От синтетических полиэлектролитов к полимер-субъединичным вакцинам Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, Серия А, 2004, том 46, № 5, с. 759-782

УДК 541(13+64)

ОТ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ К ПОЛИМЕР-СУБЪЕДИНИЧНЫМ ВАКЦИНАМ1

(Обзор) ©2004 г. В. А. Кабанов

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова Химический факультет 119992 Москва, Ленинские горы

Дан обзор многолетних исследований в области применения синтетических полиэлектролитов в иммунологии. Было обнаружено, что линейные синтетические полиэлектролиты самого различного строения, не являющиеся структурными аналогами биополимеров, а потому незнакомые иммунной системе, оказывают на нее очень существенное влияние при введении в организм. Они заметно интенсифицируют образование в костном мозге, последующую миграцию и расселение в организме стволовых клеток - предшественников всех функциональных иммунных клеток. Кроме того, синтетические полиэлектролиты, сами не будучи антигенами, при введении совместно с типичными антигенами (белками, природными микробными полисахаридами и их синтетическими аналогами) в несколько раз усиливают выработку антител, комплементарных введенным антигенам, т.е. служат в качестве стимуляторов иммунного ответа. В дальнейшем было показано, что синтетические полиэлектролиты запускают иммунную систему по механизму, обычно не используемому природой. Поэтому эффективность защитной реакции организма становится неподконтрольной генам иммунного ответа: у плохо и хорошо генетически защищенных особей он оказывается одинаково сильным. В основе альтернативного запуска лежит общее свойство линейных полиэлектролитов агрегировать сорбируемые ими белки (в данном случае те, что встроены в клеточные мембраны В-клеток, синтезирующих антитела). Был разработан нетоксичный иммуностимулятор: сополимер 1,4-этиленпи-перазин-ГЧ-оксида и (^карбоксиметилен)-1,4-этиленпиперазиний бромида (фирменное название "По-лиоксидоний"), разрешенный для введения человеку. Однако кардинальным шагом на пути к вакцинам нового поколения стало обнаружение биологического эффекта конъюгирования синтетических полиэлектролитов с микробными антигенами. В отличие от простых смесей конъюгаты усиливают иммунный ответ в десятки и сотни раз. При этом предварительная иммунизация защищает животных от абсолютно смертельных доз соответствующих бактерий и вирусов. Конъюгат "полиоксидония" с гемагглю-тинином и нейраминидазой (белковыми субъединицами вируса гриппа) стал первой в мире непастеровской вакциной "Григаюл", успешно применяемой в России (около 50 млн. прививок в последние 7 лет). В обзоре рассмотрены физико-химические механизмы биологического действия упомянутых соединений и перспективы дальнейшего использования разработанного подхода.

ВВЕДЕНИЕ

30 с небольшим лет назад случай свел меня с Рэмом Петровым, к тому времени уже видным иммунологом. Оба мы были еще молоды и не отягощены традиционным мышлением. А потому решили дерзнуть и не поленились проверить возникшую у нас, как многим в ту пору показалось бы, пустую идею: использовать синтетические полиэлектролиты (СПЭ), не являющиеся да-

1 Пленарная лекция на 17-м Менделеевском съезде по общей и прикладной химии, Казань, 21-26 сентября 2003г.

E-mail: Kabanov@genebee.msu.ru (Кабанов Виктор Александрович).

же далекими аналогами биополимеров, в качестве компонентов для целенаправленного воздействия на иммуногенез. К тому времени было уже хорошо известно, что чужеродные природные полиэлектролиты (белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты) и их структурные синтетические аналоги (полипептиды, полинуклеотиды), попав в организм, проявляют свойства антигенов. Это значит, что иммунные клетки узнают их специфические фрагменты (антигенные детерминанты) и в ответ вырабатывают структурно комплементарные белки - антитела, которые блокируют эти антигены. Было известно также, что природные полиэлектролиты (полисахариды, на-тивные нуклеиновые кислоты, двуспиральные

синтетические полинуклеотиды), кроме того, активируют иммунную систему по отношению к другим антигенам, т.е. служат в качестве иммуностимуляторов [1-3]. Нам же захотелось узнать, как иммунная система реагирует на незнакомые ей СПЭ, химическая структура которых ничем не напоминает биополимеры. Тогда я передал иммунологам два простых СПЭ винилового ряда, которые в тот момент оказались под рукой: полиакриловую кислоту (ПАК) и поли-4-винилпиридин (ПВП). Первый полимер способен диссоциировать в водной среде с образованием полианиона, второй - присоединять протоны, образуя соответствующие поликатионы. Эти полимеры мы тогда готовили в достаточно больших количествах и изучали на кафедре высокомолекулярных соединений химического факультета МГУ, преследуя совершенно иные цели.

АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ МЕХАНИЗМ АКТИВАЦИИ ИММУННЫХ КЛЕТОК

Заслуживающие внимания результаты были получены уже в первых сериях опытов, проведенных на мышах. Как и следовало ожидать, незнакомые организму молекулярные цепи ПВП и ПАК сами по себе не были иммуногенны. Однако введение их водных растворов в кровь заметно интенсифицировало образование в костном мозге так называемых стволовых клеток - предшественников всех функциональных клеток иммунной системы, их миграцию и расселение в организме [4]. Кро-

ме того, оказалось, что и ПАК и ПВП, не будучи антигенами, при введении совместно с эритроцитами барана в несколько раз усиливают иммунный ответ на этот типичный тестовый антиген, т.е. служат в качестве иммуностимуляторов [5]. На самом деле иммуностимулирущее действие ПАК in vivo еще несколько ранее было обнаружено Diamanstein и др., испытавшими ее наряду с многочисленными природными полианионами [6]. Тогда они не придали этому факту особого значения. Нам же при анализе наших данных показалось удивительным, что поли-ионы ПАК и ПВП, цепи которых построены из мономерных звеньев различного химического строения и даже различаются знаком заряда, тем не менее, примерно в одинаковой степени стимулируют иммунный ответ.

На этом этапе стало ясно, что игра стоит свеч и проблема заслуживает дальнейшей разработки в качестве специального проекта. Тогда мы организовали группу из нескольких химиков - выпускников химического факультета МГУ и иммунологов из числа учеников Р.В. Петрова, среди которых P.M. Хаитов вскоре стал играть ведущую роль. Усилия группы были целиком направлены на синтез и выяснение механизма действия СПЭ как иммуностимуляторов. Расширив круг СПЭ, мы убедились, что подобно ПВП и ПАК действуют и многие другие химические структуры. Ниже приведены формулы лишь некоторых из них.

(_сн2-сн-)п (-сн2-сн-)п

I

соон

Полиакриловая кислота

(-сн2-сн-)„

СН3

Поли-2-метил-5-винилпиридин

-ch2-ch2-n

С2Н5 Поликатион 1

Поли-4-винилпиридин

У X-с2Н5

Четвертичная соль поли-4-винилпиридина

CH2-CH2-N

ch,-ch,-n

СН2С6Н5

Поликатион 2

Четвертичные соли поликонидия

Все изображенные выше полиэлектролиты в несколько раз усиливали иммунный ответ мышей на эритроциты барана. Дальнейшие исследования показали, что структурное разнообразие потенциальных иммуностимуляторов в ряду СПЭ практически не ограничено.

Этот неожиданный результат позволил предположить, что различные СПЭ воздействуют на иммунную систему по какому-то общему механизму, связанному с их полимерной природой, в частности со способностью макромолекул СПЭ к многоцентровому взаимодействию с иммунными клетками. Предположение подтвердилось. Рисунок 1 показывает, что низкомолекулярные аналоги типичных СПЭ-иммуностимуляторов не проявляют никакой активности при испытаниях in vivo. Эффект возникает лишь по достижении некоторых достаточно высоких значений степени полимеризации [7-9].

Известно, что для запуска естественного процесса выработки антител в организме требуется весьма сложное специфическое взаимодействие (кооперация) нескольких разновидностей иммунных клеток [10, 11]. Упрощенная схема такой кооперации представлена на рис. 2 [10]. Основные ее участники: Т-лимфоциты-помощники (ТА), ан-тигенпредставляющие клетки (АРС) (макрофаги -одна из их разновидностей), а также В-лимфоци-ты - клетки, производящие антитела. Все они формируются путем дифференциации расселившихся стволовых клеток. ТА-лимфоциты формируются в тимусе (зобной железе). В ходе формирования и развития они "обучаются" отличать попавшие в организм чужие антигены от своих собственных тканей (верхняя часть схемы). Для этого клетка синтезирует белковые рецепторы, которые располагаются на ее поверхности. Рецептор каждого ТА-лимфоцита способен участвовать в узнавании только одного антигена, вернее его характеристического фрагмента - антигенной детерминанты. Столь же специфичные узнающие рецепторы присутствуют и на поверхности В-лимфоцитов, сформировавшихся в костном мозге. Однако между рецепторами В- и ТА-клеток существует принципиальное различие. Первый самостоятельно узнает структурно комплементарную ему антигенную детерминанту. Второму для узнавания необходим соучастник - пептид строго определенной структуры (двойное узнавание). Структура эта запрограммирована в генах

АОК/АОКо 71-

(а)

5-

3-

1с:—Н"

5 10 25 40 100 1000

п

АОК/АОК0

п

Рис. 1. Зависимость относительного числа АОК в селезенке мышей от степени полимеризации поликатиона 1 (У), поликатиона 2 (2) (а) и ПАК (б). Доза антигена (эритроцитов барана) 5 х 106, доза иммуностимулятора 50 мг/кг.

