Отбор аптамеров к маркеру различных заболеваний _2-микроглобулину методом ce-selex Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 577

ОТБОР АПТАМЕРОВ К МАРКЕРУ РАЗЛИЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Р2-МИКРОГЛОБУЛИНУ МЕТОДОМ CE-SELEX

© 2016 И. П. Харичкина 1, В. И. Панфилов 2, А. Ш. Жаббарова 3, А. С. Харичкин 4, П. Е. Кузнецов5

1 аспирант кафедры биотехнологии e-mail: [email protected] 2 д.т.н., профессор, зав. кафедрой биотехнологии

3 ст. преподаватель каф. биотехнологии

Российский химико-технологический университет Д.И. Менделеева

4 канд. химических наук, доц. каф. химии

e-mail: [email protected] 5 д.х.н., профессор каф. химии

Курский государственный университет

В данной статье представлен опыт получения аптамеров к белку р2-микроглобулину, который является маркером для различных заболеваний: почечная недостаточность, аутоиммунные расстройства, отторжение трансплантата, В-клеточная лимфома, множественная миелома, вирусные инфекции, в том числе ВИЧ, цитомегаловирусная инфекция. Селективные аптамеры к белку р2-микроглобулину получены методом CE-SELEX. Показана возможность создания новых, высокоэффективных, простых и недорогих средств детекции р2-микроглобулина для диагностики и терапии.

Ключевые слова: аптамер, биомаркер, CE-SELEX.

В настоящее время проблема успешного прогноза в лечении большинства заболеваний является наиболее актуальной. Методы лабораторной диагностики на сегодняшний момент не доступны большому кругу населения, и подобные анализы занимают достаточно продолжительный период времени. Благодаря прогрессу в области молекулярной биотехнологии появились принципиально новые подходы на основе различных биомаркеров, которые обладают высокой специфичностью к своим молекулярным мишеням.

В последнее время новый подход в диагностике связан с технологией получения искусственных антител, названных аптамерами, как средств детекции, визуализации, адресной терапии и диагностики опухолевых и других заболеваний [Zhou, Rossi 2008; Zhou, Rossi 2009; Zhou, Rossi 2010]. Аптамеры представляют собой короткие олигонуклеотиды (25-100 нт), которые получают из пула случайных последовательностей, способных к формированию уникальных разнообразных третичных структур, аффинному и специфичному связыванию и ингибированию белковых мишеней [Ni, Castañares 2011]. Аптамеры имеют константные, для амплификации, и вариабельный участки. Вариабельный участок представляет собой область случайных нуклеотидных последовательностей, которая способна взаимодействовать с функциональными группами мишени, образуя водородные связи,

тем самым определяя способность аптамеров к специфическому связыванию [Ellington 1990].

По сравнению с моноклональными антителами аптамеры имеют ряд существенных преимуществ: химически синтезируются и модифицируются, лучше проникают в ткани и клетки и в десятки раз дешевле [Nakamura, Ishiguro 2012]. Существенным прорывом в технологии аптамеров стало одобрение в 2004 г. в США первого лекарственного средства для лечения склеротической дегенерации сетчатки на основе аптамеров к фактору роста сосудистого эндотелия (pegaptanib) - VEGF (vascular endothelial growth factor) под коммерческим названием Macugen фирмой Ophthotech. На данный момент этот препарат остается единственным утвержденным агентством Министерства здравоохранения и социальных служб США [Ng, Shima 2006]. На 3-й стадии были прекращены клинические испытания препарата, содержащего аптамер pegnivacogin к фактору IXa, предотвращающего свертывание крови, так как у 10 пациентов из 1605 была выявлена тяжелая аллергическая реакция (включая один фатальный случай) [Linkoff 2016]. Однако последние анализы на существующих образцах показали, что тяжелая аллергическая реакция была вызвана высоким уровнем анти-ПЭГ (полиэтиленгликоль) антителами, а не самим аптамером [Ganson 2015]. Одновременно на 2/3 фазах клинических испытаний находится препарат Fovista (компании Ophthotech), обычно называющийся pegpleranib (раньше Е10030), аптамер к фактору роста сосудистого эндотелия (VEGF), как и Macugen, для лечения склеротической дегенерации сетчатки [Green 1996]. Также на 2-й стадии клинических испытаний находятся шпигельмеры (зеркальные аналоги аптамеров): NOX-H94 -ингибитор белка гепсидина; NOX-A12 - ингибитор белка хемокина подсемейства CXC, участвующего в пролиферации клеток; NOX-E36 - ингибитор цитокина CCL2 (C-C motif ligand 2) [Klussman 1996; Vater 2015].

