CC BY
199
УДК 632.1
ОТБОР ПЕРСПЕКТИВНЫХ АГЕНТОВ БИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ ОТ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ФУЗАРИОЗА 1
Асатурова Анжела Михайловна к.б.н.
Дубяга Валентина Михайловна Т омашевич Наталья Сергеевна
UDC 632.1
SELECTION OF PERSPECTIVE BIOLOGICAL CONTROL AGENTS FOR FALL WHEAT PROTECTION FROM FUSARIUM DISEASES
Asaturova Anzhela Michailovna Cand.Biol.Sci.
Dubyaga Valentina Michailovna Tomashevich Natalia Sergeevna
Жарникова Марина Дмитриевна Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт биологической защиты растений Российской академии сельскохозяйственных наук, Краснодар, Россия
Zhamikova Marina Dmitrievna State Scientific Institution All-Russian Research Institute of Biological Plant Protection Russian Academy of Agricultural Sciences, Krasnodar, Russia
В статье представлены результаты первичного скрининга бактериальных штаммов по признакам ферментативной и антифунгальной активности в отношении гриба Fusarium graminearum. Отобраны активные штаммы, перспективные для разработки на их основе биопрепаратов полифункционального типа действия для защиты озимой пшеницы от возбудителей фузариоза
The results of primary screening of bacterial strains on the basis of cell-wall degrading enzymes and antifungal activity against the fungus Fusarium graminearum. Selected active strains perspective for the development of biopreparations based on their type of multifunctional action to protect fall wheat from Fusarium pathogens are given
Ключевые слова: БАКТЕРИИ-АНТАГОНИСТЫ, СКРИНИНГ, ОЗИМАЯ ПШЕНИЦА, ФУЗАРИОЗ, БИОПРЕПАРАТЫ, АНТИФУНГАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ
Keywords: BACTERIA-ANT AGONISTS, SCREENING, FALL WHEAT, FUSARIUM, BIOPREPARATIONS, ANTIFUNGAL ACTIVITY
Введение
На протяжении последних 15 лет в России широко распространилось поражение сельскохозяйственных культур возбудителями фузариоза, которые вызывают корневые гнили всходов, трахеомикозные увядания растений, а также загнивание семян. Наблюдается тенденция к увеличению доли пораженных растений как в фазе всходов, так и в фазе созревания, что свидетельствует о неблагополучной экологической обстановке в агроценозах России. Отмечается, что при проявлении болезни после
Работа выполнена при финансовой поддержке МЦП ЕврАзЭС «Инновационные биотехнологии» на 2011-2015 гг. Министерства образования и науки РФ, государственный контракт № 16.М04.11.0026.
цветения и формирования семян потери урожая составляют 30-40 %. В частности, Северо-Кавказский регион - основной производитель зерна в России ежегодно теряет от 4,5 до 10,5 ц/га урожая озимой пшеницы, одной из причин этого являются возбудители болезней, в том числе прикорневые гнили и фузариоз колоса [1-3].
Химический метод, бесспорно, продолжает оставаться важнейшим средством оперативного сдерживания патогенов, однако, фитосанитарная нестабильность агробиоценозов, а также ухудшение общей экологической ситуации в регионах России требуют новых подходов в развитии и использовании средств и способов биологической защиты. Поэтому разработка биотехнологий получения и применения современных экологически безопасных микробных препаратов для сельского хозяйства становится первоочередной задачей социально-экономического развития государств.
Микробиологическая защита растений на современном этапе включает использование веществ биотического происхождения и применение биопрепаратов на основе живых культур микроорганизмов. При этом отмечается, что в борьбе с фузариозными заболеваниями растений наиболее интересным подходом является использование живых культур микроорганизмов.
Успешность микробиологического метода во многом определяется выбором микроорганизмов-антагонистов, способных обеспечить эффективную защиту в течение вегетационного периода. Поэтому поиск и исследование таких штаммов с целью разработки на их основе биопрепаратов полифункционального типа действия продолжает оставаться актуальной задачей. Исследования в этом направлении включают ряд этапов: выбор мест для поиска микроорганизмов, выделение и скрининг штаммов, исследование потенциальных биоагентов и полевые испытания [4].
