CC BY
107
© в.в. рерих и др., 2013
остеоинтеграция гидроксиапатитовых гранул в телах поясничных позвонков
в эксперименте
В.В. Рерих1, А.Р. Аветисян1, А.М. Зайдман1, А.Д. Ластевский1, В.А. Батаев2, А.А. Никулина2
1Новосибирский НИИ травматологии и ортопедии им. Я.Л. Цивьяна 2Новосибирский государственный технический университет
Цель исследования. Верификация остеоинтеграции пористых биокерамических гранул на основе гидроксиапа-тита при гистологическом исследовании, включающем электронную сканирующую микроскопию, дополненную энергодисперсионной спектроскопией. Материал и методы. Эксперимент проведен на 6 беспородных собаках весом от 15 до 18 кг, которым проводилась имплантация гидроксиапатитовых гранул в тела поясничных позвонков. Срок наблюдения — 6 мес., затем проводилось гистологическое исследование препаратов при помощи световой микроскопии, сканирующей электронной микроскопии и энергодисперсионной спектрометрии.
Результаты. При гистологическом исследовании зон имплантации гранул в пространстве между ними обнаружена сформированная костная ткань трабекулярного строения, которая плотно прилегала к их поверхности. На границе между костной тканью и гидроксиапати-товыми гранулами соединительно-тканная капсула отсутствовала.
Заключение. Морфологические методы исследования с применением световой микроскопии, а также методы сканирующей электронной микроскопии и энергодисперсионной спектрометрии являются базовыми для верификации остеоинтеграции.
Ключевые слова: остеоинтеграция, гидроксиапатитовые биокерамические гранулы, эксперимент.
Для цитирования: Рерих В.В., Аветисян А.Р., Зайдман А.М., Ластевский А.Д, Батаев В.А., Никулина А.А. Остеоинтеграция гидроксиапатитовых гранул в телах поясничных позвонков в эксперименте // Хирургия позвоночника. 2013. № 4. С. 43—51.
experimental osseointegration of hydroxyapatite granules in the lumbar vertebral bodies
V.V. Rerikh, A.R. Avetisyan, A.M. Zaidman, A.D. Lastevsky, V.A. Bataev, A.A. Nikulina
Objective. To perform histological verification of osseointegration of porous bioceramic granules using scanning electron microscopy and energy-dispersive spectroscopy. Material and Methods. The experiment was conducted in six mongrel dogs weighing 15 to 18 kg which underwent implantation of hydroxyapatite bioceramic granules in the lumbar vertebral bodies. After 6-month follow-up period specimens were examined histologically using light microscopy, scanning electron microscopy, and energy-dispersive spectrometry.
Results. Histological examination of the implantation zones revealed trabecular bone tissue in spaces between the granules fitting closely to their surfaces. There was no connective tissue capsule on the border between the bone tissue and hydroxyapatite granules.
Conclusion. Morphological studies using light microscopy and scanning electron microscopy, as well as energy-dispersive spectrometry are basic methods for verification of osseointegration.
Key Words: osseointegration, hydroxyapatite bioceramic granules, experiment.
Hir. Pozvonoc. 2013;(4):43—51.
Дефекты костной ткани, образовывающиеся в результате травмы скелета, онкологических и инфекционных поражений опорно-двигательного аппарата, из-за неоднократных хирургических вмешательства, требуют
замещения различными материалами для восстановления формы сегмента опорно-двигательного аппарата и выполняемой им функции. В этой связи поиск пластических материалов и эффективных путей улучшения
43
остеогенеза в локусах дефицита костной ткани является принципиальной задачей реконструктивной медицины [5]. Современная тактика включает в себя использование аутологичных и аллогенных костных транспланта-
тов, а также альтернативных искусственных заместителей.
В настоящее время предпочитают применять аутотрансплантаты, несмотря на ограниченность количества забираемого трансплантата и возможные осложнения при заборе костной ткани [3, 12, 30, 31]. Аллогенные трансплантаты могут быть причиной развития клеточно-опосредованной иммунной реакции отторжения или носителями патогенных инфекционных агентов [14].
Существующие ограничения в применении этих видов трансплантатов поддерживают интерес к материалам синтетического и биологического происхождения. Первая группа материалов представляет собой импланта-ты со сложной внутренней архитектурой, имитирующей трабекулярную структуру губчатой кости, способствующей миграции, адгезии, пролиферации и дифференцировке предшественников остеобластов. Вторая группа заместителей является предметом более амбициозных стратегий, включающих в себя клеточные технологии и заключающихся в инженерии костной ткани в управляемых лабораторных условиях [28].
Среди искусственных материалов синтетического происхождения наиболее перспективными являются биокерамические. Их главное преимущество перед другими материалами (металлами, полимерами) - превосходная биосовместимость. Некоторые из них (биокерамика на основе А120з или ZrO2) инертны в физиологической среде, а другие (на основе гидро-ксиапатита, р-трикальцийфосфата, некоторые виды стеклокерамики) имеют контролируемые взаимодействия с тканями организма [10].
