CC BY
336
ISSN 1998-4812
1029
УДК 57.088
раздел БИОЛОГИЯ
ОТРАБОТКА МЕТОДИК ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ ДНК-ИДЕНТИФИКАЦИИ ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ШТРИХ-КОДИРОВАНИЯ
© Р. Р. Гарафутдинов*, О. В. Чубукова, А. Р. Сахабутдинова, Р. Т. Матниязов, Н. Р. Нагаев, А. В. Чемерис, В. А. Вахитов
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Россия, Республика Башкортостан, 450054 г. Уфа, пр. Октября, 71.
Тел./факс: +7 (347) 235 60 88.
E-mail: garafutdinovr@mail.ru
При определении принадлежности биоматериалов с мест преступлений или катастроф широко применяется анализ ДНК с помощью полимеразной цепной реакции. Для криминалистических лабораторий различными фирмами предлагаются коммерческие наборы реагентов для выделения ДНК, разработанные под анализ STR-локусов. Ранее нами был предложен подход к ДНК-идентификации личности, основанный на принципе генетического штрих-кодирования и требующий анализа панели SNP. В данной работе приведены результаты отработки ряда методик выделения и анализа ДНК из биологических образцов разных типов (следов крови, волос, буккального эпителия, чешуек кожи, слюны и спермы), оптимизированные для генетического штрих-кодирования и потенциально применимые в криминалистической практике.
Ключевые слова: ДНК-идентификация личности, биологический материал, ПЦР, одно-нуклеотидный полиморфизм, генетический штрих-код.
Введение
Методологическая база ДНК-идентификации личности основана исключительно на использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР) — метода, обладающего высокой чувствительностью и позволяющего специфично амплифицировать целевые фрагменты генома. ПЦР незаменима при анализе криминалистических образцов, поскольку часто на месте преступлений и катастроф остается биологический материал, например, волос, капля крови, семенная жидкость и т.п., содержащий незначительное количество ДНК [1, 2]. Необходимость амплификации ДНК из подобных образцов ставит на первое место этап выделения генетического материала. Различными фирмами предлагаются коммерческие наборы реагентов для выделения ДНК, однако большинство из них рассчитано на анализ т.н. STR-локусов или на работу с относительно большими количествами нуклеиновых кислот [3, 4].
Ранее нами был предложен подход к ДНК-идентификации личности, основанный на принципе генетического штрих-кодирования [5]. Согласно данному подходу, для получения генетического штрих-кода (ГШК) человека необходимо выделить ДНК из биологического материала и определить любым удобным методом полиморфные нуклеоти-ды в позициях SNP. При присвоении ГШК наиболее удобным источником ДНК является кровь. С помощью написанной нами специальной компьютерной программы «CodeGENE» на основе экспериментальных данных по набору (панели) SNP для каждого человека формируется индивидуальный ГШК, который может быть представлен в цифровых (бинарном и гексадицемальном) и графическом форматах.
В отличие от первичного присвоения ГШК, при анализе биоматериала неизвестной принадлежности приходится сталкиваться со следовыми количествами ДНК. В этом случае важнейшим аспектом является выбор способа выделения генетического материала, поскольку необходимо максимально полное его извлечение и сохранение для дальнейшей амплификации. В предложенном нами подходе подразумевается анализ SNP-панели, состоящей как минимум из 24 тетрааллельных SNP. В связи с этим целью данной работы стала отработка методик выделения и анализа ДНК из биологических образцов разных типов (следов крови, волос, буккального эпителия, чешуек кожи, слюны и спермы) для последующего генетического штрих-кодирования человека, потенциально применимых в практике криминалистических учреждений.
Экспериментальная часть
Источниками ДНК служили биоматериалы человека: цельная венозная кровь, следовые количества крови (застарелые пятна крови на ватном диске), волосы, буккальный эпителий, перхоть, слюна и сперма. ДНК из цельной венозной крови выделяли рутинным методом фенольно-хлороформной экстракции [6]. Выделение ДНК из остальных вышеуказанных материалов проводили согласно литературным методикам с небольшими изменениями.
SNP-анализ осуществляли с помощью аллель-специфичной ПЦР по конечной точке и в реальном времени в амплификаторах «Терцик» (ДНК-технология, Россия) и iQ5 (BioRad, США). Прайме-ры подбирали с помощью компьютерной программы PrimerSelect пакета программ Lasergene (DNASTAR Inc., США), а также в режиме on-line с использованием OligoAnalyzer 3.1 (Integrated DNA Technologies, США).