В данной статье представлен опыт получения аптамеров к белку ß2-микроглобулину (b2m), который находится на поверхности почти всех клеток организма человека и животных. Он присутствует в большинстве физиологических жидкостей, его уровень в сыворотке крови повышается при множественной миеломе, лимфоме и при воспалительных процессах в организме. В норме содержание b2m в сыворотке крови составляет 0,6-3 мг/мл, а в моче - 0,04-0,25 мг/мл и не зависит от времени суток.

Анализ in vitro на ß2-микроглобулин не позволяет диагностировать заболевание, однако дает дополнительную информацию относительно вероятного развития болезни. ß2-микроглобулин ассоциируется с опухолевой массой и может помочь дать прогноз раковых заболеваний, определить стадию болезни, оценить эффективность лечения. Также используется для оценки степени повреждения почек, помогает выявить признаки отторжения трансплантата, степень поражения центральной нервной системы [Москалец 2011].

К настоящему времени описаны и используются различные иммунологические методы определения концентрации b2m: ракетный иммуноэлектрофорез, иммунонефелометрия, иммунолатекс, радиоиммунологический и иммуноферментные анализы. Для проведения данных анализов необходимы антитела, что автоматически связано с рядом сложностей: дороговизна, антитела могут отличаться в разных партиях и имеют маленький срок хранения, а анализы требуют достаточно продолжительного периода времени. Поэтому существует необходимость создания дешевых, быстрых и общедоступных методов детекции b2m для лабораторной диагностики.

Материалы и методы

Выделение и очистка белка ß2-микроглобулина

Харичкина И. П., Панфилов В. И., Жаббарова А. Ш., Харичкин А. С., Кузнецов П. Е.

Отбор аптамеров к маркеру различных заболеваний р2-микроглобулину

методом CE-SELEX

Для селекции аптамеров использовали рекомбинантный белок b2m человека, выделенный в нативных условиях из клеток Escherichia coli BL21(DE3). Белок очищали в две стадии: сначала на ионообменной колонке HiPrep DEAE 16/10 (GE Halthcare) в буферном растворе 50 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, pH=8,0; далее на металлафинной колонке HisPrep FF 16/10 (GE Halthcare, Швеция) в буферном растворе 50 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, pH=8,0 и градиентом имидазола.

Изучение конформации белка (52-микроглобулина и ДНК-аптамеров методом кругового дихроизма (КД)

Спектры КД записывали, используя дихрограф Chirascan plus (Applied Photophysics). Спектры поглощения регистрировали на дихрографе Chirascan одномоментно с регистрацией спектров КД. Измерения проводились в диапазоне длин волн от 185 до 300 нм, с шагом 1 нм при спектральной ширине щели 1 нм и постоянной времени прибора в 3 секунды. Термостатирование образцов осуществляли при помощи Пелтье термостата, входящего в комплект дихрографа. Регистрацию спектров КД проводили в кварцевых разборных 0,01 см кюветах (Helma) при концентрации порядка 2 мг/мл. Использовался фосфатный буферный раствор (10мМ Na2HPO4, 10мМ NaH2PO4) рН=7,0. Измеренные спектры корректировали на базовую линию прибора, которую предварительно регистрировали с использованием того же буферного раствора и той же кюветы. Спектры КД представлены в единицах удельной эллиптичности.