При существующем многообразии замещающих материалов универсальной мерой их применимости в клинической практике является их жесткая и асимптомная фиксация в костной ткани, достигаемая остеоинтеграци-ей [1].
В 1950 г. Вгапетагк et а1. [7, 8] впервые описали данное явление как способность титановых имплантатов быть
постоянно интегрированными в костную ткань. Albrektsson, Johansson [1] определили остеоинтеграцию как прямой контакт между костной тканью и имплантатом. В иллюстрированном медицинском словаре Dorland приводится гистологическое определение термина: прямая якорная фиксация имплантата посредством формирования костной ткани вокруг него без развития фиброзной ткани на границе «имплантат - кость» [1]. Предложено и биомеханическое определение осте-оинтеграции, которое является лишь частью процесса и отражает только клинический результат имплантации: это процесс, посредством которого достигается жесткая фиксация пластического материала и удерживается в кости при функциональной нагрузке [32].
Как следует из определений, под остеоинтеграцией подразумевается явление, при котором на микроскопическом уровне костная ткань и имплантат контактируют друг с другом, между ними нет разграничивающей соединительно-тканной капсулы.
Таким образом, в процессе верификации остеоинтеграции принципиальную роль играет возможность идентифицировать прямой контакт костной ткани и поверхности имплан-тата без разграничивающей соединительно-тканную капсулы между ними.
Остеоинтеграция происходит благодаря регенерации костной ткани, инициированной остеоиндуктив-ным воздействием, и остеокондукции, то есть способности имплантатов быть неким каркасом или основой для формирования и распространения костной ткани на своей пористой поверхности [1, 16, 29]. По данным Bose et al. [6], остеокондуктивностью обладают пористые материалы с размерами пор от 100 до 600 мкм. Alexander et al. [2] приводят данные о том, что общая пористость материала 90 % и размер пор более 100 мкм благоприятны для проникновения клеток в материал и врастания сосудов.
Репаративная регенерация запускается путем индукции клеток-предшественников или остеоиндукции.
Под этим термином понимают стимулирующее воздействие на недифференцированные клетки-предшественники, приводящее к их диффе-ренцировке в клетки, продуцирующие костную ткань, в остеобласты. Диффе-ренцировка предшественников происходит под действием остеоиндуктив-ных агентов (факторов роста).
Остеоиндуктивность была определена Urist (Цит. по: Capanna, De Biase, 2006) в 1965 г. Автором было продемонстрировано, что деминерализованный костный матрикс может вызывать формирование костной ткани в мышечном футляре. При дальнейшем изучении процесса остеоиндук-ции было установлено, что этот процесс регулируется особыми полипептидами, названными костными морфогенетическими белками (bone morphogenetic proteins - BMP), содержащимися в костной ткани. Только спустя 20 лет была установлена их молекулярная структура, на основе которой эти белки были классифицированы с присвоением им идентификационного номера. Точная роль BMP в процессе остеоиндукции изучается и в настоящее время. Исследования выявили существование и других белков, участвующих в индукции и формировании костной ткани. Эти полипептиды и BMP были объединены в группу эндогенных биологически активных веществ под названием «факторы роста» [9, 16, 20]. Под действием BMP и других эндогенных факторов роста костной ткани происходят пролиферация и дифферен-цировка мезенхимальных стволовых клеток, что в конечном итоге приводит к формированию популяции активных остеобластов, образовывающих костную ткань, заполняющую дефект в зоне имплантации.
Минеральный матрикс костной ткани преимущественно представлен кристаллами гидроксиапатита. Они связаны с окружающим коллагеном посредством белков, таких, как остео-кальцин, остеопонтин и остеонек-тин, которые занимают 3-5 % объема костной ткани и являются активными локусами биоминерализации. Эндо-
44
генные кристаллы гидроксиапатита в человеческой кости содержат анионы С032- и в следовых количествах Mg2+, Fe2+, С1- и F- [24].
Элементарный состав пластических гранул, рассматриваемых в данной статье, наиболее близок к составу минерального матрикса костной ткани. Это обстоятельство поддерживает интерес исследователей к данной группе материалов в поиске заместителей, максимально приближенных к костной ткани элементарным составом, внутренней архитектурой, физико-химическими и биологическими свойствами.
Цель исследования - верификация остеоинтеграции пористых биокерамических гранул на основе ги-дроксиапатита при гистологическом исследовании, включающем электронную сканирующую микроскопию, дополненную энергодисперсионной спектроскопией.
Материал и методы
Эксперимент проводили на 6 беспородных собаках весом от 15 до 18 кг. Выполняли имплантацию синтетических пластических гранул в тела поясничных позвонков лабораторных животных. Применяли пористые биокерамические гранулы (рис. 1) «BoneMedik-S» на основе гидроксиапатита размерами 0,5 на 1,0 мм, про-
изведенные из наружной твердой оболочки морского коралла.