* автор, ответственный за переписку
Смесь для амплификации объемом 30 мкл представляла собой раствор 67 мМ Трис-HCl (pH 8.8), 2.5 мМ MgCl2, 0.001% Твин-20, 200 мкМ каждого из dNTP и содержала по 10 пмоль каждого праймера и 2.5 ед. Taq-полимеразы. Для аллель-специфичной ПЦР в реальном времени использовали готовый ПЦР-набор, содержащий интеркали-рующий краситель Eva Green. ПЦР проводили по программе: 94.0 °С — 2 мин, далее 30 циклов термо-циклирования 94.0 °С-(48-60°С)-72.0 °С по 30 с каждый из этапов, 72.0 °С — 2 мин. В случае анализа по конечной точке продукты амплификации разделяли в 10%-ном полиакриламидном геле в 1х ТАЕ-буфере с последующим окрашиванием бромистым этидием и визуализацией в проходящем ультрафиолетовом свете.
Результаты и обсуждение
В криминалистической, судебно-медицинской практике часто приходится сталкиваться с ничтожно малым количеством биоматериала (например, волосы на месте преступления) или с его разнородностью (например, на месте катастроф). Кроме того, объекты биологического происхождения сильно отличаются друг от друга по содержанию ДНК, поэтому при выделении последней должна учитываться специфика образца [7, 8].
Ранее нами для отработки подхода по генетическому штрих-кодированию человека были подобраны панель из 24 тетрааллельных SNP и комплекты праймеров для их анализа, проведено гено-типирование ряда индивидов и построены их ГШК [5]. ДНК была выделена из цельной венозной крови, однако для установления личности по уже имеющемуся ГШК необходимо иметь количество ДНК, достаточное для генотипирования всей SNP-панели. В связи с этим в данной работе нами представлены результаты определения количества биоматериалов, достаточных для генетического штрих-кодирования одного человека, а также оптимизации ряда методик их выделения.
Для выделения ДНК из тканей используют различные методы, однако все они включают лизис клеток с высвобождением ядерной ДНК и очистку ДНК от белков. В настоящее время наиболее надежным является фенольно-детергентный метод, в основе которого лежит лизис клеток под действием додецилсульфата натрия и протеиназы К. Лизат далее обрабатывают смесью фенол/хлороформ и осаждают этанолом [9]. Существенным недостатком данного метода является возможная значительная потеря ДНК на разных этапах экстракции. Эту методику мы применяли только при выделении ДНК из цельной крови, однако ее использование для ограниченных количеств биоматериала вследствие потерь ДНК нецелесообразно. В данной работе тотальную ДНК получали с помощью коммерческих комплектов реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «РИБО-сорб» производства отечественной компании Ин-
терЛабСервис и набора NucleoSpin DNA Trace компании Macherey-Nagel, работа которых основана на методе нуклеосорбции [10].
Выделение ДНК из следов крови проводили с помощью растворов из обоих указанных выше наборов, в качестве материала служили ватные диски с пятнами крови диаметром 5—10 мм, высушенные на воздухе (возраст пятен от 1 месяца до 1 года). Для набора «РИБО-сорб» последовательность выделения ДНК была следующей. Ватный диск помещали в TE-буфер на 1 ч при 37 °С, затем жидкость отбирали, переносили в стерильный эппен-дорф, добавляли 20 мкл сорбента - силикагеля. Перемешивали на вортексе и выдерживали 5 мин при 60 °С. Далее центрифугировали 1 мин при 13000 об/мин, удаляли 2/3 надосадочной жидкости, к оставшемуся объему добавляли 400 мкл лизирующе-го буфера, перемешивали на вортексе, центрифугировали 30 с при 13000 об/мин. Затем добавляли в пробирки 800 мкл отмывочного раствора, перемешивали на вортексе до полного ресуспендирования сорбента, центрифугировали 30 с при 10000 об/мин и удаляли надосадочную жидкость. Пробирки помещали в термостат на 60°С на 10-15 мин для подсушивания сорбента, затем добавляли 80 мкл TE-буфера. Количество наработанной в результате указанных процедур ДНК приведено в табл. Выделение ДНК с помощью набора NucleoSpin DNA Trace проводили согласно протоколу производителя; было получено практически равное количество ДНК для обоих протестированных наборов.
Интересным объектом для выделения ДНК являются волосы. Наибольшее количество ядерной ДНК содержится в корневой и прикорневой зонах свежевырванных волос (около 250 нг) [8]. В выпавших волосах с отмершей луковицей оно уменьшается до 10-20 нг. Стержень волоса содержит меланин, полностью ингибирующий ПЦР, поэтому очень важно получить ДНК с высокой степенью очистки. При выделении ДНК из волоса для лизиса клеток нами были использованы три различных лизирующих буфера:
1. Лизирующий буфер А: 0.5 М ЭДТА, 2 % лаурил-саркозил, 5 мкл протеиназы К (10 мг/мл). В качестве биоматериала брали один волос (луковица + 1 см прикорневой зоны). С использованием данного буфера получен образец №1.