иммунного ответа (Ш-генах), которые входят в состав главного комплекса гистосовместимости. Иными словами, чтобы ТА-лимфоцит узнал чужой антиген, геном данной особи должен содержать соответствующий 1Я-ген. Попавший в организм антиген захватывается АРС-клеткой. Там он расщепляется на фрагменты, пригодные для взаимодействия с узнающими рецепторами ТА- и В-лимфоцитов. Там же с участием Ж-гена синтезируется упомянутый выше вспомогательный пептид. Затем АРС-клетка представляет ^-лимфоциту узнаваемую им комбинацию, состоящую из фрагмента антигена и Ш-ген зависимого пептида, а В-лимфоциту - только узнаваемый им антигенный фрагмент. Создавшаяся таким образом стартовая ситуация изображена в средней части схемы рис. 2. В этой ситуации ТА-лимфоцит посы-

Созревание и обучение Т-лимфоцитов в тимусе

Двойное узнавание

(Р. Цинкернагель и др., Нобелевская премия 1996 г.) и Генетический контроль силы иммунного ответа

(Б. Бенацерров, Нобелевская премия 1980 г.)

Синтез и выделение антител В-лимфоцитами

Рис. 2. Взаимодействие иммунных клеток при образовании специфических антител в ответ на введение антигена [10].

лает в "помощь" В-лимфоциту сигнал в виде особого пептида-медиатора (цитокина). Лишь после получения такого сигнала В-лимфоциты начинают размножаться и продуцировать антитела, т.е. включается специфический иммунный ответ на попавший в организм антиген (нижняя часть схемы). Понятно, что иммунная система сможет довести до конца всю описанную выше цепь взаимосвязанных клеточных взаимодействий только, если в геноме присутствует необходимый Щ-ген. В противном случае специфического иммунного ответа не будет. Именно на этом принципе основан существующий в природе генетический контроль силы иммунного ответа. Описанная обобщенная схема клеточной кооперации — один из

краеугольных камней современной иммунологии. Труды, послужившие ее созданию, в свое время были отмечены тремя Нобелевскими премиями по медицине.

Тем более удивительным представился нам еще один факт, который выявился в опытах in vitro. Небольшие количества СПЭ, добавленные к взвеси изолированных В-лимфоцитов, активировали синтез ДНК, вызывали деление, а в присутствии антигенов - антигензависимую дифферен-цировку клеток, т.е. запускали иммунный ответ прямо в пробирке без помощи других клеток иммунной системы [8, 9].

Время инкубации лимфоцитов, мин

Рис. 3. Влияние полиэлектролитов на проницаемость мембран В-лимфоцитов для ионов К+ in vitro, а - Кинетика установления усиленного стационарного потока при добавлении в культуру клеток раствора ПАК; б - зависимость стационарных потоков ионов К+ от концентрации различных полиэлектролитов: 1 - ПЭП, 2 -ПЭП, содержащий 3 мол. % С16Н33-заместите-лей, 3 - поли-/.-лизин, 4 - ПАК, 5 - диметилами-ноэтилметакрилат, 6 - декстрансульфат, 7 - по-ли-4-винилпиридиний-1М-оксид (неионогенный полимер, приведенный для сравнения).

Объяснение было найдено путем изучения биохимических и физико-химических последствий воздействия СПЭ на В-лимфоциты. Оказалось, что при добавлении водного раствора ПАК к суспензии В-лимфоцитов резко возрастает ионная проницаемость внешней мембраны клетки. В частности, поток ионов калия устремляется из клетки в окружающий раствор, где их концентрация ниже, чем во внутриклеточном пространстве (рис. За). Другие водорастворимые СПЭ действуют аналогичным образом. В отличие от них водорастворимые электронейтральные полимеры никакой активности не проявляют (рис. 36). Ионы кальция, концентрация которых выше в окружающем растворе, напротив, устремляются внутрь клетки (рис. 4). Иными словами, под воздействием

Радиоактивность клеточных экстрактов, имп/мин

4000-

3000 -

2000 -

1000 - 1 2 3 1 2 3 1 2 3

I II III

Рис. 4. Влияние полиэлектролитов на прохождение экзогенных ионов Са2+ сквозь мембраны В-лимфоцитов in vitro: 1 - контрольные клетки, 2 - ПАК (п = 1100), 3 - ПЭП (п = 740); I, II, III -номера опытов.

Рис. 5. Микрофотографии продольных сколов мембраны В-лимфоцитов in vitro: а - необработанный образец, б - образец, обработанный полиэлектролитом.

СПЭ в клеточной мембране образуются поры, сквозь которые ионы начинают диффундировать в направлении градиента концентрации. Электронные микрофотографии продольных сколов мембраны показывают, что обработка индивидуальных клеток СПЭ приводит к агрегации мембранных белков (рис. 5) [8, 9].

Явление агрегации белковых глобул, связывающихся с линейными полиэлектролитами в водных растворах, к тому времени уже было известно и хорошо изучено [12-14]. Центрами связывания в первую очередь служат ионные группы на поверхности глобул, заряд которых противоположен заряду СПЭ. Кроме того, в зависимости от химической структуры полииона и белка связывание может происходить в результате донорно-

акцепторного или гидрофобного взаимодействия. Такие центры связывания имеются и на экспонированных в водной фазе поверхностях плавающих в липидном бислое мембранных белков. Поэтому было естественно предположить, что именно они служат центрами сорбции СПЭ на внешней мембране клетки, а мембранные белки, взаимодействуя с полиионом, собираются в двухмерные кластеры по механизму, сходному с тем, который реализуется в водных растворах. Тогда в роли пор, по всей вероятности, выступают промежутки между агрегированными белковыми глобулами наподобие тех, что остаются между плотно упакованными на плоскости бильярдными шарами. Ниже представлена предполагаемая схема.

Щ

Известно, что энергию, необходимую для поддержания жизнедеятельности, любая клетка получает из одного универсального источника: реакции окисления аденазинтрифосфата (АТФ). В частности, естественный ионный баланс в клетке поддерживают мембранные ферменты: (К+, Ыа+)

и Са2+ АТФазы. Эти молекулярные насосы способны транспортировать ионы сквозь мембрану против градиента их концентрации. Для выполнения такой работы они расходуют энергию, запасенную в АТФ. Парциальное потребление АТФ каждой из АТФаз можно оценить путем добавле-

Относительная активность, %

180

140

100

60 180

140

100

60 180

140

100

60

Контроль

(а)

х я (-X св •в" о а

Е-

и

- (В)

и се -1

< (д)

Г

Строфантин

■

(б)

- (г)

* (

< /

С 1

(е)

И

20 40

Рис. 6. Влияние ПАК на относительную активность К+, Иа+ и Са2+-АТФаз. Пояснения в тексте.

20 40

Время, мин

ния в культуру клеток избирательно действующих ингибиторов.

Из данных рис. 6 (а, б и в) следует, что общее относительное потребление АТФ В-лимфоцита-ми действительно снижается при добавлении оуа-баина (строфантина) и соли лантана - специфических ингибиторов соответственно (К+, Ыа+) и Са2+ АТФаз. Из данных, приведенных, в нижней части рис. 6г, следует, что введение ПАК в водную суспензию В-лимфоцитов вызывает резкое увеличение относительного потребления клетками АТФ, а ингибиторный анализ (рис. 6д, е) показывает, что это увеличение и в самом деле обусловлено дополнительной активацией АТФаз [15, 16]. Нарушение естественного состояния клетки из-за вытекания ионов калия и притока дополнитель-

ного количества ионов кальция приводит к компенсаторному включению молекулярных насосов, а это в свою очередь служит сигналом к запуску и других внутриклеточных систем. Иными словами, клетка начинает делать то, что ей свойственно. В частности, В-лимфоциты начинают делиться и дифференцируются, синтезируя рецепторы для узнавания присутствующих антигенов и тем самым готовясь производить комплементарные им антитела. Характерно, что циклаз-ные ферменты - непременные участники реакции иммунных клеток при обычном механизме запуска иммунной системы, в данном случае практически не активируются.

Приведенные экспериментальные факты позволили нам сделать еще одно важное заключе-

Поток К+, мкмоль/мин

Рис. 7. Зависимость потока ионов К+ сквозь мембраны В-лимфоцитов in vitro и усиления иммунного ответа in vivo от молекулярной массы ПАК. % - максимальный коэффициент стимуляции.

