14 суток.
Верификация ЦМВ, определение типоспецифиче-ских антител, индекса авидности осуществляли методами ИФА на спектрофотометре Stat Fax 2100 (США) с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), ДНК ЦМВ выявляли методами ПЦР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Россия).
Карбоангидразу в эритроцитах периферической крови выявляли гистохимическим методом [4]. Суть метода заключалась в инкубации при комнатной температуре в течение 15-20 мин. 1 мл эритроцитарной массы с 2 мл свежеприготовленного и профильтрованного раствора субстрата, состоящего из 5 мл 8% NaHCO3 и 1 мл 10% СоС12, с последующим центрифугированием при 1500 g в течение 1-2 мин. Супернатант удаляли декантированием. Эритроциты отмывали два раза бикарбонатным буфером (рН 7,2-7,4) с последующим центрифугированием при 1500 g в течение 1-2 мин. К отмытым и открученным эритроцитам добавляли 1 мл 2% раствора сульфида аммония или натрия. Инкубировали в течение 2 мин. Эритроциты отмывали два раза бикарбонатным буфером (рН 7,2-7,4) с последующим центрифугированием при 1500 g в течение 12 мин. После чего готовили монослойный мазок на центрифуге Diff Spin-2 (США). Полученные мазки высушивали и изучали при иммерсии под цифровым микроскопом МТ (Япония), который связан с программно-аппаратным комплексом SCION Corporation (США), позволяющим выделять на изображении с мазка каждую клетку в отдельности, и после выделения клетки определять ее площадь с выявленным продуктом реакции на карбоангидразу.
Статистический анализ и обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0. Для определения достоверности различий использовали непарный параметрический критерий Стьюдента. Данные представлены как среднее арифметическое (M) ± стандартная ошибка среднего (m). Определялись: чувствительность, специфичность и точность метода оценки активности карбоангидразы в эритроцитах крови.
Результаты исследования и их обсуждение
Как известно, СО2 способен соединяться с атомом железа гемоглобина с образованием карбаминовых комплексов, изменяя его свойства и реакцию с кислородом. Очень высокое сродство СО2 к гемоглобину (в 200 раз выше, чем у кислорода) блокирует один или более атомов железа в молекуле гема, изменяя при этом сродство гемоглобина к кислороду.
Образование карбаминовых комплексов в эритроците в норме приводит, во-первых, к значительному высвобождению ионов водорода; во-вторых, в ходе образования карбаминового гемоглобина снижается сродство гемоглобина к кислороду. Эффект сходен с действием низкого рН, которое потенцирует высвобождение кислорода из оксигемоглобина при высокой концентрации СО2 (эффект Бора) [2, 5, 7, 8].
С другой стороны, связывание кислорода гемоглобином снижает сродство его аминогрупп к СО2 (эффект Холдена).
При угнетении активности карбоангидразы в эритроцитах происходит аккумуляция СО2 вследствие не-
0 0
0
А
достаточности процессов гидратации, что инициирует образование карбаминовых комплексов, лимитирующих присоединение кислорода к гемоглобину и образование его оксигенированной формы.
Доказательством (рис. А) явилось уменьшение числа эритроцитов крови беременных с рецидивом ЦМВИ в сроке 8-9 недель до 65,0±2,2% (р<0,001), имеющих реакцию на карбоангидразу в пределах значений 0,015±0,002 усл. ед. (р<0,001). В контрольной группе 85,0±3,2% эритроцитов крови беременных имели интенсивную реакцию на карбоангидразу, что составило 0,059±0,004 усл. ед. (рис. Б).
Рис. Гистохимическая реакция на карбоангидразу в эритроцитах периферической крови беременных при сроке 8-9 недель. А - основная группа, интенсивность реакции снижена (0,015±0,002 усл. ед.); Б - контрольная группа, интенсивная реакция на карбоангидразу (0,059±0,004 усл. ед.). Окраска по методу Курата (в модификации М.Т.Луценко, И.А.Андриевской). Увеличение: 10*100.
Исследование уровня оксигемоглобина в эритроцитах крови беременных с рецидивом ЦМВИ в сроке 8-9 недель показало снижение его количества до 93,0±1,5% (р<0,001) при контроле 99,0±1,0%.
При проведении анализа эффективности гистохимического метода оценки активности карбоангидразы эритроцитов крови беременных при рецидиве ЦМВИ в сроке 8-9 недель с целью прогнозирования гемиче-ской гипоксии получили чувствительность - 90,9%, специфичность - 75% и точность метода - 88%, что говорило о хорошей клинической значимости данного метода.