Послеоперационное наблюдение длилось в течение 6 мес., затем проводили эвтаназию введением летальной дозы анестетика, после чего осуществляли забор материалов и их подготовку к морфологическому исследованию.
До операции, непосредственно после нее и через 6 мес. проводили рентгенографию поясничного отдела позвоночника лабораторных животных.
Эксперимент одобрен локальным этическим комитетом учреждения.
Хирургическая техника. Операции проводили с соблюдением требований асептики и антисептики в стерильных условиях операционной. Перед вмешательством осуществляли премедикацию внутримышечным введением следующих препаратов: 2 % раствора проме-дола (0,5 мл/кг), реланиума (5 мг), 1 % раствора димедрола (1 мл). Общая анестезия внутримышечным введением кетамина (15 мг/кг).
После подготовки кожных покровов и трехкратной обработки антисептиком выполняли левосторонний косой внебрюшинный доступ. Рассекали кожу, подкожную клетчатку, фасцию. Тупым путем разводили волокна наружной и внутренней косой мышцы, рассекали поперечную фасцию. Брюшной мешок отводили медиально и вверх. Обнажали передние отделы тел поясничных позвонков 1X3, L4).
В краниальной части тела позвонка на вентролатеральной поверхности слева сверлом диаметром 5 мм в направлении спереди назад и от периферии к центру формировали цилиндрический дефект костной ткани, слепо заканчивающийся в губчатом веществе тела позвонка глубиной 6 мм. Дефект заполняли гидрокси-апатитовыми гранулами (рис. 2).
Морфологическое исследование. Забор материалов для гистологического исследования осуществляли путем блоковой резекции тел позвонков, содержащих пластические гранулы. Забранные тела позвонков очищали от мягких тканей, подготавлива-
Рис. 2
Схема произведенного дефекта в теле поясничного позвонка беспородной собаки: 1 - пористые биокерамические гранулы на основе гидроксиапатита, заполняющие сформированный дефект; 2 - переднебоковая поверхность тела 14 позвонка; 3 - сформированный дефект в теле позвонка в виде цилиндра на переднебоко-вой поверхности тела в направлении спереди назад от периферии к центру, слепо заканчивающийся в теле позвонка на глубине 6 мм
45
_хирургия позвоночника i 4/2013 (с. 43-51)_
в.в. рерих и др. остеоинтеграция гидроксиапатитовых гранул в телах поясничных позвонков в эксперименте
ли к световой микроскопии фиксацией, декальцинацией и окрашиванием, к электронной микроскопии - фиксацией и дегидратацией.
Фиксацию проводили путем экспозиции препаратов в забуференном (рН = 7,4) 10 % растворе формалина в течение 3 сут с последующей дофиксацией в течение 1 сут в растворе, одна часть которого состояла из 1,5 % раствора параформа, а вторая часть из 1,5 % раствора глютарового альдегида.
Препараты, подлежащие световой микроскопии, декаль-цинировали в трилоне «Б» и окрашивали гемотокислином-эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону [21, 23].
Для электронной микроскопии проводили дегидратацию путем экспозиции в растворах спирта с возрастающей концентрацией.
Дегидратированные препараты заливали эпоксидной смолой и направляли на подготовку к электронной микроскопии.
Срезы препарата для исследований изготавливали на станке для малодеформационного резания металлов и керамик «Minitom» при скорости вращения диска 60 об./мин. Плоскость распила пересекала локусы имплантации пластических гранул в костную ткань, таким образом был осуществлен доступ для изучения границы «кость - имплантат». Образцы толщиной 5-10 мм закрепляли на предметных столиках с помощью токопроводящего углеродного скотча, затем в напылительной установке «Q150T ES» наносили слой золота толщиной 10 нм.
Подготовленный препарат с имплантатами анализировали на сканирующем электронном микроскопе «Carl Zeiss EVO50». Структурные исследования проводили при ускоряющем напряжении 5 кВ в режиме регистрации вторичных электронов.
Химический состав образца оценивали с использованием энергодисперсионного микроанализатора «INCA Energy» при ускоряющем напряжении 20 кВ [15, 22].
Энергодисперсионную спектрометрию проводили в десяти точечных локализациях на поверхности среза препарата (рис. 3). Статистическую обработку полученных цифровых данных осуществляли с применением программного пакета «PC Statistica» методом дисперсионного анализа ANOVA, позволяющего сравнивать значения трех и более групп.
Результаты
Во время наблюдения за животными в послеоперационном периоде осложнений не отмечено.