2. Лизирующий буфер B: 10 мМ трис-HCl, pH 7.5, 10 мМ Ш2ЭДТА, 50 мМ NaCl, 2 % SDS. В качестве биоматериала брали 3 волоса (луковица + 1 см прикорневой зоны). С использованием данного буфера получен образец №2.
3. Лизирующий буфер С: лизирующий буфер А + 20 мкл 1 М DTT + 5 мкл протеиназы К (10 мг/мл). В качестве биоматериала брали 5 волос (луковица + 5 см прикорневой зоны). С использованием данного буфера получен образец №3.
Использовали только свежевырванные волосы одного и того же человека. Каждый волос погружали
стерильным пинцетом в отдельную пробирку и промывали сначала деионизированной водой, затем абсолютным этанолом и высушивали. Затем волосы разрезали стерильными ножницами на фрагменты длиной около 3 мм, которые помещали в 1.5 мл пробирку типа эппендорф и добавляли 100 мкл одного из лизирующих буферов. Инкубировали при 55 °С от 6 до 12 ч. В процессе выдерживания волос должен частично или полностью раствориться (в первом и втором лизирующих буферах растворяется луковица, в третьем — весь волос). После инкубации содержимое пробирки перемешивали на вортексе в течение 30 с, добавляли 20 мкл сорбента, перемешивали на вортексе, оставляли в штативе на 1 мин, еще раз перемешивали и вновь оставляли на 5 мин. Добавляли по 400 мкл раствора для отмывки №1 из набора «РИБО-сорб», перемешивали на вортексе до полного ресуспендирования сорбента, центрифугировали 30 с при 10000 об/мин, удаляли надосадочную жидкость. Далее добавляли в пробирки по 800 мкл раствора для отмывки №2 из набора «РИБО-сорб», перемешивали на вортексе до полного ресуспендиро-вания сорбента, центрифугировали 30 с при 10000 об/мин, удаляли надосадочную жидкость. Помещали пробирки в термостат на 60 °С на 10—15 мин, затем приливали по 70 мкл ТЕ-буфера.
Из одного волоса с использованием лидирующего буфера А было выделено 70 мкл ДНК с концентрацией 5.1 нг/мкл, из трех волос с использованием буфера В — 70 мкл ДНК с концентрацией 21.5 нг/мкл, из пяти волос с использованием буфера С получено 70 мкл ДНК с концентрацией 10.07 нг/мкл. Таким образом, наибольший выход ДНК обеспечил вариант с использованием буфера В.
Для выделения ДНК из буккального эпителия использовались растворы из набора «РИБО-сорб» согласно следующей методике. Стерильной ватной палочкой брали мазок с внутренней стороны щеки, помещали в 150 мкл ТЕ-буфера и ополаскивали в нем палочку несколько раз. Жидкость отбирали и переносили в стерильный эппендорф, добавляли 20 мкл сорбента, перемешивали на вортексе и оставляли на 5 мин при 60 °С. Затем раствор центрифугировали 1 мин при 13000 об/мин, удаляли 2/3 на-досадочной жидкости, к оставшемуся объему добавляли 400 мкл лидирующего буфера и перемешивали на вортексе. Центрифугировали 30 с при
Характеристика проан
13000 об/мин, приливали в пробирки по 800 мкл раствора для отмывки, перемешивали на вортексе до полного ресуспендирования сорбента, центрифугировали 30 с при 10000 об/мин и удаляли надо-садочную жидкость. Пробирки помещали в термостат на 60 °С на 10—15 мин для подсушивания сорбента, затем приливали 80 мкл ТЕ-буфера. Количество выделенной ДНК приведено в табл.
Методика выделения ДНК из чешуек кожи, взятых с волосистой части головы (перхоть), состояла из следующей последовательности действий. Фрагмент кожного покрова помещали в 150 мкл лизирующего буфера из набора «РИБО-сорб», оставляли на 1 час при 60 °С. Добавляли 20 мкл сорбента, перемешивали на вортексе и оставляли на 2 мин при 60 °С. Затем центрифугировали 1 мин при 13000 об/мин, удаляли 2/3 надосадочной жидкости. К оставшемуся объему добавляли 400 мкл лизирующего буфера и перемешивали на вортексе. Центрифугировали 30 с при 13000 об/мин, добавляли в пробирки по 800 мкл раствора для отмывки, перемешивали на вортексе до полного ресуспенди-рования сорбента, центрифугировали 30 с при 10000 об/мин и удаляли надосадочную жидкость. Пробирки помещали в термостат на 60 °С на 10—15 мин для подсушивания сорбента, затем приливали 80 мкл ТЕ-буфера. Было выделено 80 мкл ДНК с концентрацией 61.56 нг/мкл (табл.).