Цель настоящих исследований - провести первичный скрининг бактериальных штаммов из коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИБЗР Россельхозакадемии по ферментативной и антагонистической активности в отношении грибов рода Fusarium.
Материалы и методы
Объектами исследования служили: штаммы бактерий-антагонистов возбудителей фузариоза, тест-культуры возбудителей фузариоза озимой пшеницы. Использованные в работе патогенные изоляты Fusarium graminearum Schwabe были взяты из коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИБЗР Россельхозакадемии.
Определение антагонистической активности бактериальных штаммов проводили методом двойных (встречных) культур [5, 6] на картофельно-глюкозном агаре (КГА) и среде Кинга В (КВ). В чашку Петри (ЧП) высевали агаровый блок с мицелием патогена, бактериальный штамм при этом наносили методом штриха на расстоянии 6 см от блока патогена. Культуры инкубировали в течение 20 дней при температуре + 28,0 °С. Контрольные варианты - чистые культуры гриба патогена и бактерии, посеянные отдельно. Учеты проводили ежедневно. Отмечался характер взаимоотношений гриба и бактерии: наличие или отсутствие зон, их размер, изменение цвета, плотности, толщины и направления роста мицелия патогена.
Степень ингибирования роста мицелия патогена определяли по формуле [7]:
И = (1 - (А / В)) Х 100
И - % ингибирования;
А - рост гриба в варианте;
В - рост гриба в контроле.
Определение ферментативной активности штаммов бактерий-антагонистов осуществляли с использованием различных тестов [8, 9].
Тест на липазу
Для определения липолитической активности использовали желточный агар (г/л): пептон - 40,0; глюкоза - 2,0; Ка2НР04 - 5,0; КаСІ -2,0; М^Б04 0,5 % раствор - 2,0 мл; агар - 25,0; вода дистиллированная.
Среду стерилизовали автоклавированием, охлаждали до + 60,0 °С. Скорлупу яйца дезинфицировали спиртом и давали обсохнуть. Яйцо разбивали и отделяли желток от белка. Желток, с соблюдением правил асептики, переносили в расплавленный агар и перемешивали до получения однородной суспензии, которую разливали в ЧП и оставляли для затвердевания. После посева бактерий и инкубации (до 14 дней) снимали крышку ЧП и внимательно просматривали поверхность при косом освещении. Положительный результат на липолитическую активность: образование маслянистого блестящего с переливами или перламутрового слоя над колонией бактерии и вокруг нее на поверхности агара.
Тест на гидролиз казеина.
Стерильное (автоклавированное) обезжиренное молоко смешивали при + 50,0 °С с равным объемом 4 %-ного расплавленного водного агара. ЧП с инокулированной штрихом средой инкубировали до 14 дней. Положительный результат на гидролиз казеина: образование зон
просветления вокруг колонии бактерии.
Тест на хитиназу
Для определения хитинолитической активности использовали синтетическую среду следующего состава (г/л): сахароза - 20,0; КаК03 -3,0; КН2Р04 - 1,0; MgS04 - 0,3; мел - 10,0; агар - 20,0; вода
дистиллированная.
ЧП с инокулированной штрихом средой инкубировали 7-14 дней. Положительный результат на хитинолитическую активность: образование зон просветления вокруг колонии.
Результаты и обсуждения
Образование специфических продуктов обмена - антифунгальных веществ, угнетающих или полностью подавляющих развитие патогенных микромицетов, является наиболее существенной и яркой формой антагонизма, широко распространенной в мире микроорганизмов. Поэтому для выявления возможных механизмов антагонистических взаимодействий бактерий с грибами рода Fusarium была изучена их антифунгальная активность in vitro методом встречных культур [5, 6].
В результате предварительного тестирования пяти различных изолятов гриба F. graminearum по признакам агрессивности и патогенности в качестве тест-объекта на начальном этапе скрининга был отобран изолят № 4 F. graminearum из коллекции патогенов ГНУ ВНИИБЗР Россельхозакадемии как один из наиболее вредоносных представителей рода Fusarium для культуры озимой пшеницы.