Спектры КД записывали, используя спектрополяриметр Chirascan plus (Applied Photophysics). Спектры регистрировали в диапазоне длин волн от 220 до 340 нм, с шагом 1 нм, при спектральной ширине щели 1 нм и постоянной времени прибора в 2 сек. Термостатирование образцов осуществляли, прокачивая через держатель кюветы теплоноситель жидкостного термостата. Регистрацию спектров КД проводили в стандартных условиях (10 мМ фосфатный буферный раствор pH=7,0) при суммарной концентрации олигонуклеотидов 2 нМ в 1 см кварцевой кювете. Концентрацию олигонуклеотидов определяли двумя методами: 1) на флуориметре Qubit 2.0; 2) методом КЭФ на биоанализаторе Agilent Bioanalyzer 2100. Измеренные спектры корректировали на базовую линию прибора, которую предварительно регистрировали в диапазоне 200-360 нм с использованием того же буферного раствора и той же кюветы. Спектры КД представлены в единицах удельной эллиптичности.

Селекция аптамеров

Селекция аптамеров проводилась методом CE-SELEX (capillary electrophoresis systematic evolution of ligands by exponential enrichment - систематическая эволюция лигандов при экспоненциальном обогащении с применением капиллярного электрофореза) [Mosing 2009]. В каждом цикле комплексы олигонуклеотидов с мишенью отделяли от несвязавшихся молекул с помощью капиллярного электрофореза (КЭФ) в нативных условиях на автоматизированной системе P/ACE MDQ (Beckman Coulter). Для увеличения избирательности аптамеров применяли метод чередования позитивной и негативной селекции. В качестве отрицательной мишени использовали бычий сывороточный альбумин (БСА) (Sigma-Aldrich), а в качестве положительной -Р2-микроглобулин. БСА растворяли в 50 мМ боратном буферном растворе pH=8,5 (Beckman Coulter) и хранили при 4°С. Этот же буферный раствор использовали для разделения молекул методом КЭФ. В качестве исходного олигонуклеотидного пула использовали ДНК-библиотеку (ЗАО «Евроген»), содержащую последовательность 5'-ATGTCCAGCGTCAGGTCCG-(N)20-CGCAGCAATAGCCAAGTCATT-3' (где (N)20 -20 случайных нуклеотидов вариабельного района, фланкированного с двух сторон фиксированными последовательностями по 20 нуклеотидов каждая, которые в дальнейшем используются в качестве праймеров для ПЦР-амплификации). Отбор

аптамеров заключает в себе 14 повторяющихся циклов. После каждого цикла обогащенный пул олигонуклеотидов амплифицируют, далее цепи двухцепочечной ДНК (дцДНК) разделяют на магнитных частицах со стрептавидином (Invitrogen). Полученные одноцепочечные ДНК-олигонуклеотиды (оцДНК) используют в следующих циклах отбора.

Клонирование и секвенирование

Обогащенный пул аптамеров клонируют в вектор pAL-TA (ЗАО «Евроген»), секвенируют с использованием набора BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems) и капиллярного секвенатора ABI Hitachi 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Данные анализируют при помощи программного пакета Vector NTi v.10.

Результаты и обсуждения

Для селекции аптамеров рекомбинантный белок b2m был выделен в нативных условиях (рис. 1).

кДа m Ь2т

225 _

140 Г

100 ——'

10 ---

Рис. 1. Электрофорез по Лэмлли рекомбинантного белка р2-микроглобулина, выделенного в нативных условиях, где m - маркер молекулярного веса

Первичную структуру белка подтверждали с помощью МС/МС-анализа. Для идентификации белка необходимо проведение предварительной процедуры протеолитического разложения по стандартной методике трипсинолиза.

Полученный раствор анализировали методом тандемной масс-спектрометрии на масс-спектрометре Q Exactive высокого разрешения в комплексе с системой жидкостной хроматографии сверхвысокого давления UltiMate 3000 binary RSLC (Thermo Scientific).

Расшифровка МС/МС-спектров осуществлена с использованием специального программного обеспечения Proteome Discoverer 1.4 фирмы Thermo Scientific с базой данных аминокислотных последовательностей NCBInr.fasta. Протоколы по результатам идентификации исследуемого белка приведены в таблицах 1-2 и на рисунке 2.