иие: при контакте с иммунной клеткой СПЭ выполняет функцию незнакомого ей триггерного фактора. Он действует по альтернативному механизму в обход некоторых предусмотренных природой ключевых событий, в частности упомянутого выше двойного узнавания. В самом деле, в описанных выше системах in vitro Т/глимфоциты (непременные участники процесса двойного узнавания) просто отсутствовали. Это заключение полностью согласуется с результатами, полученными при использовании "живых пробирок" -экспериментальных мышей, искусственно лишенных Т-клеток путем хирургического удаления тимуса и у-облучения костного мозга. Вместе с тем В-лимфоциты, созревающие и дифференцирующиеся в селезенке, у таких мышей остаются (поэтому иммунологи называют их В-мыша-ми). Не имея Т-клеток, В-мыши не способны дать обычную иммунную реакцию на введенные антигены. Однако при введении тех же антигенов в смеси с СПЭ у них вырабатывается практически столь же сильный иммунный ответ, как и у нормальных мышей.

Следовательно, СПЭ, стимулируя развитие иммунной реакции, используют для ее запуска альтернативный механизм не только in vitro, но и in vivo. Впрочем, о том же свидетельствуют и данные рис. 7, демонстрирующего поразительный параллелизм зависимостей интенсивности трансмембранного ионного потока in vitro и коэффи-

циента усиления иммунного ответа m vivo от степени полимеризации СПЭ.

ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫИ ИММУНОСТИМУЛЯТОР ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА

Возможность практического использования СПЭ в качестве иммуностимуляторов представлялась весьма заманчивой прежде всего именно потому, что сами они не иммуногенны. Это значит, что такой СПЭ, усиливая иммунный ответ на попавшие в организм антигены, не заставит иммунную систему попусту растрачивать ресурсы на выработку антител к самому себе. Кроме того, установленный факт запуска иммунной системы без участия Т-клеток-помощников, через посредство которых гены главного комплекса гистосов-местимости контролируют силу иммунного ответа, позволял надеяться на возможность феноти-пической коррекции действия иммунной системы, т.е. компенсации иммунодефицита у конкретных особей, генетически слабо защищенных от микробов - носителей данного антигена. Главной задачей, естественно, стало создание СПЭ, который можно было бы вводить человеку без вредных побочных последствий. Для синтеза исходных макромолекул была использована ранее открытая и детально изученная полимеризация стерически напряженных бициклических аминов с раскрытием одного из циклов [17-19]. В подходящих условиях эта реакция протекает по механизму "живых" цепей и потому позволяет получать линейные полиамины, характеризующиеся строго заданной степенью полимеризации и очень узким ММР. В качестве исходного мономера по ряду причин (в том числе по технико-экономическим показателям) был выбран 1,4-диамино-бицикло(2,2,2)октан (ДАБКО) (триэтилендиа-мин). Его полимеризация по механизму "живых" цепей ведет к образованию поли-1,4-этиленпипе-разина с выходом, близким к 100%. Из этого полимера путем окисления части его звеньев перок-сидом водорода до 1Ч-оксида и последующей ква-тернизации бромуксусной кислотой был синтезирован нетоксичный поликатионный иммуностимулятор [20, 21], который прошел все необходимые испытания и был разрешен в России для медицинского применения. Сегодня его можно купить в аптеках под фирменным названием "Полиоксидоний". Решение этой задачи - результат многолетнего совместного труда химиков и

иммунологов, вовлеченных в проект. Ниже при- лиоксидония, который представляет собой водо-ведена схема синтеза и структурная формула по- растворимый тройной сополимер.

N + N

Я—N

ДАБКО

сн2-сн2—й'"

ДАБКО

"И -

сн2-сн2—Й""

X"

/-ч

—N И-СН^-СН,-ч_/

н,о,

Поли( 1,4-этиленпиперазин)

' /-\ \ / /-ч +/ ч

Д_^-СН2-СНИ—ЬГ^_^-СН2-СН2 ^_Н-СН2-СН2-

Полиоксидоний

СН2-СОО" /025

Ключевую роль в драматическом снижении острой токсичности, обычно свойственной полиаминам, здесь играют Ы-оксидные группы, в первую очередь потому, что они "разбавляют" звенья полимерной цепи, содержащие аминогруппы. Тем самым до безопасного для организма уровня снижается линейная плотность положительных зарядов, которые возникают в результате прото-нирования свободных аминогрупп. При этом, однако, сополимер не теряет растворимости в воде, поскольку электронейтральные И-оксиднные группы представляют собой гидрофильные диполи. Известно, что в отличие от полиаминов поли-1Ч-оксиды вообще нетоксичны. Но будучи инертными в отношении мембранных белков, они, понятно, не могут служить триггерами для запуска

иммунной системы. При разработке полиоксидо-ния опытным путем было найдено оптимальное соотношение амино-групп и Ы-оксидных групп, при котором токсичность сополимера уже снижена до вполне приемлемого уровня, но его способность взаимодействовать с мембраной и активировать иммунные клетки еще не утрачена. Кроме того, Ы-оксидные звенья, включенные в основную цепь полиоксидония, при умеренных температурах перегруппировываются в оксимы (перегруппировка Мейзенгеймера), которые затем распадаются по связи 1Ч-С с образованием амино-и альдегидной групп. В результате цепи полиоксидония расщепляются на относительно короткие фрагменты [22]:

/-4 /-4

—N Ы-СН2-СН2—N Ы-СН-,-СН2— --^-►

\ /1 N_/ " Перегруппировка

О

Мейзенгеймера

Н

/-ч I /-ч

—N 1М—0~С-СН2—N И-СНо-СН;,— -А,

^ А ^ -

/-Ч % /-\

► —N ЫН ,С-СН2—N К-СН-,-СН2— ч-/ н' -/

В условиях организма эти реакции протекают до- стимулятор вполне успевает выполнить свою статочно медленно, так что введенный иммуно- функцию. Показано, что для практически полного

удаления его из организма требуется около двух недель, а для активации иммунной системы - не более 2 ч. В дальнейшем иммунная реакция развивается уже без участия СПЭ. Карбоксильные группы в структуре полиоксидония служат для его дополнительной химической модификации.

Молекулярный механизм активации клеток при действии СПЭ, установленный на примере изолированных В-лимфоцитов в опытах in vitro, не специфичен. Точно так же СПЭ могут взаимодействовать и с другими мембранами. Поэтому введенный в организм полиоксидоний способен стимулировать целый спектр иммунокомпетент-ных клеток, выполняющих разные функции и обеспечивающих различные проявления иммунной защиты. Соответственно широк и спектр его применений, уже сегодня реализуемых в медицинской практике. Они относятся к области как иммунотерапии (хирургические инфекции, гнойно-воспалительные процессы кожи и мягких тканей, хронические неспецифические заболевания бронхо-легочного тракта, туберкулез, аутоиммунные заболевания), так и иммунореабилитации (восстановление иммунитета после перенесенного инфекционного заболевания, профилактика респираторных инфекций, профилактика и восстановление иммунитета после радио- и химиотерапии). Таким образом, насколько нам известно, "Полиоксидоний" стал первым в мире и пока единственным синтетическим полимером, обладающим собственной биологической активностью, который разрешен и уже несколько лет успешно применяется в медицине в качестве препарата для внутреннего введения.

Из сказанного выше следует, однако, что действие "Полиоксидония" как иммуностимулятора неспецифическим образом рассредоточено по многим компонентам иммунной системы. Для иммуностимулятора эта широта - безусловный плюс. Но такой стимуляции недостаточно, чтобы вызвать в организме целенаправленно сильный иммунный ответ на конкретный антиген или конкретную группу антигенов в обход IR-генного контроля.

МОЛЕКУЛЯРНОЕ УЗНАВАНИЕ

Для достижения целенаправленно сильного иммунного ответа по меньшей мере необходимо сфокусировать действие СПЭ, обеспечив его "ад-

ресную" доставку и избирательную сорбцию на поверхности соответствующих В-лимфоцитов. В качестве "адреса" не трудно химически привязать к полимерной цепи нужный (по терминологии молекулярных биологов) "вектор": антиген или антигенную детерминанту. Тогда, если полученный конъюгат, блуждая между различными клетками в организме, случайно достигнет той, на поверхности которой имеются комплементарные данному антигену рецепторы, его детерминанта получит возможность связаться с рецептором. Образование такой связи, фиксирующей СПЭ на поверхности мембраны, будет означать, что конъюгат "узнал" клетку, которой он был адресован.