Основным источником ДНК в слюне являются клетки буккального эпителия. Выделение ДНК из слюны проводили только с помощью набора «РИБО-сорб». К собранной в пробирку слюне (около 800 мкл) добавляли 30 мкл сорбента, перемешивали на вортексе и оставляли на 5 мин при 60 °С. Далее смесь центрифугировали 1 мин при 13000 об/мин, удаляли 2/3 надосадочной жидкости, к оставшемуся объему добавляли 400 мкл лизирующе-го буфера, перемешивали на вортексе и вновь центрифугировали 30 с при 13000 об/мин. Затем добавляли в пробирки по 800 мкл раствора отмывки, перемешивали на вортексе до полного ресуспенди-рования сорбента, центрифугировали 30 с при 10000 об/мин и удаляли надосадочную жидкость. Пробирки помещали в термостат на 60 °С на 10—15 мин, затем приливали 70 мкл ТЕ-буфера. Количество выделенной ДНК приведено в табл.
Таблица
¡анных биоматериалов
Биоматериал (характеристика и количество) Объем раствора ДНК, мкл Концентрация ДНК, нг/мкл А-260/280
Кровь (пятна на ватном диске, возраст от 1 месяца до 1 года, изна- ^ 21±6 2 95
чальное количество не более 100 мкл) '
Волосы (свежевырванные волосы, луковица и 1 см прикорневой „„ .. „ ,
1 ~ л т-»\ 70 21.50 2.38 зоны, 3 шт., лизирующий буфер В)
Буккальный эпителий (стандартный соскоб, 1 шт.) 80 15.04 1.83
Перхоть (около 1 мг) 80 61.56 1.90
Слюна (800 мкл) 70 375.06 1.88
Сперма (100 мкл) 200 426.45 2.17
Значительный интерес при проведении экспертизы фактов изнасилования может представлять семенная жидкость. Данный биоматериал обладает целым рядом преимуществ с точки зрения ДНК-анализа. Во-первых, сперма содержит огромное количество половых клеток, несущих ДНК, поэтому теоретически из нее можно выделить относительно большое ее количество. Во-вторых, практически исключена перекрестная контаминация (загрязнение) ДНК, выделенной из спермы, ДНК других индивидов. В-третьих, можно легко установить личность преступника (насильника) ввиду однозначности принадлежности спермы.
Выделение ДНК из семенной жидкости проводили следующим образом. На чистый диск диаметром 3 см из белой хлопчатобумажной ткани наносили 100 мкл спермы, давали высохнуть на воздухе. Выделение ДНК проводили через 2 недели с использованием набора NucleoSpin DNA Trace по модифицированной методике. Тканевый диск с материалом помещали в стерильную центрифужную пробирку на 50 мл, приливали 9 мл FLB-буфера и 100 мкл раствора протеиназы К и выдерживали 3 ч при 56 °С. Центрифугировали смесь 3 мин при 4000 об/мин и отбирали супернатант (получено 6 мл). К супернатанту приливали 6 мл этанола, перемешивали, переносили в фильтрующую колонку E-column и центрифугировали 3 мин при 3000 об/мин. Фильтрат сливали, а в фильтрующую колонку заливали 2.5 мл BW-буфера, центрифугировали 5 мин при 3000 об/мин. В ту же фильтрующую колонку заливали 5 мл буфера B5, центрифугировали 5 мин при 3000 об/мин. Фильтрат сливали, и в ту же фильтрующую колонку заливали 200 мкл элюирующего буфера. Центрифугировали 5 мин при 3000 об/мин, собирая раствор в пробирку на 0.5 мл.
Эффективность отработанных способов экстракции ДНК и возможность генетического штрих-кодирования оценивали путем проведения аллель-специфичной ПЦР с праймерами к 24 выбранным ранее SNP. В качестве образца сравнения использовали ДНК, выделенную из цельной крови индивида, биоматериал которого анализировался. На рисунке 1 в качестве примера приведены результаты электрофоретического анализа продуктов аллель-специфичной ПЦР с использованием ДНК, выделенной из клеток буккального эпителия.