В результате проведенного скрининга по признаку антагонистической активности из 530 исследованных штаммов было отобрано 30 перспективных бактериальных культур, которые по механизму антифунгального действия на патоген можно разделить на две группы:
- штаммы, образующие стерильную зону антагонистического действия (табл. 1; рис. 1 в, г);
- штаммы, ингибирующие развитие патогена, занимая б0льшую площадь питательной среды ЧП (гиперпаразитизм) (табл. 2; рис. 1 д, е).
Таблица 1 - Активность бактериальных штаммов, образующих стерильную зону антагонистического действия, в отношении возбудителя
фузариоза F. graminearum
Штамм Ингибирование роста мицелия, %
инкубация, сутки
5-е 10-е 15-е 20-е
Б2Я 148 32,5 46,0 46,0 46,0
Б2Я 187 41,3 51,1 51,1 51,1
Б2Я 658 36,4 50,4 41,7 41,7
Б2Я 576 34,4 46,8 45,3 45,3
Б2Я 577 29,5 45,3 45,3 45,3
Б2Я 673 27,6 42,4 42,4 42,4
Б2Я 348 13,0 42,1 48,2 47,5
Б2Я 441 20,7 47,8 51,8 51,8
Б2Я 472 18,2 42,1 48,2 48,2
Б2Я 538 29,7 42,9 45,3 45,3
Б2Я 416 25,8 42,9 47,5 47,5
Б2Я 435 22,0 48,6 54,7 54,7
Б2Я 504 22,0 41,3 48,2 46,8
Б2Я 537 20,7 45,4 51,1 49,6
Б2Я 523 25,0 47,3 54,4 54,4
Б2Я 430 10,5 39,6 44,6 44,6
Б2Я 367 14,3 47,8 50,4 48,2
Б2Я 417 24,6 42,1 48,9 48,9
Штаммы Б7Я 148, Б7Я 187, Б7Я 577, Б7Я 673 и Б7Я 441 проявили высокую ингибирующую активность в отношении F. graminearum, которая сохранялась с десятых суток до конца инкубации. Тогда как штаммы Б7Я 367 и Б7Я 504 к десятым-пятнадцатым суткам совместной инкубации оказывали примерно равное антагонистическое действие на тест-объект, однако, к двадцатым суткам культивирования F. graminearum активнее преодолевал воздействие бактериальных метаболитов (табл. 1).
Максимальную ингибирующую активность по отношению к F. graminearum проявили высокоподвижные штаммы Б7Я 241, Б7Я 337 и Б7Я 455, которые уже на пятые сутки совместной инкубации занимали большую площадь питательной среды ЧП, блокируя развитие патогена (табл. 2; рис. 1 д, е).
Таблица 2 - Активность бактериальных штаммов, ингибирующих развитие
возбудителя фузариоза F. graminearum
Штамм Ингибирование роста мицелия, %
инкубация, сутки
5-е 10-е 15-е 20-е
вгя 86 45,2 56,8 54,0 52,5
Б2Я 241 53,0 56,8 55,4 53,2
ВгЯ 277 35,4 50,4 50,4 49,6
В2Я 261 44,6 48,2 46,8 48,2
ВгЯ 480 0 41,3 48,2 49,6
вгя 336-г 37,3 58,4 62,6 61,9
вгя 336-с 32,2 51,9 56,8 56,8
вгя 462 29,7 55,1 59,0 57,6
В2Я 512 30,9 45,4 50,4 49,6
вгя 413 37,3 54,3 59,7 56,8
В2Я 337 55,2 64,1 59,0 57,6
В2Я 455 55,2 46,2 52,5 56,8
Среди особенностей воздействия метаболитов выделенных активных штаммов бактерий на F. graminearum необходимо отметить следующее: в зоне антагонистического действия бактерий в некоторых вариантах патогенный изолят не сформировал воздушный мицелий, также наблюдался лизис уже сформировавшегося мицелия, ингибирование роста и потемнение мицелия патогена (рис. 1).