Не очевидной представлялась сама возможность свободного блуждания введенного в организм конъюгата антиген-СПЭ в поисках клетки-адресата. Дело в том, что узнавание на молекулярном уровне всегда происходит методом проб и ошибок. Следовательно, конъюгату, прежде чем найти нужную клетку, предстоит в ходе теплового движения вступить во множество временных пробных контактов с огромным числом других клеток, не наделенных адекватными рецепторами. Способен ли он это сделать в условиях организма? Известно, что длинноцепочечные полимеры обычно необратимо сорбируются на поверхностях и из-за кооперативности взаимодействия не покидают поверхность сорбента даже при очень большом (в пределе бесконечном) разбавлении раствора. Клеточная мембрана - хороший сорбент для всех полиэлектролитов, запускающих иммунный ответ, особенно для поликатионов. Поэтому возникало естественное опасение, что конъюгаты, адресованные определенному клону В-лимфоцитов, сразу прилипнут к другим клеткам, имеющимся в огромном избытке, и не смогут достичь адресата.

Вместе с тем при постановке этой проблемы мы уже располагали косвенными данными, которые позволяли надеяться, что механизм поиска конъюгатом нужных клеток методом проб и ошибок на самом деле все же существует, несмотря на упомянутые ограничения. Эти данные были получены при изучении поведения комплексов, которые образуются из двух противоположно заряженных полиэлектролитов в водных растворах. Поликатион и полианион в таком ин-терполиэлектролитном комплексе (ИПЭК) со-

единяются друг с другом множеством солевых связей, которые могут диссоциировать только кооперативным образом. Поэтому в определенных интервалах рН и ионной силы ИПЭК абсолютно устойчивы и не расщепляются на исходные компоненты при разбавлении. Тем не менее, к числу фундаментальных свойств ИПЭК относится их способность вступать в конкурентные реакции обмена и замещения с другими полиэлектролитами [23, 24]. Такие реакции не требуют

предварительной диссоциации ИПЭК на исходные компоненты. Они протекают путем образования промежуточных тройных комплексов, как это показано на приведенной ниже схеме, где по-лиион, изображенный полужирной линией, и по-лиионы, изображенные тонкими линиями, несут противоположные заряды, а присутствующие в системе низкомолекулярные противоионы для простоты не обозначены.

ИПЭК-1 Полиион- Тройной Замещенный ИПЭК-2

конкурент комплекс полиион

На самом деле для превращения ИПЭК-2 в ИПЭК-1, т.е. переноса "толстого" полииона с одного "тонкого" партнера на другой, вовсе не требуется, чтобы ИПЭК-1 предварительно диссоциировал на исходные компоненты. В пределах тройного комплекса такой перенос с определенной вероятностью происходит путем флуктуаци-онной перегруппировки ионных пар, связывающих противоположно заряженные полиионы. При этом энергия, расходуемая на разрыв одной ионной связи, сразу возвращается в результате образования новой, ей эквивалентной. Более того, если звездочка, которой помечен один из "тонких" полиионов, обозначает функциональную группу, способную дополнительно стабилизировать ИПЭК, то "толстый" полиион фиксируется в составе ИПЭК-2. После многочисленных проб и ошибок это происходит даже, если непомеченные "тонкие" полиионы присутствуют в системе в большом избытке. Иными словами, "толстый" и помеченный "тонкий" полиионы находят и узнают друг друга. Замечательно, что для этого не требуется большого числа стабилизирующих групп, а достаточное для узнавания дополнительное сродство в расчете на одну звездочку обеспечивается энергией связи, лишь в несколько раз превышающей энергию теплового движения. Так, например, поли(Ы-этил-4-винилпиридиние-вые) катионы (ПЭП) в водном растворе методом

проб и ошибок точно узнают среди полиметакри-лат анионов те, что помечены одной пиренильной группой в расчете на 1000-1500 мономерных звеньев [25]. В данном случае дополнительное сродство привносится гидрофобным взаимодействием пиренильной группы с углеводородными фрагментами цепи ПЭП.

Однако было далеко не очевидно, что механизм молекулярного узнавания, подобный экспериментально установленному для противоположно заряженных полимерных цепей, может действовать также и в системах типа полиион-клетка, где каждая клетка-партнер гораздо массивнее полиэлектролитной цепи, а линейные размеры клетки намного превышают контурную длину взаимодействующего с ней полииона. Для устранения сомнений требовались более адекватные модельные системы.

В качестве грубой модели отдельной клетки мы использовали относительно крупные частицы полистирольного латекса (5 мкм в диаметре). Поверхность каждой частицы была покрыта химически связанными с ней сульфогруппами и потому отрицательно заряжена, подобно внешним мембранам большинства клеток. Понятно, что такая частица - сильный сорбент для поликатионов.

Первая задача заключалась в том, чтобы выяснить, могут ли поликатионы, необратимо ад-

сорбированные на отрицательно заряженной поверхности, свободно мигрировать в адсорбционном слое. Для этого упомянутый выше латекс смешивали с водным раствором поли-£-лизина, модифицированного небольшим количеством флюоресцеинизотиоцианильных (ФИТЦ) групп. В результате флуоресцентно меченные поликатионы адсорбировались на поверхности латекс-ных частиц. Затем выбирали одну такую частицу, в водной среде освещали ее светом с длиной волны в области поглощения ФИТЦ-групп и с помощью оптического микроскопа наблюдали характерную для них зеленую флуоресценцию. В исходном состоянии зеленый свет равномерно излучала вся поверхность частицы, что свидетельствовало о равномерном распределении флуоресцентных меток в адсорбционном слое. Убедившись в этом, на центр флуоресцирующей поверхности направляли мощный лазерный пучок, толщина которого (2.5 мкм) была несколько меньше диаметра частицы. В зоне воздействия пучка происходила частичная фотодеструкция ФИТЦ-групп. Соответственно на поверхности появлялось пятно с несколько ослабленной флуоресценцией.

Ответ на вопрос был получен путем наблюдения и измерения во времени интенсивности флуоресценции после прекращения действия лазерного пучка. Оказалось, что свечение пятна постепенно восстанавливалось. Через 15-20 мин вся поверхность частицы вновь начинала равномерно излучать. Этот результат однозначно доказывал, что поликатионы, адсорбированные на контактирующей с водой протяженной отрицательно заряженной поверхности, могут достаточно быстро перемещаться в адсорбционном слое, обмениваясь местами друг с другом. Именно таким образом часть "отбеленных" полимерных цепей покидает облученную лазером область. На смену им с не подвергавшейся лазерному воздействию периферии приходят другие свободно блуждающие поликатионы вместе с сохранившимися в их составе флуоресцентными группами. По скорости восстановления флуоресценции была оценена величина коэффициента двухмерной самодиффузии поли-£-лизина в адсорбционном слое О = = (2-6) х 10-8 см2/с [26].

Грубой моделью совокупности клеток нам служил монодисперсный ПС-латекс с диаметром частиц около 0.5 мкм. В данном случае их поверхность была покрыта химически привязанными к

ней карбоксильными группами (в среднем 1 группа на 25 А2) и потому также отрицательно заряжена в нейтральной и щелочной средах [27, 28]. Эту модель мы выбрали, чтобы выяснить, могут ли адсорбированные поликатионы переходить с поверхности одной крупной отрицательно заряженной частицы на другую [27, 29]. В качестве поликатиона был использован ПЭП со степенью полимеризации около 103. К разбавленному латексу добавляли водный раствор ПЭП, варьируя соотношение положительно заряженных пириди-ниевых звеньев, приходящихся на один отрицательный заряд поверхности. Для каждого зарядового отношения в одной серии опытов измеряли электрофоретическую подвижность латексных частиц, характеризующую величину и знак их заряда, а в другой параллельной - количество ПЭП, остающегося в растворе после осаждения латекса с помощью препаративной центрифуги. Полученные данные приведены на рис. 8. Видно, что по мере увеличения содержания ПЭП исходный отрицательный заряд частиц уменьшается, а затем при избытке ПЭП происходит их перезарядка: значения электрофоретической подвижности становятся положительными (рис. 8а). Очевидно, что избыточный положительный заряд несут экспонированные в раствор петли и хвосты адсорбированных поликатионов. Существенно, что размер получившихся положительно заряженных частиц не отличался от размера исходных. Важно отметить также, что ход зависимости электрофоретической подвижности от зарядового отношения не менялся при варьировании исходной частичной концентрации латекса в пределах, превышающих 2 десятичных порядка.

Последнее означает, что в области изученных зарядовых отношений все добавленные поликатионы прочно адсорбируются на поверхности латекса и не десорбируются при разбавлении системы. О необратимом характере адсорбции свидетельствуют также данные рис. 86, который характеризует влияние исходного зарядового отношения на оптическую плотность надосадочной жидкости, измеренную после осаждения латекса. Видно, что в области поглощения ПЭП оптическая плотность остается равной нулю вплоть до насыщения поверхности частиц адсорбирующимися на них поликатионами. Как и следовало ожидать, содержание ПЭП в надосадочной жид-

N

N

Рис. 8. Зависимость электрофоретической подвижности (ЭФП) латексных частиц (а) и поглощения ПЭП в надосадочной жидкости (б) от соотношения числа звеньев N ПЭП к числу карбоксильных групп на поверхности латексных частиц. Концентрация латекса 9 х 109 (1), 1.8 х 10й (2) и 1.8 х 1012 частиц/л (5).