Таблица 1

Протокол идентификации исследуемого белка р2-микроглобулина _с применением программы Proteome Discoverer 14_

Описание Score Покрытие Количество пептидов M, кДа Изоэлектрическая точка

Beta-2-microglobulin OS=Homo sapiens 177.97 85.71 % 11 13.7 6.52

Харичкина И. П., Панфилов В. И., Жаббарова А. Ш., Харичкин А. С., Кузнецов П. Е.

Отбор аптамеров к маркеру различных заболеваний р2-микроглобулину

методом CE-SELEX Таблица 2

Аминокислотные последовательности обнаруженных пептидов в р2-микроглобулине с применением программы Proteome Discoverer 1.4

№ Аминокислотная последовательность пептида

1 VEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEK

2 DWSFYLLYYTEFTPTEK

3 VEHSDLSFSK

4 VNHVTLSQPK

5 SVALAVLALL SL SGLEAIQR

6 HPAENGK

7 VNHVTL SQPKIVK

8 IQVYSR

9 SNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLK

10 IEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEK

11 NGER

1 11 21 31 41 ftl

MSÍSVALAVL ALLSLSCLEA ion! trian SRHPAZMGKS HTLHCYVSCF HPSDIZVCLL

«1 71 •1 »1 101 111

КНСЕЯГЕКУЕ Н5СЬ5Г5К1М ЭГУИЛТГХГ ТРТТХПУАС ЯУНН\ГГЬЭОР КГУККОЯПК

Рис. 2. Сравнение идентифицированных пептидов с аминокислотной последовательностью целевого белка, найденного по базе данных КСБ1пг.1^1а

Наличие вторичной структуры было подтверждено методом кругового дихроизма.

Измеренный спектр КД Р2-микроглобулина человека представлен на рисунке 3.

4

^ 1 л ¿

0

1

в л

10 а

А

2 -2

-4

190 200 210 220 230 240 250

Длена волны (нм)

Рис. 3. Спектры КД р2-микроглобулина человека в сравнении с литературными данными [Heegaard 2001]

Для определения вторичной структуры измеренных спектров КД предварительно была рассчитана среднеквадратичная близость спектра Р2-микроглобулина человека с каждым из 110 реперных спектров программы. По критерию минимальной близости к исследуемому спектру были отобраны 26 белков.

-fii-im цмоюбупв [HÍÍOJTÍ 20 01:

/*

Для определения погрешности расчета из этой выборки поочередно исключался каждый белок, и его вторичная структура определялась по оставшимся 25 белкам.

Результаты расчета вторичной структуры р2-микроглобулина по спектрам КД рисунка 3 представлены в таблице 3.

Таблица 3

Процентное содержание основных элементов вторичной структуры в2-микроглобулина человека, рассчитанных из спектров КД_

а-спираль 3/10 спираль ß-структуры ß -изгибы Остальные структуры Z

b2m 2 3 47 12 39 103

b2m человека [Heegaard 2001: 32657-32662] 0 3 56 11 40 110

X-ray (PDB: 2YXF) 0 0 51 11 38 100

Среднеквадратичная ошибка в выборке из 26 белков 4.3 2.3 6.9 3.1 5.4

Видно, что отличие результатов расчета по спектрам КД от данных X-ray анализа лежит в пределах погрешности метода расчета.

Селекцию аптамеров к b2m человека осуществляли путем чередования позитивной и негативной технологии CE-SELEX, поскольку данная технология позволяет выбрать наиболее специфичные для белка-мишени аптамеры и исключить олигонуклеотиды, способные связываться с БСА («отрицательная» мишень). Один цикл отбора содержал в себе несколько последовательных операций (рис. 4).

Отделение несвязавшихся Позитивная селекция с аптамеров

Р2-микроглобулином человека

связывание

Отделение несвязавшихся ' аптамеров

i

У\

Негативная селекция с бычим сывороточным

альбумином

V

Отделение

связавшихся

аптамеров

Амплификация

отобранных

аптамеров

связывание

£ библиотека

оцДНК-

!

