CC BY
18Бюллетень науки и практики /Bulletin of Science and Practice Т. 5. №5. 2019
https://www.bulletennauki.com DOI: 10.33619/2414-2948/42
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ /BIOLOGICAL SCIENCES
УДК 575.2:575.22:574.3 https://doi.org/10.33619/2414-2948/42/03
AGRIS F30
ОТБОР ПОЛИМОРФНЫХ ЛОКУСОВ ГЕНОМА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПОПУЛЯЦИЙ PINUS SYLVESTRIS L. НА ВОСТОЧНО-ЕВРОПЕЙСКОЙ РАВНИНЕ
©Пришнивская Я. В., ORCID: 0000-0003-1513-2682, Пермский государственный национальный исследовательский университет, г. Пермь, Россия, [email protected] ©Нассонова Е. С., ORCID: 0000-0002-7589-4913, Пермский государственный национальный исследовательский университет, г. Пермь, [email protected] ©Васильева Ю. С., ORCID:0000-0002-2255-2434, канд. биол. наук, Пермский государственный национальный исследовательский университет, г. Пермь, Россия, [email protected] ©Боронникова С. В., ORCID: 0000-0002-5498-8160, д-р биол. наук, Пермский государственный национальный исследовательский университет, г. Пермь, Россия, [email protected]
SELECTING OF POLYMORPHIC LOCI OF GENOME FOR IDENTIFICATION OF POPULATIONS OF PINUS SYLVESTRIS L. ON EAST-EUROPE PLAIN
©Prishnivskaya Ya., ORCID: 0000-0003-1513-2682, Perm State University, Perm, Russia, [email protected] ©Nassonova E., ORCID: 0000-0002-7589-4913, Perm State University, Perm, Russia, [email protected] ©Vasileva Yu., ORCID:0000-0002-2255-2434, Ph.D., Perm State University, Perm, Russia, [email protected] ©Boronnikova S., ORCID: 0000-0002-5498-8160, Dr. habil., Perm State University, Perm, Russia, [email protected]
Аннотация: у 8 смежных популяций Pinus sylvestris L., расположенных на ВосточноЕвропейской равнине, были протестированы десять пар праймеров к 10 генам, а также четырех пары праймеров к 4 локусам не кодирующих регионов хпДНК. Из протестированных 14 пар праймеров к исследуемым локусам были отобраны два локуса не кодирующих регионов хпДНК (psbA-trnH, trnL-trnF), которые наиболее полиморфны, имеют гомологичные последовательности в базах данных и поэтому они рекомендованы для молекулярно-генетической идентификации смежных популяций P. sylvestris на ВосточноЕвропейской равнине.
Abstract. 10 pairs of primers from 8 related Pinus sylvestris L. populations collected on East-European plain to 10 genes and 4 primer's pairs to 4 loci of uncoding clDNA regions. 2 loci of uncoding clDNA regions (psbA-trnH, trnL-trnF) were selected from tested 14 primer's pairs. These two loci are most polymorphic and has homologous consistencies in data bases. Therefore, these loci is recommended for molecular-genetic identification of related Pinus sylvestris L. populations on East-European plain.
Бюллетень науки и практики /Bulletin of Science and Practice Т. 5. №5. 2019
https://www.bulletennauki.com DOI: 10.33619/2414-2948/42
Ключевые слова: генетическое разнообразие, полиморфные локусы, молекулярные маркеры, идентификация, популяция, Pinus sylvestris L., Восточно-Европейская равнина.
Keywords: genetic diversity, polymorphic loci, molecular markers, identification, population, Pinus sylvestris L., East-European plain.