д е
Рисунок 1 - Антифунгальное действие перспективных бактериальных штаммов в отношении гриба Fusarium graminearum:
а - контроль (чистая культура Е. graminearum без антагониста на КГ А); б - контроль (чистая культура Е. graminearum без антагониста на среде КВ); в - Е. graminearum и штамм 441 (КВ); г - Е. graminearum и штамм Б7Я 537 (КВ); д - Е. graminearum и штамм Б7Я 336-с (КВ); е - Е. graminearum и штамм Б7Я 455 (КГА).
Некоторые микроорганизмы способны использовать в качестве
субстратов самые различные высокомолекулярные соединения. Однако макромолекулы не могут проникать через мембрану клетки. Они подвергаются расщеплению, которое осуществляется под воздействием экзоферментов, относящихся к классу гидролаз. Большая часть гидролитических ферментов относится к категории индуцибельных, то есть эта группа ферментов синтезируется только в ответ на присутствие в
среде необходимого для клетки субстрата-индуктора. При этом индуцированный синтез ферментов идет, пока в среде присутствует индуктор [10].
Известно, что при избытке питательных веществ в среде, обильно заселенной бактериями, главным фактором подавления прорастания спор фитопатогенов становится конкуренция за питательные вещества. При небольшом количестве бактерий в среде и недостатке питательных веществ, проявляются антагонистические свойства бактерий и их способность лизировать гифы гриба, основным структурным компонентом клеточной стенки которых является хитин-глюкановый комплекс [11]. Наличие высокой хитиназной активности микроорганизмов дает возможность извлечения азота и углерода из труднодоступных соединений, каковым является хитин, и, как следствие, включение этих элементов в круговорот почва-атмосфера [12]. Важно отметить, что обязательным условием эффективного лизиса патогенных грибов и/или использования грибного мицелия как источника питания связано с комплексным действием различных гидролитических ферментов [13, 14].
Вследствие этого была изучена способность перспективных бактериальных штаммов продуцировать гидролитические ферменты. Нами выявлен различный уровень синтеза литических ферментов у исследуемых штаммов бактерий-антагонистов (табл. 3).
Таблица 3 - Продуцирование перспективными штаммами бактерий-
антагонистов гидролитических ферментов
Штамм Ферменты
протеаза липаза хитиназа
Б2Я 336-г ++++ +++ -
Б2Я 336-с ++++ +++ -
Б2Я 86 - - +
Б2Я 148 - - -
Б2Я 187 ++++ ++++ -
Б2Я 241 ++++ - -
Б2Я 261 - - -
Б2Я 277 ++++ +++ -
BZR 337
+++
BZR 348
++
BZR 367
BZR 413
++++
+
BZR 416
++++
BZR 417
++++
BZR 430
BZR 435
++++
BZR 441
++++
BZR 455
++++
BZR 462
+++
BZR 472
++++
BZR 480
+++
BZR 504
++
BZR 512
++
BZR 523
+++
BZR 537
+++
BZR 538
+++
BZR 576
+
BZR 577
BZR 658 BZR 673
++++
+++
++
Примечание:
- отсутствие активности; + очень слабая активность; ++ слабая активность; +++ средняя активность; ++++ сильная активность.
Ряд штаммов с антифунгальным действием отличались высокой ферментативной активностью по трем (BZR 413 и BZR 658), а также по двум группам гидролитических ферментов (BZR 336-г, BZR 336-с, BZR 187, BZR 277, BZR 337, BZR 416, BZR 435, BZR 441, BZR 462, BZR 472, BZR 480, BZR 523, BZR 537 и BZR 538) (табл. 3).
Таким образом, установлено, что выделенные и исследованные штаммы бактерий активно подавляют in vitro развитие фитопатогенного гриба F. graminearum, одного из самых вредоносных возбудителей фузариоза озимой пшеницы. Проведенные исследования открывают перспективы использования в сельскохозяйственной практике новых агентов биоконтроля возбудителей фузариоза озимой пшеницы с последующей разработкой технологий получения и применения новых биопрепаратов полифункционального типа действия.
Заключение
В результате скрининга по признаку антифунгальной активности в отношении одного из наиболее вредоносных представителей грибов рода Fusarium (F. graminearum) для озимой пшеницы из 530 бактериальных культур отобрано 30 штаммов в качестве возможной основы биопрепаратов с высокой степенью ингибирования тест-культуры: 41,7-61,9%.