Разделение дцДНК после ПЦР на магнитных частицах для получения оцДНК

ЗТАА—

Бактериальное клонирование

Секвенирование

Рис. 4. Один цикл отбора аптамеров к ß2-микроглобулину человека методом CE-SELEX

Библиотеку ДНК-олигонуклеотидов термостатировали 4 мин при 95°С, затем охлаждали 4 мин при 4°С. Далее ДНК-библиотеку инкубировали с ß2-

Харичкина И. П., Панфилов В. И., Жаббарова А. Ш., Харичкин А. С., Кузнецов П. Е.

Отбор аптамеров к маркеру различных заболеваний р2-микроглобулину

методом CE-SELEX

микроглобулином при 4°С в течение 30 мин. Затем методом КЭФ отделяли комплексы аптамеров с мишенью от несвязавшихся олигонуклеотидов. Обогащенную ДНК-библиотеку вновь термостатировали, после чего инкубировали с БСА в течении 30 мин при 4°С и методом КЭФ отделяли комплексы аптамеров с БСА от несвязавшихся аптамеров. С несвязавшимися аптамерами проводили асимметричную реакцию амплификации в термоциклере с праймерами P1(ATGTCCAGCGTCAGGTCCG) и P2 (AATGACTTGGCTATTGCTGCG-биотин), комплементарными константным участкам ДНК-библиотеки. Наличие продуктов реакции амплификации подтверждали методом электрофореза в агарозном геле с бромистым этидием.

После амплификации цепи дцДНК разделяли на магнитных частицаx со стрептавидином (Invitrogen). Полученные оцДНК использовали в следующих циклах отбора. Отбор аптамеров осуществлялся на протяжении 14 повторяющихся циклов.

После последнего цикла полученную обогащенную библиотеку клонировали и секвенировали. В результате чего были получены 6 уникальных последовательностей олигонуклеотидов. Методом кругового дихроизма подтверждено наличие вторичной структуры полученных олигонуклеотидов (рис. 5).

Длина волны (нм)

Рис. 5. Температурные серии спектров КД ДНК-олигонуклеотидов в буферном растворе

Все аптамеры имели одинаковую форму спектров КД, характерную для В-формы ДНК. Об этом свидетельствует наличие положительной полосы с максимумом около 280 нм и коротковолнового отрицательного минимума около 250 нм, а также точки нулевой эллиптичности вблизи 260 нм для олигонуклеотидов в одноцепочечном состоянии.

Исследование влияния температуры на структуру олигонуклеотидов показывает, что при увеличении температуры происходит снижение амплитуд КД-сигнала, что связано с частичным разрушением одноцепочечного стэгинга, реализация которого при более низких температурах обусловливает главным образом удержание гетероциклических оснований в стопке [Иванов 1973].

Для отобранных аптамеров был проведен расчет наиболее вероятной вторичной структуры с помощью онлайн-программы DNA Folding form (http://www.mfold.rna) (рис. 6).

А 1

А 2

А 3

А 4

А 5

А 6

А Т

60

7 С

а' Q

40 С,

„т ctgaöcö

Vi А ¿-¿-А I

X

о-

О G. С

se О х

0 Т.

Т А

V

Я G

С С С т G

°д-с

V *

Ю

Рис. 6. Результаты расчета наиболее вероятной вторичной структуры оцДНК (DNA Folding form), где А_1, А_2, А_3, А_4, А_5, А_6 - отобранные аптамеры

Харичкина И. П., Панфилов В. И., Жаббарова А. Ш., Харичкин А. С., Кузнецов П. Е.

Отбор аптамеров к маркеру различных заболеваний р2-микроглобулину

методом CE-SELEX

Отобранные ДНК-аптамеры исследовали на специфичность к Ь2ш методом ЭФ в 1% агарозном геле в присутствии бромистого этидия (рис. 7).

М<Ц<Щ<Ч< в ц, б <

цзи о г3 о

3 <1 <[ <( <[ < С1 V <[ -и1 -г:1 ^ V 1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 11 12 13 14 15

bp

200 100 50 20

Рис. 7. Анализ результатов ЭФ в 1%-м агарозном геле, где 1 - маркер; 2, 11 - аптамеры А_1 и А_5; 3, 5, 7, 9, 12, 14 - аптамеры А_1-А_6, инкубированные с р2-микроглобулином; 4, 6, 8, 10, 13, 15 -аптамеры А_1-А_6, инкубированные с БСА «отрицательный» контроль

Как видно из рисунка 7, отобранные аптамеры связываются с целевой мишенью и не связываются с «отрицательным» контролем.