Рис. 3
Схема поверхности препарата и локализация точек проведения спектрального химического анализа: А - трабе-кулярная костная ткань тела позвонка; Б - пористая биокерамическая гранула на основе гидроксиапатита; 1, 2, 3 - точки на поверхности трабекул губчатой костной ткани в максимальном отдалении от имплантированных гранул, соответствуют интактной костной ткани тела позвонка; 4, 5, 6 - три равноудаленные друг от друга точки на поверхности структур, располагающихся по периферии пространства между имплантированными гранулами, соответствуют новообразованной костной ткани в периферической части сформированного дефекта; 7, 8, 9 - такие же точки, но расположенные в центре пространства между имплантированными гранулами, соответствуют новообразованной костной ткани в центральной части сформированного дефекта; 10 - точка на поверхности гидроксиапатитовых гранул
шшш
Г 1
-fp г
/' / > б
Рис. 4
Прицельная рентгенограмма L4 позвонка с имплантированными гидроксиапатитовыми гранулами в день операции (а) и через 6 мес. после операции (б): стрелками показана зона сформированного дефекта
46
При сравнении рентгенограмм поясничного отдела позвоночника прооперированного животного в прямой проекции, сделанных непосредственно после имплантации гидроксиапатитовых гранул (рис. 4а) и через 6 мес. после операции (рис. 4б), заметно увеличение интенсивности тени в зоне сформированного дефекта,
Рис. 5
Световая микрофотография зоны пограничной костной ткани в месте имплантации пластических гранул; окраска гематоксилином и эозином, ув. 60: обнаруживается сформированная костная ткань (1) трабекулярного строения со следами перестройки
заполненного пластическим материалом, что косвенно свидетельствует о врастании костной ткани в пространство между имплантированными гранулами.
Это подтверждается морфологическим исследованием полученных препаратов при помощи световой и сканирующей электронной микроскопии (рис. 5-7). На микрофотографиях плоскости распила тела позвонка через зону имплантации гидроксиапатито-вых гранул, сделанных после выведения животных из эксперимента через 6 мес. после операции, обнаруживается сформированная костная ткань трабекуляр-ного строения со следами перестройки, которая заполняет пространство между гранулами и плотно прилежит к их поверхности. На границе между костной тканью и гидроксиапатитовыми гранулами соединительно-тканная капсула отсутствует (рис. 6, 7).
При химическом анализе путем спектрометрии в заданных точках поверхности препаратов определялись весовые соотношения элементов О, С, Са, Р (рис. 8). Статистически обработанные результаты спектрометрии в точках на поверхности
трабекул интактной костной ткани вне зоны дефекта, на периферии и в центре новообразованной костной ткани приведены в табл на с. 49. При спектрометрии на поверхности гранул получены следующие данные: С - 23,39 %; О - 38,83 %; Р - 12,03 % и Са - 24,77 %.
При сравнении весовых процентов определяемых химических элементов, полученных при спектрометрии в различных локализациях на поверхности препаратов, химические составы морфологических образований, контактирующих с поверхностью гранул, и интактной костной ткани тела позвонка, располагающейся вне зоны сформированного во время операции дефекта, статистически достоверно не различались (статистическая значимость различий между средними величинами превосходит 0,05;). Таким образом, в пространство между гидроксиапатитовыми гранулами в сформированном дефекте тела позвонка врастала зрелая трабекуляр-ная костная ткань.
1 1 тт ЕНТ - 6,00 КУ £*дпа1 А = 5£1 ОЛв ;27 Ос* 2012
1 [ I \ЛЮ = Ю6гшя Мад = 41X РИо1о N0. = 3033 щщ
Рис. 6
Электронная микрофотография поверхности распила тела позвонка с имплантированными гранулами, ув. 41: через 6 мес. после имплантации в тело поясничного позвонка беспородной собаки отмечается прямой контакт костной ткани (1) и имплантированных гранул (2)
20 до ЕНТ - 5.00 кУ 31дпа1 А = ЕЕ \ Оа1е ;27 0с12012
МО = 10.5 тт Мад а 600 X РЬсКо № ■ ЭОве
Рис. 7
Электронная микрофотография поверхности распила тела позвонка и имплантированными гранулами, ув. 500: через 6 мес. после имплантации в тело поясничного позвонка беспородной собаки: 1 - имплантированная гранула, 2 - губчатая костная ткань тела позвонка
47
Сшвтр 1
к Л 1:
0 3 4 3
Том* «м>Пв 4В7В Ими. К^ПМЦ -0.022 <1357 1
ю: на
0 1 3 3 * 5 Топная ■ы™ Ш6 шип Курсор -0.022 <>405 инпО & а 9 1 кэВ;
в
в 1 а $ * $
Тогиая «капе 4076 имп Кчреарс .0.022 (1375 Ш1.)
Рис. 8
Результаты спектрометрии в различных локализациях: а - поверхность трабекул интактной костной ткани вне зоны дефекта; б - периферия новообразованной костной ткани; в - центр новообразованной костной ткани
а
б
Обсуждение
Минеральный матрикс костной ткани. Как известно, межклеточное вещество костной ткани представлено неорганическим компонентом, комби-
нированным с органическим матрик-сом, в основном из коллагена (главным образом I типа). Почти две трети веса и 40 % объема костной ткани приходятся на минеральные вещества [28]. Минеральный матрикс костной ткани
преимущественно представлен кристаллами гидроксиапатита, а его элементарный состав описывает химическая формула Са10(РО4)б(ОН)2 [24]. То есть значительное содержание Са и Р, обнаруживаемое при спектрометрии, отличает костную ткань от других видов соединительной ткани, например от волокнистой соединительной ткани, которая в том числе является основой для защитной рубцовой капсулы, покрывающей инородные тела внутри организма.