Выявлены две группы штаммов бактерий по механизму антифунгального действия в отношении гриба F. graminearum:
- штаммы, образующие стерильную зону антагонистического действия;
- штаммы, ингибирующие развитие патогена, занимая большую площадь питательной среды ЧП (гиперпаразитизм).
Отмечены существенные морфологические изменения патогенного гриба под воздействием вторичных метаболитов перспективных бактериальных штаммов: отсутствие воздушного мицелия, лизис и
израстание уже сформировавшегося мицелия, ингибирование роста и потемнение мицелия патогена.
Установлено, что штаммы с высокой антифунгальной активностью в отношении гриба F. graminearum проявляли способность к синтезу нескольких групп гидролитических ферментов.
Работа выполнена при финансовой поддержке МЦП ЕврАзЭС «Инновационные биотехнологии» на 2011-2015 гг. Министерства образования и науки РФ, государственный контракт № 16.М04.11.0026.
Литература
1. Калько Г.В. Биологические обоснование создания биопрепаратов, эффективных в отношении фузариозных заболеваний сельскохозяйственных культур: автореф. дис. ... канд. биол. наук. СПб, 1996. - 22 с.
2. Иващенко В.Г., Шипилова Н.П., Назаровская Л.А. Фузариоз колоса хлебных злаков. СПб., 2004. - 164 с.
3. Маслиенко Л.В., Мурадасилова Н.В. Изыскание и первичный скрининг штаммов грибов-антагонистов возбудителей фузариоза // Науч.-технич. бюлл. ВНИИ маслич. культур. - Краснодар, 2002. - Вып. 126. - С. 29-35.
4. Stepwise screening of microorganisms for commercial use in biological control of plant-pathogenic fungi and bacteria / KDhl J., Postma J., Nicot P., et al.// Biological control. -2011. - Vol. 57. - P. 1-12.
5. Ваксман З.А. Антагонизм микробов и антибиотические вещества. М.: Гос. изд-во иностр. лит., 1947. - 391 с.
6. Егоров Н.С. Выделение микробов-антагонистов и биологические методы учета их антибиотической активности. М.: Изд-во Моск. ун-та,1957. - 78 с.
7. Selection of bioantagonistic bacteria to be used in biological control of Risoctonia solani in tomato/ Montealegre J.R., Reyes R., Perez L.M. et al. // Electronic Journal of Biotechnology. - 2003. - Vol. 6, № 2. - P. 116-127.
8. Лысак Л.В., Добровольская Т.Г., Скворцова И.Н. Методы оценки бактериального разнообразия почв и идентификации почвенных бактерий. М.: МАКС Пресс, 2003. - 120 с.
9. Недорезков В.Д. Биологическое обоснование применения эндофитных бактерий в защите пшеницы от болезней на Южном Урале: автореф. дис. ... док. биол. наук. СПб.-Пушкин, 2003. - 42 с.
10. Нетрусов Ф.И. Практикум по микробиологии. М.: Издательский центр «Академия», 2005. - 608 с.
11. Возняковская Ю.М., Труфанова А.К. Взаимодействие Helminthosporium sativum - возбудителя корневой гнили культур с сапрофитными почвенными бактериями // Микология и фитопатология. - 1988. - Т. 22, № 2. - С. 157-161.
12. Сукцессия хитинолитических микроорганизмов в черноземе / Манучарова Н.А., Белова Э.В., Воробьев А.В. и др.// Микробиология. - 2005. - Т. 74, № 5. - С. 693-698.
13. Выделение и фенотипическая характеристика ростостимулирующих ризобактерий (PGPR), сочетающих высокую активность колонизации корней и ингибирования фитопатогенных грибов / Кравченко Л.В., Макарова Н.М., Азарова Т.С. и др. // Микробиология. - 2002. - Т. 71, № 4. - С. 521-525.
14. Широков А.В. Миколитические ферменты бактерий Bacillus Cohn и их роль в антагонизме к почвенным микромицетам: автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Уфа, 2004. - 22 с.