Сохранение генетических ресурсов ценных древесных растений предполагает исследование сложившейся нативной популяционной структуры, то есть характерных для вида уровней внутрипопуляционного генного разнообразия и пространственного распределения генетической изменчивости [1, 2]. Известно, что за счет сокращения эффективной численности древесных растений в популяциях вследствие проведения сплошнолесосечных рубок, гибели насаждений в результате пожаров, болезней, ветровала, загрязнения окружающей среды наблюдается неуклонное снижение генетического разнообразия [3]. Вырубка леса, в особенности несанкционированная, ликвидируя часть генотипов, неминуемо ведет к генетическому обеднению популяций и уменьшению генетического разнообразия [4]
Материалы и методы исследований
Объектом исследования являются 8 хорологически смежных популяций сосны обыкновенной, расположенные на востоке Восточно-Европейской равнины. Первая популяция находится на левобережье р. Ветлуги, вторая — в бассейне р. Юг и р. Северной Двины, третья — в верховьях р. Ветлуги, четвертая — бассейне среднего течения р. Ветлуги, пятая — в бассейне нижнего течения р. Ветлуги и на левобережье р. Волги на участке от устья р. Ветлуги до г. Новочебоксарска, шестая — в междуречье р. Суры и р. Волги, седьмая — в бассейне р. Моломы, восьмая — на северной оконечности Вятских Увалов.
Выделение ДНК проводили по методике С. Роджерса с соавторами [5], c небольшими модификациями [6] Концентрацию и качество ДНК определяли на приборе SpectrofotometrTM NanoDrop 2000 ("Thermo scientific", USA).
Для проведения ПЦР концентрацию ДНК каждой пробы выравнивали до 10 нг/мкл. Для отбора полиморфных локусов генома P sylvestris в каждой из восьми популяций отобраны по 12 деревьев, у которых в пробах ДНК выявлены наивысшие показатели генетического разнообразия на основании полиморфизма ISSR-PCR маркеров.
Для амплификации изучаемых локусов использовали реакционную смесь объемом 20 мкл следующего состава: 10х буфер для ПЦР («Силекс М», Россия); 1,5 мМ MgCl2; 0,2 мМ каждого dNTP; 1 мкМ каждого праймера; 0,5 ед. Tag-полимеразы; 10 нг ДНК. Далее продукты амплификации разделяли электрофорезом в 2% агарозном геле. Ферментативную очистку продуктов ПЦР проводили смесью ферментов ExoI и FAST-AP ("Fermentas", Литва) в отношении 0,5:1 из расчета 1,5 мкл ферментативной смеси на 5 мкл продуктов ПЦР.
Реакцию ферментативной очистки проводили в амплификаторе GeneAmp PCRSystem 9700 ("Applied Biosystems", США) по программе: 37°C — 30 мин, 80°C — 15 мин, охлаждение до 4°C.
Для реакции секвенирования применяли набор BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit ("Applied Biosystems", США), в качестве праймера использованы сначала прямая, а затем обратная последовательности из пары праймеров, с которой была поставлена ПЦР. Амплификацию проводили в термоциклере GeneAmp PCRSystem 9700 ("Applied Biosystems", США) по программе: 5 мин — 94°C, следующие 30 циклов (94°C — 30 сек, Тотж °C — 45 сек, 72°C — 2 мин), 72оС — 10 мин. Очистку продуктов реакции
Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice Т. 5. №5. 2019
https://www.bulletennauki.com DOI: 10.33619/2414-2948/42
секвенирования от не вступивших в реакцию меченых нуклеотидов осуществляли с помощью набора BigDye® XTerminatorTM Purification Kit ("Applied Biosystems", США).
В исследовании использовался метод автоматического ферментативного секвенирования. Капиллярный электрофорез синтезированных последовательностей проведен в двух направлениях в ПЦР-лаборатории кафедры ботаники и генетики растений ПГНИУ (Россия) на 24-капиллярном генетическом анализаторе Genetic Analyzer 3500xL ("Applied Biosystems", США).
Результаты исследований Были протестированы десять пар праймеров к 10 генам, а также четыре пары праймеров к 4 локусам некодирующих регионов хпДНК. Для амплификации локусов избранных генов были использованы праймеры, приведенные в литературных источниках (Таблица).
Таблица 1.