Так, при экспериментальном морфологическом исследовании препаратов позвонков крыс лабораторной линии Куо1ю^Маг с имплантированными биокерамическими гранулами посредством электронной микроскопии и энергодисперсионной спектрометрии были дифференцированы трабекулы костной ткани и соединительно-тканные образования. В отличие от костной ткани, где отмечалось высокое содержание О, С, Са, и Р, элементарный состав соединительнотканной капсулы на поверхности тела позвонка характеризовался значительным содержанием только С и О, а Са и Р присутствовали в следовых количествах [19].
Регенерация костной ткани на границе с имплантатом. Осте-оинтеграция обеспечивается процессом репаративной регенерации костной ткани и ее врастанием в поверхностные поры имплантатов, в котором участвуют клетки с различными функциями.
Организм реагирует на чужеродное тело с первых секунд после контакта с ним. На поверхности имплантата осаждаются белки опсонины в виде альбуминов, фибриногена, иммуноглобулина G и белков системы комплемента. Этот слой превращает имплан-тат в биологически распознаваемый материал.
Первыми клетками, прикрепляющимися к поверхности имплантата, являются фибробласты. Они начинают синтезировать коллаген, который осаждается на поверхности импланта-та. Эти клетки рекрутируются из окружающей имплантат мезенхимальной
48
Таблица Весовое содержание химических элементов при спектрометрии в различных локализациях на поверхности препарата, % (М ± а)
Локализация спектрометрии C O P Ca
Интактная костная ткань (п = 6) 34,58 ± 1,87 35,30 ± 0,95 10,25 ± 0,53 20,88 ± 1,14
Периферия новообразованной костной ткани в зоне дефекта (п = 6) 36,36 ± 2,23 32,31 ± 1,33 10,30 ± 0,48 21,27 ± 0,79
Центр новообразованной костной ткани в зоне дефекта (п = 6) 33,34 ± 3,49 34,29 ± 3,19 10,38 ± 0,27 20,87 ± 0,53
Статистическая значимость различий (Р) при сравнении средних величин (М) с учетом количества наблюдений (п) и стандартного отклонения (а) в соответствующих столбцах 0,169 0,068 0,877 0,662
ткани под сигнализирующим воздействием молекул, высвобождаемых клетками костной ткани и образовавшейся гематомы. Эти сигналы инициируют каскад формирования и резорбции костной ткани, благодаря чему происходят ее регенерация и ремоделирование.
Предшественники остеобластов располагаются во внутреннем слое надкостницы. Эти клетки могут дифференцироваться в остеобласты, находясь под действием ВМР-2, который еще способен стимулировать ангио-генез. Остеобласты синтезируют органический матрикс костной ткани.
Для дифференцировки остеокластов необходимы колониестимулиру-ющий фактор макрофагов и остеопро-тегерин лиганд, продуцируемые ретикулярными клетками костного мозга и остеобластами. Остеокласты расположены в области резорбции кости в лакунах Хоушипа. Остеокласты прикрепляются к резорбируемой поверхности кости за счет формирования замыкающего кольца из подосом - временных выростов цитоплазмы, содержащих F-актин, винкулин, талин, а-актинин. Через мембрану выростов из остеокластов выделяется большое количество Н+ и □", что создает и поддерживает в замкнутом пространстве лакуны кислую среду, оптимальную для растворения солей кальция.
Два типа клеток заинтересованы в механизме клеточной защиты при внедренном имплантате: макрофаги и гигантские клетки. В первые дни после образования дефекта костной ткани грануляционная ткань начинает его заполнять. Макрофаги, выделяя
интерлейкин-1, вызывают лимфоци-тарную инфильтрацию окружающих тканей, ангиогенез, продукцию антител и лимфокинов. Позже обнаруживаются макрофаги, утилизирующие эритроциты и некротизированные элементы. Они являются трансформированными моноцитами, которые попадают в место имплантации путем хемотак-сических и хемокинетических агентов, таких, как альфафактор некроза опухоли (TNF-a), факторов системы комплемента, лимфокинов, хемокинов, лейко-триенов, бактериальных фрагментов и некоторых других. Они прикрепляются к биоматериалу посредством различных рецепторов. Это прикрепление возможно при наличии белков опсони-нов, адсорбированных на поверхности имплантата [17].
С одной стороны, макрофаги посредством секреции биологически активных субстанций регулируют процессы заживления, с другой - некоторые из этих клеток могут быть центральным звеном, поддерживающим хронический воспалительный ответ на имплантацию биоматериала.