ЭФП, (мкмоль/с)/(В/см)

Рис. 9. Экспериментальное доказательство миграции адсорбированного ПЭП между частицами латекса. Электрофоретическая подвижность латексных частиц: 1 - исходных, 2 - перезаряженных адсорбированным ПЭП, 3 и 4 - после смешения 1 и 2, через 5 и через 40 мин соответственно.

кости начинает линейно расти только после того, как достигнуто насыщение.

Тем не менее, две следующих серии опытов однозначно показали, что, несмотря на необратимость адсорбции, эффективный механизм миграции поликатионов с поверхности одной отрицательно заряженной частицы на другую на самом деле все же существует. Чтобы получить ответ на вопрос, мы просто смешали суспензию исходных отрицательно заряженных частиц с суспензией тех, что приобрели положительный заряд благодаря адсорбции поликатионов. На рис. 9 представлены результаты измерений электрофоретической подвижности и размера частиц, проведенные параллельно через различные промежутки времени после смешения. Данные, полученные через 5 мин, свидетельствовали о кардинальных переменах, произошедших за это время в реакци-

онной системе. Наряду с частицами, характеризующимися значениями электрофоретической подвижности, близкими к исходным, появились другие, электрофоретическая подвижность которых имела промежуточное значение. В то же время по меньшей мере на порядок увеличился средний размер, свидетельствуя об агрегации исходных частиц. Однако эти перемены, как оказалось, были временными и относились к промежуточному состоянию системы. Измерения, проведенные через 40 мин, показали, что диаметр частиц вернулся к исходной величине и главное, что величина электрофоретической подвижности теперь уже у всех частиц приняла промежуточное значение. Проведенный эксперимент однозначно доказал, что поликатионы могут мигрировать не только в адсорбционном слое каждой отдельной частицы, но и переходить с поверхности одной частицы на

поверхность другой. Стал ясен и механизм, по которому все это происходит. Сразу после смешения исходные отрицательно заряженные латекс-ные частицы, встречаясь с заряженными положительно, связываются друг с другом за счет электростатического притяжения и образуют агрегаты. Понятно, что минимум свободной энергии системы соответствует равномерному распределению поликатионов между частицами внутри агрегата. Как следует из приведенных данных, в такое состояние система приходит за весьма умеренные времена, что собственно и доказывает возможность поликатионов не только диффундировать по поверхности отдельной ла-тексной частицы, но и "переползать" с одной частицы на другую в местах их временно установившихся контактов. При равномерном распределении поликатионов внутри агрегата выравнивается и заряд латексных частиц, а следовательно, утрачивается их взаимное электростатическое притяжение.

Тогда под действием теплового движения агрегаты диспергируются до частиц исходного размера.

Таким образом, было показано, что поликатиону на самом деле кинетически не запрещено методом проб и ошибок искать среди множества отрицательно заряженных частиц одну, которой он может быть адресован. "Адресом" должна служить прикрепленная к поликатиону молекула, способная узнать структурно комплементарный ей рецептор, прикрепленный к поверхности час-тицы-адресата. В качестве таких партнеров мы выбрали фермент а-химотрипсин (ХТ) и другой белок - соевый ингибитор трипсина (СИТ) [29, 30]. Последний, связываясь с ХТ, полностью угнетает его каталитическую активность. Элементы системы, использованной для моделирования процесса узнавания клетки конъюгатом поликатион-антиген, изображены на следующей схеме:

Латекс из поли-а-хлорэтилметакрилата

Конъюгат а-химотрипсина и ПЭП

БСА-латекс СИТ-латекс

Моделями клеток служили две разновидности модифицированных частиц латекса (0.36 мкм в диаметре) из поли-а-хлоракрилата. К поверхности одних пришивали ковалентными связями СИТ, к поверхности других - бычий сывороточный альбумин (БСА). Эти белки имеют близкие молекулярные массы. Их изоэлектрические точки расположены в кислой области рН. Поэтому в нейтральной среде оба они заряжены отрица-

тельно и, следовательно, могут служить центрами сильного электростатического связывания поликатионов с поверхностью латексных частиц. Для изготовления модели конъюгата поликати-он-антиген к ПЭП в качестве вектора химически присоединяли ХТ в расчете 1 молекула белка на полимерную цепь длиной около 1000 мономерных звеньев. Таким образом, потенциальными мишенями для конъюгата должны были служить

1.2

0.8

«о

¿10.4

(а)

1 2 3

[ХТ-ГТЕП] х 108, макромоль/л

г * 1П-12 п-1 латекс л 1 л

Рис. 10. Взаимодействие ХТ-ПЭП конъюгата с латексами, покрытыми БСА (Л-БСА) и СИТ (Л-СИТ): а -зависимость остаточной концентрации конъюгата в надосадочной жидкости от количества добавленного конъюгата. Л-БСА (1) и Л-СИТ (2); б - изменение каталитической активности ХТ-ПЭП конъюгата при взаимодействии с Л-БСА (7), Л-СИТ (2) и их смесью (5).

частицы латекса, покрытые СИТ (СИТ-латекс), а их конкурентами - частицы латекса, покрытые БСА (БСА-латекс). Достоинство выбранной модельной системы состояло в простоте констатации самого факта адресной доставки и фиксации конъюгатов на поверхности "клеток-мишеней", т.е. мониторинга процесса связывания ХТ-векто-ра с СИТ-рецептором. Для этого достаточно добавить в исследуемую систему какой-либо субстрат ХТ и следить за скоростью соответствующей ферментативной реакции. В качестве такого субстрата мы использовали нитрофенилацетат, скорость гидролиза которого легко измерить спект-рофотометрически по образованию нитрофенола. Главные результаты экспериментов с описанной выше модельной системой приведены на рис. 10. Как и следовало ожидать, при раздельном смешении растворенный в воде конъюгат ХТ-ПЭП количественно адсорбировался на каждом из двух

латексов вплоть до полного насыщения конъюга-том поверхности латексных частиц (рис. 10а). В обоих случаях картина адсорбции совпадала с той, что мы наблюдали при взаимодействии ПЭП с частицами латекса, покрытыми карбоксильными группами (рис. 86). Вместе с тем из рис. 106 следует, что частицы БСА-латекса практически не влияли на ферментативную активность конъюгата ХТ-ПЭП, адсорбированного на их поверхности, тогда как его адсорбция на поверхности частиц СИТ-латекса сопровождалась линейным падением скорости ферментативной реакции и в конечном счете почти полным ингибированием фермента. Из этого следует, что при адсорбции конъюгата ХТ-ПЭП молекулы фермента вступали в дополнительное взаимодействие с комплементарными им молекулами СИТ. Предполагаемое различие в структуре адсорбционных слоев иллюстрируют следующая схема:

Латекс-СИТ

Ключевой вопрос, однако, состоял в том, может ли конъюгат ХТ-ПЭП различить частицы СИТ-латекса на фоне частиц БСА-ла-текса, поскольку последние также способны прочно адсорбировать ПЭП. Из данных, приведенных на рис. 106, следует, что может. Видно, что СИТ-латекс, добавленный к предварительно приготовленной смеси конъюгата ХТ-ПЭП с БСА-латексом, ингибировал изначально адсорбированный на БСА-латексе конъюгат столь же эффективно, как и в отсутствие латекса- конкурента. Измерение каталитической активности в тройной смеси каждый раз проводили через 5 мин после добавления СИТ-латекса. Иными словами, конъюгат количественно переходил с латексных частиц, покрытых БСА, на латексные частицы, покрытые СИТ, за время, не превышавшее 5 мин. Очевидно, что, как и в описанном выше случае взаимодействия ПЭП с карбоксилированным

латексом, адсорбция конъюгата ХТ-ПЭП на частицах БСА-латекса необратима лишь применительно к освобождению адсорбированного конъюгата и его возвращению в исходный раствор. Однако, если между латексными частицами возникает контакт, то по месту контакта конъюгат может переходить с поверхности одной латексной частицы на другую. Таким образом, методом проб и ошибок конъюгат ХТ-ПЭП добирается до частицы СИТ-латекса. Там связанная с поликатионом молекула ХТ находит комплементарную молекулу СИТ и, образуя с ней комплекс, подобно якорю фиксирует на поверхности этой частицы весь конъюгат [30]. Процесс специфического узнавания конъюгатом частиц-мишеней среди других частиц, на которых он адсорбируется, но неспецифическим образом, можно представить следующей схемой:

<===>

Описанные выше достаточно простые модели послужили физико-химическим обоснованием неожиданных явлений, которые иммунологи обнаружили при введении в организм конъюгированных с СПЭ антигенов.