ИЗУЧЕННЫЕ ЛОКУСЫ ГЕНОМА P. sylvestris
№ Локус Последовательности праймеров (прямой /обратный) Продукт, размер гена или региона Источник
1 dhn1 TACCCCTGAGGAAGCTGAGGAAAAG/ AGGAAGAAGTTGCCAATTCCAG Дегидрин1, часть гена: 1263 п. н. Wachowiak et al., 2009
2 dhn3 TACTCGTTATTAAGATGGCGCAACC/ CGATTGTACCCGAAGTCCCATTTAT ДегидринЗ, часть гена: 359 п. н. Wachowiak et al., 2009
3 dhn4 AGAAGGAAGATGAGGGAAGGCAATG/ CACATATTAGATGGGCAGGGGGTCT Дегидрин4, часть гена: 231 п. н. Wachowiak et al., 2009
4 dhn5 GTATGTTCGGCTTATTGGGCAAAAA/ AACCGCAAATACCGACCTCACCATC Дегидрин5, часть гена: 547 п. н. Wachowiak et al., 2009
5 dhn7 ATTAAGATGGCGGAAGAGCAACAGG/ TTGTACCCGAAGTCCCATTT Дегидрин7, часть гена: 364 п. н. Wachowiak et al., 2009
6 4CL TCTGGCTCCTGCGGAACAGT/ AGGAACGACTGCTGCGTCAG 4-кумарат:СоА лигаза, часть гена: 477 п. н. Ersoz et al., 2010
7 C3H GTTCTGCAGGGGAATGTCTGTTC/ ACCAGTGGGAAGCCAATGGA Кумарат 3-гидроксилаза, часть гена: 552 п. н. Ersoz et al., 2010
8 cafl AACTCTGCCAAAGTCACAAGAAAAAC A/GGACAATAGAGACTTAAATGGAATC CAACA Фактор сборки хроматина I, часть гена: 579 п. н. Ersoz et al., 2010
9 cesa3 GACGAAAGAGCATTGTTGATGAGC/ AGTGAGCAAACTGACGGCTGG Целлюлозосинтаза 3, часть гена: 630 п. н. Ersoz et al., 2010
10 comt4 CTAGGTTGCGCTTGGACCGT/ TTTGTGTGGCGATTTGGCAA Катехол О-метилтрансфераза, част гена: 444 п. н. Ersoz et al., 2010
11 trnV GTAGAGCACCTCGTTTACAC/ CTCGAACCGTAGACCTTCTC Некодирующий регион хпДНК, 548 п. н. Wang et al., 1999
12 rpl20-rps18 CTTCGTCGTTTGTGGATTAC/ AGTCGATTTATTAGTGAGCA Некодирующий регион хпДНК, 567 п. н. Wang et al., 1999
13 psbA-trnH GTTATGCATGAACGTAATGCTC/ CGCGCATGGTGGATTCACAATCC Некодирующий регион хпДНК, 665 п. н. Ferri et al., 2009
14 trnL-trnF GGTTCAAGTCCCTCTATCCC/ ATTTGAACTGGTGACACGAG Некодирующий регион хпДНК, 462 п. н. Ferri et al., 2009
Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice Т. 5. №5. 2019
https://www.bulletennauki.com DOI: 10.33619/2414-2948/42
Праймеры были амплифицированны с тотальной ДНК P P. sylvestris для выявления их эффективности в геноме данного вида. Для проведения амплификации и отбора наиболее эффективных праймеров к выбранным генам P. sylvestris амплификация проводилась по стандартной схеме ПЦР
В результате тестовой амплификации девять пар праймеров для локусов dhn3, dhn4, dhn7, C3H, caf1, trnV, rpl20-rps18, psbA-trnH, trnL-trnF дали положительную амплификацию и фрагменты ДНК нужного размера, однако, на геле так же присутствовали и другие ампликоны, что свидетельствовало о наличии неспецифической амплификации. Остальные локусы не амплифицировались, либо не выявляли ампликонов нужного размера и были исключены из дальнейшего исследования. Основной причиной отсутствия или неспецифической амплификации может быть неполное сродство праймеров с ДНК исследуемого вида. Кроме того, спровоцировать синтез неспецифических фрагментов может излишняя, или недостаточная концентрация праймера, неоптимальная температура его отжига, концентрация ионов магния или количество ДНК-матрицы. Поэтому, для получения качественных целевых ампликонов мы провели оптимизацию условий ПЦР, для чего варьировали пропорции и концентрации данных компонентов в ПЦР-смеси и температуру отжига в нескольких повторных ПЦР для каждого из 10 тестированных локусов. В результате были получены более качественные ПЦР-продукты исследуемых локусов.