Полученные данные позволяют предположить, что карбоангидраза, как один из аллостерических факторов, принимает непосредственное участие в метаболизме кислорода, регулируя через процессы гидратации СО2 сродство гемоглобина к кислороду и образование оксигемоглобина.
Развитию гемической гипоксии у беременных при рецидиве ЦМВИ в сроке 8-9 недель способствует угнетение активности карбоангидразы в эритроцитах, что приводит к аккумуляции карбаминовых комплексов, снижению сродства гемоглобина к кислороду и образованию оксигемоглобина.
ЛИТЕРАТУРА
1. Андриевская И.А. Характер дыхательной активности крови у беременных с герпес-вирусной инфекцией // Фундаментальные аспекты оценки фетоплацентарной недостаточности при вирусных заболеваниях во время беременности / под ред. М.Т.Луценко. Благовещенск: АМГУ, 2008. С.54-72.
2. Плацентарная недостаточность / Т.С.Быстрицкая, М.Т.Луценко, Д.С.Лысяк, В.П.Колосов. Благовещенск, 2010. 135 с.
3. Клиническая оценка лабораторных тестов / под ред. Н.У.Тиц; пер. с англ. М.: Медицина, 1986. 480 с.
4. Патент 2537180 RU. Способ оценки ингибирую-щего действия цитомегаловирусной инфекции на активность карбоангидразы в эритроцитах периферической крови беременных / М.Т.Луценко, И.А.Андриевская; заявл. 31.10.2014; опубл. 27.12.2014. Бюл. №36.
5. Руководство по гематологии: в 3-х т. / под ред. А.И.Воробьева. М.: Ньюдиамед, 2007. 1275 с.
6. Физиология человека / под ред. В.М.Покровского, Г.М.Коротько. М.: Медицина, 2007. 656 с.
7. The production of carbon monoxide from hemoglobin in vivo / R.F.Coburn [et al.]. // J. Clin. Invest. 1967. Vol.46, №3. Р.346-356.
8. Carbon monoxide production associated with ineffective erythropoiesis / P.White. [et al.]. // J. Clin. Invest. 1967. Vol.46, №12. P.1986-1998.
REFERENCES
1. Andrievska I.A. The nature of the respiratory activity of the blood of pregnant women with herpes viral infection. In: Lutsenko M.T., editor. Fundamental aspects of the assessment of fetoplacental insufficiency in viral diseases during pregnancy. Blagoveshchensk; 2008: 54-72 (in russian).
2. Bystritskaya T.S., Lutsenko M.T., Lysyak D.S., Ko-losov V.P. Placental insufficiency. Blagoveshchensk; 2010 (in russian).
3. Tietz N.U. Clinical guide to laboratory tests. Moscow; 1986 (in russian).
4. Patent 2537180 RU. Lutsenko M.T., Andrievska I.A. The method to evaluate the inhibitory effect of CMV infection on the activity of carbonic anhydrase in red blood cells in peripheral blood of pregnant women; published 27.12.2014 (in russian).
5. Vorob'ev A.I., editor. Manual on Hematology. Moscow: N'yudiamed; 2007 (in russian).
6. Pokrovskiy V.M., Korot'ko G.M., editors. Human
physiology. Moscow: Meditsina; 2007 (in russian).
7. Coburn R.F., Williams W.J., White P., Kahn S.B. The production of carbon monoxide from hemoglobin in vivo. J. Clin. Invest. 1967; 46(3):346-356.
8. White P., Coburn R.F., Williams W.J., Goldwein M.I., Rother M.L., Shafer B.C. Carbon monoxide production associated with ineffective erythropoiesis. J. Clin. Invest. 1967; 46(12):1986-1998.
Поступила 03.04.2015
Контактная информация Михаил Тимофеевич Луценко,
доктор медицинских наук, профессор, академик РАН, руководитель лаборатории механизмов этиопатогенеза и восстановительных процессов дыхательной системы при НЗЛ, Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания,
675000, г. Благовещенск, ул. Калинина, 22.
E-mail: [email protected] Correspondence should be addressed to Mikhail T. Lutsenko, MD, PhD, Professor, Academician of RAS, Head of Laboratory of Mechanisms of Etiopathogenesis and Recovery Processes of the Respiratory System at Non-Specific Lung Diseases, Far Eastern Scientific Center of Physiology and Pathology of Respiration, 22 Kalinina Str., Blagoveshchensk, 675000, Russian Federation.
E-mail: [email protected]