ПОЛИМЕР-СУБЪЕДИНИЧНЫЕ ИММУНОГЕНЫ

Простейшим примером стал сополимер акриловой кислоты (АК) с М-винилпирролидоном (ВП), к которому ковалентными связями были пришиты тринитрофенилные (ТНФ) группы [8, 9,31]:

-chj-ch-cho-ch-chi-ch—... - I - I

с=о соон

n0,

Сами по себе низкомолекулярные ТНФ соединения не иммуногенны. Однако еще на заре развития иммунологии было показано, что конъюгаты ТНФ с белковыми антигенами при введении в

Мгнф X Ю-3

80 -

Первичный иммунный ответ Вторичный иммунный ответ

70 -

15 -

5 - КЯ

Контроль Контроль

Рис. 11. Иммунный ответ у мышей на введение конъюгата ТНФ, конъюгированного с сополимером АК-ВП. Мтнф - количество ТНФ-специ-фических АОК на селезенку.

организм вызывают иммунную реакцию, при которой специфические к ТНФ антитела образуются наряду с антителами к другим антигенным детерминантам белковой молекулы. Данные, приведенные на рис. 11, показывают, что конъюгат ТНФ (АК-ВП) уже при первичном введении вызывает образование весьма значительного числа ТНФ-специфических антителобразующих клеток (АОК) в селезенке животных. Число этих клеток, как и титр самих антител, служит мерой эффективности иммунного ответа организма на введенный антиген. Повторное введение конъюгата сопровождалось колоссальным усилением иммунной реакции. При этом иммунная система

Иммунный ответ 10000-

Альбумин Антиген 1 Антиген 2

Рис. 12. Иммунный ответ (АОК) у мышей на введение БСА, его комплекса (антиген 1) и конъюгата (антиген 2) с ПЭП.

не вырабатывала никаких других антител кроме тех, которые комплементарны ТНФ.

На следующем этапе мы присоединили к СПЭ настоящий белковый антиген - БСА. В качестве СПЭ использовали две модификации цепей ПЭП. Одна содержала несколько мольных процентов гидрофобных цетильных, другая - карбоксимети-леновых групп [8,9,32,33]. В глобуле сывороточных альбуминов, как известно, имеется гидрофобный "карман", способный сорбировать алифатические фрагменты молекул. Благодаря этому глобулы БСА в водном растворе сами прикреплялись к поликатионам, модифицированным гидрофобными группами. В другом варианте их прикрепляли ковалентными связями, конденсируя карбоксильные группы СПЭ с аминогруппами белка.

Антиген 1

(полимер связан с БСА солевыми и гидрофобными контактами)

Сам по себе БСА, как и другие сывороточные альбумины, весьма слабый антиген. Однако в

Антиген 2 (полимер связан с БСА ковалентно)

связке с СПЭ он вызывал у мышей гораздо более сильную иммунную реакцию (рис. 12). В случае

ковалентного конъюгата усиление достигало двух десятичных порядков [32,33]. В этом примере, как и в предыдущем, накапливавшиеся в селезенке АОК были строго специфичны по отношению к Б С А. Следовательно, в условиях организма конъюгаты, как и в модельных системах, методом проб и ошибок находили клетки-мишени.

В свете полученных данных можно было полагать, что биохимический механизм запуска

Na+

* SS»

специфической иммунной реакции конъюгата-ми антиген-СПЭ аналогичен рассмотренному выше для СПЭ-иммуностимуляторов. Однако в отличие от неизбирательно действующих СПЭ-полиионов действие конъюгатов фокусируется на клетках, несущих рецепторы, которые комплементарны присоединенным к СПЭ антигенам. Ситуация, складывающаяся в последнем случае во внешней мембране клетки-мишени, изображена ниже.

^SSäm,

%

Впрочем, вскоре в опытах на животных - носителях Ш-генов различного состава, тому были получены хотя и косвенные, но очень серьезные подтверждения, которые во многом предопределили практическую значимость всей работы в целом [8,9,34]. В качестве экспериментальных животных использовали мышей двух генетических

АОК х 10"-

140 " 1=1

100 в—

60 -

20 -

4 -

3 -

2 -

1 -

БСА БСА-

полиэлектролит

БГГ БГТ-

полиэлектролит

пи/+ пи/пи

пи/+ пи/пи

Рис. 13. Независимость силы иммунного ответа от Т-лимфоцитов-помощников. Пояснения в тексте.

линий. Одна из этих линий "nude" (пи/пи) искусственно выведена специально для иммунологических исследований. Мыши "nude" генетически лишены иммунной защиты. Соответственно они не производят антител в ответ на введение им каких-либо антигенов. Мыши другой линии (пи/+) заметно реагируют на БСА (как уже упоминалось, относительно слабый антиген) и значительно сильнее на бычий гаммаглобулин (БГГ). Этот известный факт естественно подтвердился и в контрольных опытах (рис. 13). Основываясь на уже полученных данных по усилению специфического иммунного ответа у беспородных мышей на конъюгаты ТНФ-СПЭ и БСА-СПЭ, можно было ожидать обнаруженную на опыте усиленную реакцию мышей (пи/+) на введение как БСА, так и БГГ, конъюгированных с АК-ВП. В свете логических построений, на которые мы уже тогда опирались, нас обрадовал, но не удивил и другой результат, представленный на рис. 13. В селезенке генетически беззащитных мышей "nude" в ответ на введение конъюгатов, вырабатывалось почти столько же АОК, сколько и в генетически защищенных. Таким образом, конъюгаты дейст-

вительно запускали иммунную систему по альтернативному механизму, обходя диктат Ш-ге-нов, которые при обычном запуске контролируют эффективность иммунной реакции у отдельно взятых особей. Тем самым с помощью полимер-субъединичных иммуногенов удалось осуществить фенотипическую коррекцию иммунного ответа.

Последняя точка в системе доказательств была поставлена опытами с конъюгатом, в котором в качестве антигена был использован особый синтетический полипептид, известный в иммунологии под названием (Т,Г)-А-Л-антиген [8, 9]. Он знаменит как раз тем, что благодаря очень высокой иммуногенной специфичности в свое время послужил открытию самого факта существования генов иммунного ответа [35, 36]. (Т,Г)-А-Л -это первые буквы в названиях аминокислотных остатков, из которых на самом деле состоит этот полипептид. Он представляет собой гребнеобразный сополимер, основная цепь которого - высокомолекулярный поли-£-лизин, а боковые ветви -пентапептиды. Каждая ветвь содержит по три остатка аланина и по одному остатку глутаминовой кислоты и тирозина, если перечислять в направлении от основной цепи. Для постановки опытов, которые должны были дать однозначный ответ на вопрос, мы приготовили конъюгат, привязав (Т,Г)-А-Л-антиген к сополимеру АК-ВП. Этот конъюгат вводили мышам двух генетических линий (СВА и С57ВЬ) и сравнивали его действие с действием свободного (Т,Г)-А-Л-антигена. Результаты приведены на рис. 14. У мышей СВА 1И-гены с запрограммированным иммунным ответом на (Т,Г)-А-Л-последовательность вовсе отсутствуют. Соответственно иммунная система этих мышей не реагирует на свободный (Т,Г)-А-Л-антиген. У мышей С57ВЬ с Ш-генами к (Т,Г)-А-Л все в порядке, поэтому мыши этой линии в ответ на введение свободного (Т,Г)-А-Л-антигена вырабатывают достаточно большое число АОК, высоко специфических по отношению к (Т,Г)-А-Л. Введение (Т,Г)-А-Л-антигена, конъюгированно-го с сополимером АК-ВП, мышам С57ВЬ, как и в случае других конъюгированных антигенов, приводило к дополнительному многократному усилению их специфической иммунной реакции. Замечательно, однако, что и мыши СВА, вовсе не реагирующие на свободный полипептид, реагировали на его конъюгат так же сильно, как их генетически

А'тнф х Ю"3 100 -

СВА С57ВЬ

Рис. 14. Фенотипическая коррекция иммунного ответа. Пояснения в тексте.

"благополучные" собратья [8, 9]. Последний факт строго доказывает, что присоединение антигена к СПЭ позволяет получить иммуногены, при иммунизации которыми, действительно, достигается фенотипическая коррекция иммунного ответа.

В самом деле, существование Ш-генов было установлено как раз в результате обнаружения резких различий в силе иммунной реакции различных особей на один и тот же антиген, в частности полипептид (Т,Г)-А-Л. Эти различия сглаживаются при иммунизации (Т,Г)-А-Л-СПЭ-конъюгатом. Поэтому степень достоверности вывода о фенотипической коррекции столь же высока, как и самого факта существования Ж-ге-нов. В данном случае коррекция - не что иное, как результат запуска иммунной системы по рассмотренному выше альтернативному механизму в обход предусмотренного природой генетического контроля силы иммунного ответа.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПОЛИМЕР-СУБЪЕДИНИЧНЫЕ ВАКЦИНЫ

На следующем этапе исследований иммунологам предстояло ответить на критически важный вопрос о том, проявятся ли у антиген-СПЭ конъ-югатов протективные свойства, если в качестве антигенов к цепям полиэлектролитных иммуностимуляторов пришить предварительно выделенные и очищенные микробные белки или полисахариды - визитные карточки болезнетворных

(а)

Полисахаридный антиген

бактериального тела

Белковый антиген жгутика

Антиген-полимерные конъюгаты

Выживаемость, 100

Заражение абсолютно летальной дозой

0.01 0.1 1 10 100 Доза, мг/кг

(б)

Нейраминидаза

1 Заражение абсолютно летальной дозой

2-

¡£100-

л

1 60-п

3 ш 20"

Физ. раствор

Физ. раствор

Иммунизация

Рис. 15. Протективное действие конъюгированной противосальмонелезной (а) и противогриппозной вакцины (б). Пояснения в тексте.