Итак, были получены продукты амплификации пяти локусов сосны обыкновенной, которые использовались для проведения тестового секвенирования последовательностей данных генов. В результате секвенирования полученных продуктов амплификации пяти локусов P sylvestris, обработки и сравнения секвенированных последовательностей с имеющимися в базах данных установлено, что лишь три (dhn3, psbA-trnH, trnL-trnF) из пяти секвенированных локусов имеют гомологичные последовательности в базах данных и могут быть идентифицированы в геноме P. sylvestris. Остальные локусы были исключены из дальнейшего анализа. Так же был исключен ген dhn3, так как он оказался более консервативным и не подходил для использования в идентификации смежных популяций P. sylvestris.
Таким образом, для изучения нуклеотидного полиморфизма и идентификации популяций P. sylvestris были отобраны два локуса некодирующеих регионов хпДНК и проведено секвенирование их последовательностей для проведения идентификации смежных популяций P sylvestris на Восточно-Европейской равнине.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (задание 5.6881.2017/8.9)
Список литературы:
1. Алтухов Ю. П. Динамика генофондов при антропогенных воздействиях // Вестник ВОГиС. 2004. T. 8. №2. C. 40-59.
2. Макеева В. М., Смуров А. В., Политов Д. В. и др. Оценка состояния генофонда и жизнеспособности лесопосадок ели европейской (Picea abies (L.) Karst.) из парков города Москвы и Подмосковья // Леса России: политика, промышленность, наука, образование: Материалы третьей международной научно-технической конференции. 2018. С. 187-190.
3. Видякин А. И. Популяционная структура сосны обыкновенной на востоке европейской части России: автореф. дисс. ... д-ра биол. наук. Екатеринбург, 2004. 48 с.
Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice Т. 5. №5. 2019
https://www.bulletennauki.com DOI: 10.33619/2414-2948/42
4. Ветчинникова Л. В., Титов А. Ф., Кузнецова Т. Ю. Карельская береза: биологические особенности, динамика ресурсов и воспроизводство. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН. 2013. 312 с.
5. Rogers S. O., Bendich A. J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues // Plant Molecular Biology. 1985. V. l. №19. P. 69-76.
6. Бельтюкова Н. Н., Нечаева Ю. С., Пришнивская Я. В., Тайман К. Е. Оптимизация методики выделения ДНК некоторых хвойных видов растений Пермского края // Синтез знаний в естественных науках. Рудник будущего: проекты, технологии, оборудование: материалы международной конференции. Пермь, 2011. С. 278-282.
7. Wachowiak W., Balk P. A., Savolainen O. Search for nucleotide diversity patterns of local adaptation in dehydrins and other cold-related candidate genes in Scots pine (Pinus sylvestris L.) // Tree Genetics & Genomes. 2009. №5. P. 117-132.
8. Ersoz E. S., Wright M. H., Gonza S. C. 'lez-Marti'nez et al. Evolution of disease response genes in loblolly pine: insights from candidate genes // PLoS ONE. 2010. V. 5. №12. P. 1-12.
9. Wang X.-R., Tsumura Y., Yoshimaru H. et al. Phylogenetic relationships of Eurasian pines (Pinus, Pinaceae) based on chloroplast rbcl, matk, rpl20-rps18 spacer, and trnv intron sequences // American Journal of Botany. 1999. V. 86. №12. P. 1742-1753.