Для ряда образцов наблюдали особенности в протекании ПЦР. Так, при разведении ДНК, выделенной из пятен крови, до 5 нг/мкл ПЦР не шла. В то же время аллель-специфичная ПЦР с ДНК из цельной крови в концентрации 5 нг/мкл дает четкую наработку продукта. С неразведенной ДНК из следов крови (17.8 нг/мкл) продукт нарабатывается, но в небольшом количестве и при увеличении количества циклов до 33-35, что, вероятно, связано с частичной деградацией ДНК при хранении исходного образца. Для волос показано, что ПЦР идет со
всеми тремя образцами ДНК при концентрации последней 5 нг/мкл. Однако максимальная наработка ПЦР-продуктов наблюдалась с образцами ДНК №2 и №3, тогда как с образцом №1 специфичный продукт синтезировался в небольшом количестве. Таким образом, для экстракции ДНК из волос рекомендуется использовать лизирующие буферы В и С. Для остальных биоматериалов каких-либо отличий в протекании ПЦР в сравнении с ДНК из цельной крови не наблюдалось.
M А С G T К A C' G' TT
1—
Рис. 1. Пример электрофореграммы продуктов аллель-специфичной ПЦР с праймерами к rs9518075. Дорожки:
М - ДНК-маркер (100-1000 п.н.), A, C, G, T - ПЦР-образцы, полученные с использованием соответствующих аллель-специфичных праймеров и ДНК из цельной крови, К - отрицательный контроль, A', C', G', T' - ПЦР-продукты, полученные с использованием соответствующих аллель-специфичных праймеров и ДНК из буккаль-ного эпителия.
Для всех использованных биообразцов показана достаточность концентрации и степени очистки ДНК, выделенной в соответствии с отработанными методиками, для анализа 24 тетрааллельных SNP методом аллель-специфичной ПЦР. Проведенное после SNP-анализа генетическое штрих-кодирование показало 100% совпадение генотипов «неизвестных» индивидов-хозяев исследовавшихся биообразцов и соответственно их ГШК. Таким образом, показана принципиальная возможность использования коммерческих наборов и протоколов к ним для выделения ДНК из различных биологических материалов в приложении к ДНК-идентификации человека с помощью генетического штрих-кодирования.
Работа поддержана Министерством образования и науки РФ (Госконтракт №14.740.11.1059, Соглашение №8046, грант РФФИ №11-04-97086-р_поволжье_а).
ЛИТЕРАТУРА
1. van Oorschot R. A., Ballantyne K. N., Mitchell R. J. Forensic trace DNA: a review // Investig. Genet. 2010. No. 1. P. 14.
2. Köhnemann S., Pennekamp P., Schmidt P.F., Pfeiffer H. qPCR and mtDNA SNP analysis of experimentally degraded hair samples and its application in forensic casework // Int. J. Legal. Med. 2010. No. 4. PP. 337-342.
3. Harder M., Renneberg R., Meyer P., Krause-Kyora B., von Wurmb-Schwark N. STR-typing of ancient skeletal remains:
which multiplex-PCR kit is the best? // Croat. Med. J. 2012. V. 53, No. 5. PP. 416-22.
4. Hong S. B., Kim S. H., Kim K. C., Park M. H., Lee J. Y., Song J. M., Han M. S., Kim W. Korean population genetic data and concordance for the PowerPlex ESX 17, AmpFlSTR Identifiler, and PowerPlex 16 systems // Forensic Sci. Int. Genet. 2013. V. 7, No. 3. e. 47-51.
5. Гарафутдинов Р. Р., Чубукова О. В., Сахабутдинова А. Р., Вахитов В. А., Чемерис А. В. Генетическое штрих-кодирование как подход к идентификации личности на примере популяции русских Республики Башкортостан // Вестн. физ.-хим. биол. и биотехнол. 2012. Т. 8. №»3. С. 19-25.
6. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: A Laboratory Manual. N. Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press. 1989. 479 p.
7. Kobilinsky L. Recovery and stability of DNA in samples of forensic science significance // Forensic Sci. Rev. 1992. V. 4. P. 67-87.
8. Корниенко И. В., Водолажский Д. И., Вейко В. П., Щербаков В. В., Иванов П. Л. Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел. РнД: Ростиздат, 2001. С. 256.
9. Mathew C.C. The isolation of high molecular weight eucariot-ic DNA // Methods in mol. biol. / Ed. Walker J.M.N.Y.; Human press. 1984. P. 31-34.
10. Boom R., Sol C., Salimans M., Jansen C., Wertheim-van Dillen P., Vander Noordaa J. Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids // J. Clin. Microb. 1990. V. 28. No. 3. PP. 495-503.
Поступила в редакцию 12.09.2013 г.