бактерий или вирусов. Иными словами, могут ли такие конъюгаты служить в качестве вакцин для профилактики инфекционных заболеваний. Понятно, что ответ должен был определить перспективу практического применения нового семейства иммуногенов.

Сальмонеллез стал первой из испытанных инфекций. Подопытным мышам вводили две разно-

видности конъюгатов (рис. 15а). В одном из вариантов к сополимеру АК-ВП в качестве антигена пришивали полисахарид, выделенный из тела бактерий (иммуноген 1), в другом - этот же полисахарид и еще флагеллин, белок из бактериальных жгутиков (иммуноген 2). Через определенный промежуток времени после иммунизации (от 14 до 30 дней) мышей заражали абсолютно смертельной дозой бактерий, после чего все живот-

Нейраминидаза

Гемагглютинин

М-белок

Заражение абсолютно летальной дозой вируса A(H3N2)

Al-j J> 14 дней Иммунизация

NP-белок

« х

я ~

a f s s

= t? 3000 JS<

8 й

рщ 2000

Д.*

fa

я fe « о с

о

1000

Рис. 16. Протективное действие конъюгированной противогриппозной вакцины, содержащей антигены вирусного штамма АСН^) при заражении вирусным штаммом А(Н3М2). Пояснения в тексте.

ные контрольной группы, естественно, погибали. В отличие от этого все предварительно иммунизированные животные выздоравливали. Правда, в случае первого конъюгата, содержавшего только один полисахаридный антиген, для достижения 100%-ной выживаемости требовалась иммунизация в 10 раз большей дозой, чем в случае второго (рис. 15, кривые 1 и 2). Иммунизация свободным полисахаридным антигеном в области разумных доз практически не защищала животных (кривая 3). Таким образом, было впервые показано, что ан-тиген-СПЭ-конъюгаты действительно могут служить в качестве антибактериальных вакцин.

Защита от вирусных инфекций - задача, как известно, более сложная, чем от бактериальных. Поэтому Р.В. Петров и P.M. Хаитов, руководители иммунологической части проекта, решили начать испытания с гриппа - одной из самых распространенных и социально значимых вирусных инфекций. Для этого химики синтезировали еще два конъюгата, присоединив к сополимеру АК-ВП в качестве антигенов в одном варианте гемагглютинин (конъюгат 1), а в другом - гемагглютинин и нейраминидазу (конъюгат 2), белки, лока-

лизованные на поверхности гриппозных вирио-нов (рис. 156). Оба полученных конъюгата заставляли иммунную систему подопытных мышей производить очень большое число АОК по сравнению с ничтожно малым в контрольных опытах (рис. 156). Как и в случае бактериальной инфекции, мышей иммунизировали конъюгата-ми, а затем заражали абсолютно смертельной дозой вируса. Результат превзошел все ожидания. Оба конъюгата защищали всех смертельно зараженных животных (рис. 156) [8, 9].

Более того, оказалось, что защитным действием обладают даже антиген-СПЭ-конъюгаты, в которых в качестве антигенов использованы белки, не экспонированные на поверхности, а находящиеся внутри гриппозных вирионов (рис. 16). Эти белки называют "консервативными", так как их структура при переходе от одного штамма вируса к другому меняется в значительно меньшей степени. Известно, что именно структурная изменчивость поверхностных белковых антигенов создает существенные дополнительные трудности для предупреждения эпидемий гриппа при обычной вакцинации. К числу консервативных

Заболеваемость

декабрь январь февраль март апрель

Рис. 17. Снижение заболеваемости людей, иммунизированных вакциной "Гриппол". Пояснения в тексте.

белков гриппозного вируса относятся так называемые М- и ИР-белки. В ходе описываемого исследования они были выделены из одного из вирусных штаммов (АСН,]^)) и присоединены к СПЭ. Подопытных мышей иммунизировали этими конъюгатами, а затем заражали абсолютно смертельной дозой вирусов другого штамма (А(Н3К2)). Данные, приведенные на рис. 16, показывают, что наряду с колоссальным усилением М-специфического иммунного ответа выживаемость иммунизированных мышей достигает 40-60% при 100%-ной смертности в контрольных опытах.

"ГРИППОЛ" - ПЕРВАЯ ВАКЦИНА НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА

Результаты описанных выше исследований в совокупности открыли путь к разработке поли-мер-субъединичных вакцин для человека. Важнейшей практической предпосылкой для этого стал описанный выше "Полиоксидоний" - нетоксичный и быстро выводящийся из организма по-ликатионный иммуностимулятор, который, пройдя все необходимые испытания, был разрешен для медицинского применения, в том числе для внутримышечного введения. На этом этапе было принято стратегическое решение - направить все усилия и средства на создание вакцины против гриппа - одной из самых распространенных и трудных для профилактики инфекций. Опыты на животных, о которых было рассказано в предыдущем разделе, позволяли надеяться на успех.

Вакцина "Гриппол" была получена путем ко-валентного связывания гемагглютинина и нейро-

аминидазы - белковых антигенов вируса гриппа, с полиоксидонием [37]. Сегодня она производится в промышленном масштабе на Уфимском заводе "Иммунопрепарат" и вот уже 7 лет широко используется в медицинской практике. За эти годы были вакцинированы около 50 миллионов реципиентов и получены обширные статистические данные, свидетельствующие о высокой эффективности и полной безвредности препарата. На основании этих данных Минздрав России рекомендовал "Гриппол" в качестве приоритетной противогриппозной вакцины для защиты всех групп населения. На рис. 17 приведены графики показателя заболеваемости гриппом в период эпидемии 1987-88 гг. на одну тысячу наблюдений у людей, вакцинированных "Грипполом", не вакцинированных, но проживавших среди вакцинированных (внутренний контроль), в сравнении с никак не затронутыми вакцинацией (внешний контроль). Эти данные говорят сами за себя.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Остается подвести итог рассказанной здесь истории совместных поисков и многолетнего научного содружества группы химиков - сотрудников и выпускников химического факультета МГУ, и группы иммунологов Института иммунологии Минздрава РФ.

Был открыт механизм имуностимулирующего действия полиэлектролитов, который состоит в усилении миграции Т- и В-клеток, клеточной кооперации, компенсации функции Т-клеток-по-мощников. В основе эффекта лежит кластеризация мембранных белков адсорбированным СПЭ, сопровождающаяся повышением проницаемости мембраны для ионов калия, натрия и кальция и активацией (Ыа+, К+)- и Са2+-АТФаз. Важно подчеркнуть, что мембраноактивность и соответственно иммуностимулирующие действия, присущие, как оказалось, полиэлектролитам с весьма различным химическим строением звена, критически зависят от степени полимеризации молекулярной цепи, т.е. обусловлены "полимерностью" как таковой. Это знание послужило фундаментом для поиска полиэлектролитной структуры, отвечающей всему комплексу фармакологических требований к медицинским препаратам. В результате был синтезирован новый полиэлектролит -сополимер, построенный из звеньев 1,4-этилен-пиперазин-Ы-оксида и (М-карбоксиметилен)-1,4-

этиленпиперазиний бромида ("Полиоксидоний"). Этот сополимер безвреден. Иммуностимулирующая активность в нем сочетается со способностью деструктировать в условиях организма и впоследствии полностью выводиться. "Полиоксидоний" разрешен и широко используется в России в качестве иммуностимулятора. Таким образом, впервые в медицинскую практику был внедрен синтетический полимер, биологическая активность которого обусловлена прямым физико-химическим воздействием макромолекул на клетки. До этого круг синтетических полимеров для медицины ограничивался веществами, использующимися в качестве конструкционных материалов, или химически нейтральными носителями низкомолекулярных лекарств.

Был сформулирован, экспериментально обоснован и подтвержден принцип создания конъюги-рованных полимер-субъединичных иммуногенов и вакцин путем присоединения антигенов к СПЭ-иммуностимуляторам. Иммуногенность и про-тективные свойства антигенов, ковалентно связанных с СПЭ, возрастают в десятки и сотни раз. Существенно, что иммуногены и вакцины, построенные по этому принципу, действуют "в обход" IR-генов, обеспечивая тем самым сильный иммунитет даже у организмов, генетически слабо реагирующих на данный антиген.