10. Ferri G., Alu M., Corradini B. et al. Forensic botany: species identification of botanical trace evidence using a multigene barcoding approach // Int J Legal Med. 2009. V. 23. P. 395-401.
References:
1. Altuhov, Yu. P. (2004). Dinamika genofondov pri antropogennyh vozdejstviyah. Vestnik VOGiS, 8(2), 40-59. (in Russian).
2. Makeeva, V. M., Smurov A. V., & Politov D. V. et al. (2018). Ocenka sostoyaniya genofonda i zhiznesposobnosti lesoposadok eli evropejskoj (Picea abies (L.) Karst.) iz parkov goroda Moskvy i Podmoskov'ya. In: Lesa Rossii: politika, promyshlennost', nauka, obrazovanie, materialy tret'ej mezhdunarodnoj nauchno-tekhnicheskoj konferencii, 187-190. (in Russian).
3. Vidyakin, A. I. (2004). Populyacionnaya struktura sosny obyknovennoj na vostoke evropejskoj chasti Rossii: avtoref. Dr. diss. Ekaterinburg, 48. (in Russian).
4. Vetchinnikova, L. V., Titov, A. F., & Kuznetsova, T. Yu. (2013). Karel'skaya bereza: biologicheskie osobennosti, dinamika resursov i vosproizvodstvo. Petrozavodsk, Karel'skii nauchnyi tsentr RAN, 312. (in Russian).
5. Rogers, S. O., & Bendich, A. J. (1985). Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues. Plant Molecular Biology, 1(19), 69-76.
6. Beltukova, N. N., Nechaevaa, Yu. S., Prischivskaya, Ya. V., & Tayman, K. E. (2011). Optimization of methods for DNA extraction of some coniferous species plant of Perm Krai. In: Sintez znanij v estestvennyh naukah. Rudnik budushchego: proekty, tekhnologii, oborudovanie. Materialy mezhdunarodnoj konferencii, Perm, 278-282.
7. Wachowiak, W., Balk, P. A., & Savolainen, O. (2009). Search for nucleotide diversity patterns of local adaptation in dehydrins and other cold-related candidate genes in Scots pine (Pinus sylvestris L.). Tree Genetics & Genomes, (5), 117-132.
8. Ersoz, E. S., M. H. Wright, S. C. Gonzalez-Martinez et al. (2010). Evolution of disease response genes in loblolly pine: insights from candidate genes. PLoS ONE, 5(12), 1-12.
9. Wang, X.-R., Tsumura, Y., & Yoshimaru, H. et al. (1999). Phylogenetic relationships of Eurasian pines (Pinus, Pinaceae) based on chloroplast rbcl, matk, rpl20-rps18 spacer, and trnv intron sequences. American Journal of Botany, 86(12), 1742-1753.
Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice https://www.bulletennauki.com
Т. 5. №5. 2019 DOI: 10.33619/2414-2948/42
10. Ferri, G., Alu, M., & Corradini, B. et al. (2009). Forensic botany: species identification of botanical trace evidence using a multigene barcoding approach. Int J Legal Med, (23), 395-401.
Работа поступила в редакцию 15.04.2019 г.
Принята к публикации 19.04.2019 г.
Ссылка для цитирования:
Пришнивская Я. В., Нассонова Е. С., Васильева Ю. С., Боронникова С. В. Отбор полиморфных локусов генома для идентификации популяций Pinus sylvestris L. на ВосточноЕвропейской равнине // Бюллетень науки и практики. 2019. Т. 5. №5. С. 25-30. https://doi.org/10.33619/2414-2948/42/03.
Cite as (APA):
Prishnivskaya, Ya., Nassonova, E., Vasileva, Yu., & Boronnikova, S. (2019). Selecting of Polymorphic Loci of Genome for Identification of Populations of Pinus sylvestris L. on East-Europe Plain. Bulletin of Science and Practice, 5(5), 25-30. https://doi.org/10.33619/2414-2948/42/03. (in Russian).