Макрофаги фагоцитируют и переваривают поврежденные клетки, их оставшиеся элементы, чужеродные субстанции. Не все биоматериалы могут быть ферментированы в макрофагах. Например, ферментативный аппарат в лизосомах макрофагов не способен переварить синтетические полимеры. По данным Nuss, von Rechenberg [17], некоторые авторы относят присутствие макрофагов вокруг имплантата к признакам хронической воспалительной реакции, тогда как другие характеризуют их наличие как атрибут деградации
49
биоматериала, способного резорбиро-ваться во внутренней среде организма.
Макрофаги также модулируют тканевую реакцию посредством продукции интерлейкинов, факторов роста и других биоактивных агентов. Важно подчеркнуть, что они могут быть предшественниками остеокластов и гигантских клеток.
Механический износ импланта-та (образование микрочастиц и продуктов трения) активирует фагоцитоз макрофагами, которые при этом секретируют Т№-а ПЛ р, й-6 и PGE2, стимулирующие дифференцировку предшественников остеокластов в зрелую форму.
Взаимодействия между макрофагами и лимфоцитами являются взаимодополняющими и взаимопотен-циирующими. Адгезия макрофагов на поверхности имплантата является инициирующим сигналом, активирующим лимфоциты, которые начинают высвобождать молекулы, увеличивающие активность макрофагов. Поэтому присутствие лимфоцитов и их активность в месте имплантации могут расцениваться как индикатор выраженной резорбции биоматериала.
При условии хронического воспаления, преобладании размера частиц вещества над размером макрофагов или неспособности остеокластов резорбировать материал, макрофаги объединяются (сливаются) друг с другом, образовывая гигантские клетки. Они могут иметь огромную величину (больше 1 мм2) и сотни ядер. Подобные клетки обнаруживаются в гранулемах, образованных под действием бактериальных патогенов при тубер-
кулезе или трихинеллезе. Индуцируют слияние макрофагов интерлей-кин-4 и -13. Эти клетки также играют центральную роль в процессе лизиса костной ткани вокруг имплантата, модулируя баланс активности остеобластов и остеокластов.
Гигантские клетки участвуют в процессе деградации имплантата. Они резорбируют частицы внедренного материала внутри себя, поглотив их, либо на своей поверхности путем выделения лизосомальных ферментов и активных форм кислорода. Эти клетки, дифференцировав в остеокласто-подобные клетки, могут лизировать костную ткань.
Таким образом, гигантские клетки участвуют в нормальном процессе заживления дефекта ткани после имплантации биоинертного или биодеградирующего биоматериала; их присутствие не угнетает формирование костной ткани, оно говорит о низкой резорбируемости имплантированного материала; наличие гигантских клеток при отсутствии других, индуктирующих воспалительный процесс, говорит о хорошей биосовместимости имплантата; гигантские клетки и макрофаги обеспечивают резорбцию и фрагментацию биодеградиру-ющего материала.
Если биоматериал не может быть резорбирован макрофагами и гигантскими клетками, образовывается фиброзная капсула, отграничивающая внедренный материал от окружающих тканей и предотвращающая дальнейшее взаимодействие между ними.
Острое воспаление с участием макрофагов и гигантских клеток в ответ на имплантацию является нормальным ответом организма и наблюдается в случаях имплантации как биосовместимых материалов, так и несовместимых. Только наличие постоянных провоспалительных стимулов (продукты окисления имплан-татов, продукты их механического износа) поддерживают процессы хронического воспаления с участием лимфоцитов и плазматических клеток. Это приводит к отграничению его от костной ткани соединительно-ткан-
ной капсулой [13, 17]. В проведенном эксперименте костная ткань находится в плотном контакте с имплантированными гранулами: отграничивающая соединительно-тканная капсула не обнаружена, что говорит об остео-интеграции имплантатов.
Методы верификации остеоин-теграции. Не всегда в исследованиях термин «остеоинтеграция» используется в значении морфологического понятия, подкрепленного гистологическими данными. Чаще это бывает в клинических исследованиях, когда забор гистологического материала после имплантации не может быть осуществлен, например в случаях оперативного лечения пациентов [18, 25]. В таких случаях применяют только рентгенологические методы.
Данная группа (рентгенография, КТ) является широко распространенной в исследованиях, это рутинные методы диагностики. Они применимы в том случае, если рентгеноплот-ность (проницаемость для рентгеновских лучей) имплантатов будет значительно превышать таковую костной ткани, ведь только при этом условии можно разграничить костную ткань и имплантат. Посредством рентгенологических методов совершенно точно можно оценивать регенерацию костной ткани вокруг импланта-та. Однако эти методы не позволяют идентифицировать тонкие соединительно-тканные капсулы (толщиной 1-5 мкм), разграничивающие костную ткань и поверхность имплантатов. Поэтому верификация остеоинтегра-ции на основе только рентгенологических методов исследования является неприемлемой.