Использование этого принципа позволило создать первую в мире полимер-субъединичную вакцину для человека. Пример вакцины "Грип-пол" открыл путь для разработки вакцин нового поколения против других опасных инфекций. Завершается разработка (клинические и доклинические испытания) конъюгированных полимер-субъединичных вакцин против бруцеллеза, брюшного тифа, дизентерии, туберкулеза, ВИЧ, а также аллерговакцин (аллерготропинов).

Автор благодарит академика Р.В. Петрова и действительного члена Российской академии медицинских наук P.M. Хаитова за плодотворные обсуждения в ходе подготовки этого материала к публикации.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Hanks E.G., Ainsworth TJ. II Rad. Res. 1967. V. 32, P. 367.

2. Воробьев A.A., Васильев H.H. Адъюванты. М.: Медицина, 1969.

3. Земское В.М. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунолологии. 1972. № 3. С. 16.

4. Евдаков В.П., Гвоздецкий А.Н., Горохов A.A., Кабанов В.А., Петров Р.В. // Докл. АН СССР. 1974. Т. 214. № 4. С. 970.

5. Петров Р.В., Кабанов В.А., Гвоздецкий А.Н., Горохов A.A., Евдаков В.П., Кабанова Е.А. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунолологии. 1974. №11. С. 37.

6. Diamantstein Т., Vogt W., Rihl Н., Bogert G. // Eur. J. Immunol. 1973. V. 3. P. 408.

7. Кабанов B.A., Мустафаев М.И., Некрасов A.B., Норимов А.Ш., Петров Р.В., Хаитов P.M., Хаус-това Л.И. Ц Докл. АН СССР. 1984. Т. 274. № 4. С. 998.

8. Петров Р.В., Кабанов В.А., Хаитов P.M. // Иммунология. 1986. № 1. С. 5.

9. Kabanov VA. // Makromol. Chem., Macroml. Symp. 1986. V. l.P. 101.

10. Roitt /., Brostoff J., Male D.K. // Immunology. London; New York: Gover Med. Publ., 1985.

11. Хаитов P.M. Физиология иммунной системы. M.: ВИНИТИ. 2001.

12. Кабанов В.А., Евдаков В.П., Мустафаев ММ., Антипина АД. И Молек. биол. 1977. Т. 11 С. 5.

13. Kabanov VA., Zezin A.B., Mustafaev M.I., Ка-saikin VA. // Polymerie Amines and Ammonium Salts / Ed. by Goethals E.J. Oxford; New York: Pergamon Press. 1980. P. 173.

14. Зайцев B.C., Изумрудов B.A., Зезин А.Б., Кабанов В.А. // Докл. АН СССР. 1992. Т. 322. № 2. С. 318.

15. Атауллаханов Р.И., Петров Р.В., Хаитов P.M., Атауллаханов Ф.И., Абдуллаев Д.М. //Докл. АН СССР. 1984. Т. 274. № 2. С. 479.

16. Петров Р.В., Хаитов P.M., Атауллаханов Р.И. // Биол. мембраны. 1984. Т. 1. С. 599.

17. Разводовский Е.Ф., Берлин Ал.Ал., Некрасов A.B., Пущаева Л.М., Пучкова Н.Г., Ениколопян Н.С. // Высокомолек. соед. А. 1973. Т. 15. № 10. С. 2219.

18. Разводовский Е.Ф., Берлин Ал.Ал., Некрасов A.B., Пономаренко А.Т., Пущаева JI.M., Пучкова Н.Г., Ениколопян Н.С. // Высокомолек. соед. А. 1973. Т. 15. № 10. С. 2233.

19. Rasvodovskii E.F., Nekrasov A.V., Pushchaeva L.M., Morozova L.S., Markevich MA., Berlin AlAl.. Pono-marenko A.T., Enicolopyan N.S. // J. Macromol. Sei., Chem. 1984. V.8.№2. P. 241.

20. Пучкова Н.Г., Некрасов A.B., Разводовский Е.Ф., Эльцефон Б.С. // Высокомолек. соед. А. 1980. Т. 22. №6. С. 1281.

21. Pat. 5.503.830 USA. 1996.

22. Некрасов A.B., Пучкова Н.Г. // Высокомолек. соед. Б. 1983. Т. 25. № 9. С. 691.

23. Izumrudov VA., Savitskii А.Р., Bakeev K.M., Zezin A.B., Kabanov VA. // Makromol. Chem., Rapid Commun. 1984. V. 5. P. 709.

24. Кабанов В.А. //Высокомолек. соед. А. 1994. Т. 36. № 2. С. 183.

25. Бакеев К.Н., Изумрудов В.А., Кучанов СМ., Зе-зинА.Б., Кабанов В.А. // Докл. АН СССР. 1988. Т. 300. № 1. С. 132.

26. Ярославов А А. 1988 (неопубликованные данные).

27. Сухишвили С.А., Полинский A.C., Ярославов A.A., Чечик О.С., Кабанов В.А. // Докл. АН СССР. 1988. Т. 302. №2. С. 381.

28. Yaroslavov A.A., Polynsky AS., Sukhishvili S.A., Kabanov V.A. // Makromol. Chem., Macromol. Symp. 1989. V. 26. P. 265.

29. Kabanov V.A., Yaroslavov A.A., Sukhishvili SA. // J. Controlled Release. 1996. V. 39. P. 173.

30. Kabanov V.A., Yaroslavov A.A., Boronina O.V., Sukhishvili S.A. // J. Bioactive Compatible Polym. 1995. V. 10. P. 41.

31. Петров P.B., Евдаков В.П., Хаитов P.M., Филатова ЕД., Алексеева Н.Ю., Савинова И.В., Кожи-нова Е.В., Воронцов ЕД. // Докл. АН СССР. 1977. Т. 236. № 5. С. 1260.

32. Кабанов В.А., Мустафаев ММ., Норимов А.Ш., Петров Р.В., Хаитов P.M. // Докл. АН СССР. 1978. Т. 243. № 5. С. 1330.

33. Петров Р.В., Хаитов P.M., Норимов А.Ш., Кабанов В.А., Мустафаев ММ., Филатова ЕД. // Докл. АН СССР. 1979. Т. 249. № 1. С. 249.

34. Виноградов И.В., Кабанов В.А., Мустафаев ММ., Норимов А.Ш., Петров Р.В., Хаитов P.M. //Докл. АН СССР. 1982. Т. 263. № 1. С. 228

35. SelaM. //Science. 1969. V. 166. P. 1365.

36. BenacerrafB.//Ann. Immunol. C. 1974. V. 125. P. 143.

37. Petrov R.V., Kabanov V.A., Khaitov R.M., Nekrasov A.V., Ataullakhanov R.I. // Allergy and Clinical Immunology. 2003. V. 15. P. 56.

From Synthetic Polyelectrolytes to Polymer-Subunit Vaccines

V. A. Kabanov

Faculty of Chemistry, Moscow State University, Leninskie gory, Moscow, 119992 Russia

Abstract—Long-term studies on the use of synthetic polyelectrolytes in immunology are surveyed. It was found that quite various linear synthetic polyelectrolytes that are not structural analogues of biopolymers and, thus, are foreign to the immune system have a very significant effect on this system when introduced into the body. They noticeably enhance the formation of stem cells (precursors of all functional immune cells) in the bone marrow and their subsequent migration and population throughout the body. In addition, synthetic polyelectrolytes, not being antigens themselves, increase several times the production of antibodies complementary to introduced antigens, i.e., act as immune response stimulants when introduced together with typical antigens (proteins, natural bacterial polysaccharides, and their synthetic analogues). Later, it was shown that synthetic polyelectrolytes trigger the immune system via a mechanism other than the one usually realized in nature. Therefore, the efficiency of the defense reaction of the body becomes uncontrollable by immune response genes. The response turns out to be equally strong in both genetically well-protected and ill-protected species. Alternative triggering is based on the general properties of linear polyelectrolytes to aggregate proteins they have sorbed (in this case, proteins that are built in the cell membranes of B cells). A nontoxic immune modulator, the copolymer of 1,4-ethylenepiperazine N-oxide with (N-carboxymethylene)-l,4-ethylenepiperazinium bromide (trade name Polyoxydonium), was invented, which was allowed for administration to humans. However, the cardinal step on the way to next-generation vaccines was revealing the biological effect of conjugation of synthetic polyelectrolytes with bacterial antigens. Unlike simple mixtures, conjugates enhance tens and hundreds times an immune response. In this case, preliminary immunization protects animals against an absolutely lethal dose of corresponding bacteria and viruses. A Polyoxydonium conjugate with hemagglutinin and neuraminidase (influenza virus protein subunits) has become the world first non-Pasteurian vaccine Grippol successfully used in Russia (about fifty million vaccinations over the last seven years). The physicochemical mechanisms of biological action of these compounds and prospects for use of this approach are discussed.