Заключение и выводы

Было отобрано семейство аптамеров, специфичных к маркеру различных заболеваний р2-микроглобулину. Таким образом, показана возможность создания на основе метода CE-SELEX новых, селективных, простых и недорогих лигандов к маркеру р2-микроглобулину с целью диагностики и терапии различных заболеваний.

Библиографический список

Ellington AD, Szostak JW. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands // Nature. 1990. V. 346. № 6287. P. 818-822.

Ganson N.J., Povsic T.J., Sullenger B.A., et al. Pre-existing anti-polyethylene glycol antibody linked to first-exposure allergic reactions to pegnivacogin, a PEGylated RNA aptamer // J. Allergy Clin. Immunol. 2015. V. 137 (5). P. 1610-1613. e7.

Green L.S., JellinekD., Jenison R., Ostman A., Heldin C.H., Janjic N. Inhibitory DNA ligands to platelet-derived growth factor B-chain // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 1441314424.

Klussmann S., Nolte A., BaldR., Erdmann V.A., Fuerste J.P. Mirror-image RNA that binds D-adenosine // Nat. Biotechnol. 1996. V. 14. P. 1112-1115.

Lincoff AM, Mehran R, Povsic TJ. Effect of the REG1 anticoagulation system versus bivalirudin on outcomes after percutaneous coronary intervention (REGULATE-PCI): a randomised clinical trial. // Lancet. 2016. V. 387. P. 349-356.

Nakamura YIshiguro A1 Miyakawa S RNA plasticity and selectivity applicable to therapeutics and novel biosensor development // Genes to Cells. 2012. №17 (5). P. 344-364.

Ng E.W., Shima D.T., Calias P., Cunningham Jr. E.T., Guyer D.R., Adamis A.P. Pegaptanib, a targeted anti-VEGF aptamer for ocular vascular disease // Nat. Rev. Drug Discov. 2006. V. 5. P. 123-132.

Ni X., Castanares M., Mukherjee A., Lupold S.E. Nucleic acid aptamers: clinical applications and promising new horizons // Curr. Med. Chem. 2011. V. 18 (27). P. 42064214.

Heegaard, N.H.H., Sen, J.W., Kaarsholm, N.C. and Nissen, M.H. Conformational intermediate of the amyloidogenic protein beta2-microglobulin at neutral pH // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 32657-32662.

Renee K. Mosing, Michael T. Bowser. Isolating aptamers using capillary electrophoresis SELEX (CE-SELEX) // Meth. In Mol.biol. 2009. V. 535 P. 33-45.

Vater A., Klussman S. Turning mirror-image oligonucleotides into drugs: the evolution of Spiegelmer® therapeutics // Drug Discov. Today. 2015. V. 20. Р. 147-155.

J. Zhou and J. J. Rossi. Aptamer-Targeted Cell-Specific RNA Interference // Silence. 2010. V. 1. No. 1. P. 4.

J. Zhou and J. J. Rossi. Bivalent Aptamers Deliver the Punch // Chemistry & Biology. 2008. V. 15. No. 7. P. 644-645.

J. Zhou and J. J. Rossi. The Therapeutic Potential of Cell-Internalizing Aptamers // Current topics in Medicinal Chemistry. 2009. V. 9. No. 12. P. 1144-1157.

Иванов В.И. Круговой дихроизм и структура комплементарных нуклеиновых кислот // Молек. биология. М.: ВИНИТИ 1973. С. 105-140.

Москалец А.И., Щербина О.В. Опухолевые маркеры в лабораторной диагностике // Лаб. Диагностика. 2011. №1 (55), С. 13-18.

Шубин В.В., Хазин М.Л., Ефимовская Т.В. Определение вторичной структуры глобулярных белков по спектрам кругового дихроизма // Мол. Биол. 1991. № 24. С. 189-201.