В случае клинических исследований, когда забор имплантата вместе с окружающей костной тканью для гистологического изучения является неприемлемым, рентгенологические методы верификации остео-интеграции применимы, если предварительно в серийных наблюдениях на экспериментальной модели лабораторных животных установлена корреляция между рентгенологическими и морфологическими признаками
остеоинтеграции того же имплантата в тех же локализациях [26].
Достоверным методом верификации остеоинтеграции является морфологическое исследование с микроскопией границы «кость - имплантат», определяющей прямой контакт костной ткани и поверхности имплантата без разграничивающей соединительно-тканной капсулы, позволяющей провести морфометрический анализ. Световая микроскопия является рутинным методом, применимым для изучения результатов экспериментальных исследований на модели лабораторных животных [4, 11, 27]. Для более детальных исследований может быть применена сканирующая электронная микроскопия, позволяющая визуализировать границу «кость - имплан-тат», вплоть до нанометрических величин, изучить пространство внутри пор имплантатов. Электронная микроскопия может быть сопряжена с проведением энергодисперсионной спектрометрии для химического анализа морфологических элементов, что сделано в настоящем исследовании. Это может сообщить ценные сведения о качестве сформированной костной ткани.
Заключение
Гранулы на основе гидроксиапатита способны к остеоинтеграции, которая обеспечивается якорным врастанием костной ткани в поверхностные поры имплантатов.
В проведенном эксперименте через 6 мес. после имплантации пластического материала в пространство между гидроксиапатитовыми гранулами в сформированном дефекте тела позвонка образовалась зрелая трабе-кулярная костная ткань. На границе между костной тканью и гидроксиапа-титовыми гранулами соединительнотканная капсула отсутствовала.
Морфологические методы исследования с применением световой микроскопии и метод сканирующей электронной микроскопии и энергодисперсионной спектрометрии являются базовыми для верификации остеоинтеграции.
50
_хирургия позвоночника i 4/2013 (с. 43-51)_
в.в. рерих и др. остеоинтеграция гидроксиапатитовых гранул в телах поясничных позвонков в эксперименте
Литература
1. Albrektsson T, Johansson C. Osteoinduction, 12. Damien CJ, Parsons JR. Bone graft and bone graft fusion in rabbits compared with autograft. Spine. 2008;
osteoconduction and osseointegration. Eur Spine J. substitutes: a review of current technology and appli- 33: 1324-1329.
2001; 10(Suppl 2):S96-S101. cations. J Appl Biomater. 1991; 2: 187-208. 24. Supova M. Problem of hydroxyapatite dispersion in
2. Alexander D, Hoffmann J, Munz A, et al. Analy- 13. Eroschenko VP. DiFiore's Atlas of Histology with polymer matrices: a review. J Mater Sci Mater Med.
sis of OPLA scaffolds for bone engineering constructs Functional Correlations, 11th ed. Lippincott Williams 2009; 20: 1201-1213.
using human jaw periosteal cells. J Mater Sci Mater & Wilkins, 2008. 25. Thalgott JS, Klezl Z, Timlin M, et al. Anterior lum-
Med. 2008; 19:965-974. 14. Green D, Walsh D, Mann S, et al. The potential of bar interbody fusion with processed sea coral (coral-
3. Banwart JC, Asher MA, Hassanein RS. Iliac crest biomimesis in bone tissue engineering: lessons from line hydroxyapatite) as part of a circumferential fusion.
bone graft harvest donor site morbidity. A statistical the design and synthesis of invertebrate skeletons. Spine. 2002; 27: E518-E525.
evaluation. Spine. 1995; 20: 1055-1060. Bone. 2002; 30: 810-815. 26. Thalgott JS. Point of View. Spine. 2002; 27: E526.
4. Becker S, Maissen O, Ponomarev I, et al. Osteo- 15. Lindgren C, Hallman M, Sennerby L, et al. Back- 27. Uchida A, Araki N, Shinto Y, et al. The use of cal-
promotion by a beta tricalcium phosphate/bone mar- scattered electron imaging and elemental analysis of cium hydroxyapatite ceramic in bone tumour surgery.
row hybrid implant for use in spine surgery. Spine. retrieved bone tissue following sinus augmentation J Bone Joint Surg Br. 1990;72: 298-302.
2006; 31: 11-17. with deproteinized bovine bone or biphasic calcium 28. Vago R. Beyond the skeleton. Cnidarian biomaterials
5. Ben Nissan B. Biomimetics and bioceramics. phosphate. Clin Oral Implants Res. 2010; 21:924-930. as bioactive extracellular microenvironments for tis-
In: Reis RL, Weiner S (eds.). Learning from Nature DOI: 10.1111/j.1600-0501.2010.01933.x. sue engineering. Organogenesis. 2008; 4: 18-22.
How to Design New Implantable Biomaterialsis: From 16. Nakamura T. Biomaterial osteoinduction. J Orthop 29. Van Haastert RM, Grote JJ, Van Blitterswljk CA,
Biomineralization Fundamentals to Biomimetic Mate- Sci. 2007; 12: 111-112. et al. Osteoinduction within PEO/PBT copolymer
rials and Processing Routes. Netherlands: Kluwer Aca- 17. Nuss KM, von Rechenberg B. Biocompatibility implants in cranial defects using demineralized bone
demic Publishers, 2004:89-103. issues with modern implants in bone - A review for matrix. J Mater Sci Mater Med. 1994; 5:764-769.
6. Bose S, Darsell J, Hosick HL, et al. Processing and clinical orthopedics. Open Orthop J. 2008; 2:66-78. 30. Wigfield CC, Nelson RJ. Nonautologous interbody
characterization of porous alumina scaffolds. J Mater 18. Paderni S, Terzi S, Amendola L. Major bone defect fusion materials in cervical spine surgery: how strong
Sci: Mater Med. 2002; 13: 23-28. treatment with an osteoconductive bone substitute. is the evidence to justify their use? Spine. 2001; 26:
7. Branemark PI, Hansson BO, Adell R, et al. Osseo- Chir Organi Mov. 2009;93:89-96. 687-694.
integrated implants in the treatment of the edentulous 19. Rerikh V, Avetisyan A, Aronov A, et al. In vivo 31. Younger EM, Chapman MW. Morbidity at bone
jaw. Experience from a 10-year period. Scand J Plast implantation of new porous ceramic granules. Pro- graft donor sites. J Orthop Trauma. 1989; 3: 192-195.
Reconstr Surg Suppl. 1977; 16: 1-132. ceedings of 2nd International Conference on Com- 32. Zarb G, Albrektsson T. Osseointegration - a requi-
8. Branemark R, Branemark PI, Rydevik B, et al. petitive Materials and Technology Processes in em for the periodontal ligament? Editorial. Int J Peri-
Osseointegration in skeletal reconstruction and reha- Miskolc-Lillaf red, Hungary, October 8-12, 2012. Mis- odont Res Dent. 1991; 11: 88-91.
bilitation: a review. J Rehabil Res Dev. 2001; 38: kolc, 2012: 32.
175-181. 20. Sandhu HS. Bone morphogenetic proteins and spinal
9. Capanna R, De Biase P. Osteoinduction: Basic Prin- surgery. Spine. 2003; 28(15 Suppl): S64-S73.
ciples and Developments. In: Leung KS, Tagland G, 21. Shetty DC, Urs AB, Ahuja P, et al. Mineralized com-
Schnetter R, et al. (eds). Practice of Intramedullary ponents and their interpretation in the histogenesis of
Locked Nails. Springer Berlin Heidelberg, 2006: 32-42. peripheral ossifying fibroma. Indian J Dent Res. 2011;
10. Carter CB. Ceramics in biology and medicine. 22: 56-61.
In: Carter CB, Norton MG (eds). Ceramic Materials: 22. Slater N, Dasmah A, Sennerby L, et al. Back-
Science and Engineering. N. Y., 2007: 635-651. DOI: scattered electron imaging and elemental micro- Адрес для переписки:
10.1007/978-0-387-46271-4. analysis of retrieved bone tissue following maxillary Аветисян Арташес Робертович
11. Daculsi G, Uzel AP, Weiss P, et al. Developments sinus floor augmentation with calcium sulphate. 630091, Новосибирск, ул. Фрунзе, 17,
in injectable multiphasic biomaterials. The perfor- Clin Oral Implants Res. 2008;19: 814-822. DOI: НИИТО,
mance of microporous biphasic calcium phosphate 10.1111/j.1600-0501.2008.01550x. [email protected]
granules and hydrogels. J Mater Sci Mater Med. 2009; 23. Smucker JD, Bobst JA, Petersen EB. B2A peptide
21: 855-861. on ceramic granules enhance posterolateral spinal Статья поступила в редакцию 20.06.2013
Виктор Викторович Рерих, д-р мед. наук; Арташес Робертович Аветисян, аспирант; Алла Михайловна Зайдман, д-р мед. наук, проф.; Алексей Дмитриевич Ластевский, науч. сотрудник, Новосибирский НИИ травматологии и ортопедии им. Я.Л. Цивьяна; Владимир Андреевич Батаев, д-р техн. наук, проф.; Аэлита Александровна Никулина, канд. техн. наук, Новосибирский государственный технический университет. Viktor Viktorovich Rerikh, MD, DMSc; Artashes Robertovich Avetisyan, fellow; Ala Mikhailovna Zaidman, MD, DMSc, Prof.; Aleksey Dmitrievich Lastevsky, researcher, Novisibirsk Research Institute of Traumatology and Orthopaedics n. a. Ya.L. Tsivyan; Vladimir Andreyevich Bataev, DTechSc, Prof.; Aelita Aleksandrovna Nikulina, PhD in TechSc, Novosibirsk State Technical University.
51
