CC BY
13Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия «Биология, химия». Том 25 (64). 2012. № 4. С. 67-71.
УДК 634.42:57.085.2
ОСОБЕННОСТИИ РАЗВИТИЯ ЭКСПЛАНТОВ ФЕЙХОА НА ЭТАПЕ ВВЕДЕНИЯ В УСЛОВИЯХ IN VITRO
Иванова Н.Н., Митрофанова И.В., Шишкина Е.Л.
Никитский ботанический сад - Национальный научный центр НААН Украины, Ялта, Украина
E-mail: in_vitro@ ukr. net
Разработан способ получения асептической культуры фейхоа в условиях in vitro, позволяющий получить до 80% жизнеспособных эксплантов, свободных от контаминации. Изучены особенности развития первичных эксплантов на этапе введения в культуру in vitro. Показано влияние зеатина и БАП в модифицированной питательной среде МС на регенерацию микропобегов фейхоа. Ключевые слова: фейхоа, экспланты, морфогенез, регенерация, микропобег.
ВВЕДЕНИЕ
Вечнозеленое субтропическое растение фейхоа - сравнительно новая культура для Украины. Родина ее - Южная Америка. Род Feijoa Berg. относят к семейству (Myrtaceae) Juss. (Миртовые; надпорядок Myrtanae) [1]. В Европе фейхоа появилась в 1890 г. В Никитском ботаническом саду первые декоративные насаждения фейхоа были заложены в 1910 г. завезенными из Сухумского ботанического сада саженцами. Сегодня коллекция фейхоа в НБС-ННЦ насчитывает около четырехсот форм, возраст которых составляет более 30-70 лет. Плоды фейхоа употребляются в свежем и переработанном виде. Они богаты пектинами, углеводами, витамином С, Р - активными веществами, полифенольными соединениями с преобладанием катехинов.
Исследования последних лет показали, что успешное размножение отдельных сортов и форм фейхоа возможно с применением культуры органов и тканей [2-5]. В настоящее время особый интерес представляет изучение и выявление общих закономерностей возможности реализации органогенеза и соматического эмбриогенеза у перспективных сортов и форм фейхоа из коллекции НБС-ННЦ и разработка биотехнологических приемов их размножения и сохранения.
Цель наших исследований - выявить морфогенетический потенциал эксплантов фейхоа на начальных этапах культивирования в условиях in vitro, получить асептическую культуру и изучить особенности развития первичных эксплантов растений сорта Никитская Ароматная и перспективных крупноплодных форм Ф1 и Ф2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследования проведены на базе лаборатории биохимии, биотехнологии и вирусологии растений НБС-ННЦ НААН Украины. Исходный растительный
материал - растения фейхоа сорта Никитская Ароматная и перспективных селекционных форм Ф1 и Ф2 коллекционных насаждений НБС-ННЦ. Стерилизацию растительного материала и его введение в изолированную культуру проводили в ламинарных боксах марки Fatran (Чехия). При стерилизации инструментов, лабораторной посуды и питательных сред придерживались общепринятых методов асептики [6, 7]. В качестве первичных эксплантов использовали меристематические ткани и вегетативные почки однолетних побегов. Для освобождения эксплантов от экзогенной инфекции применяли 70%-ный этиловый спирт (С2Н5ОН), Domestos (2-4%-ный раствор гипохлорита натрия NaClO), Украина, Дез ТАБ (0,45% активного хлора в растворе), Украина, 1% раствор Thimerosal (Германия).
Экспланты культивировали на модифицированной нами питательной среде Мурасиге и Скуга (1962) [8]. Для индукции морфогенеза в качестве регуляторов роста использовали зеатин, кинетин и 6-бензиламинопурин (БАП). Стерилизацию питательных сред осуществляли в автоклаве при давлении 0,7-0,8 атм. в течение 2025 мин.
Культуральные сосуды с изолированными эксплантами помещали в климатическую комнату с температурой 22-25°С, 16-часовым фотопериодом, интенсивностью освещения 2-3 клк. Инфицированные и погибшие экспланты удаляли, а жизнеспособные переносили на среду для дальнейшего культивирования. Субкультивирование эксплантов проводили через 3-4 недели. Учитывали количество регенерировавших микропобегов с одного экспланта. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы «Математическая статистика», версия 6.0.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В настоящее время в ряде научных публикаций представлены сведения о приемах стерилизации различных культур [9-12]. Однако, как показали наши исследования, часто при проведении стерилизации происходит сильное повреждение растительных тканей, поэтому необходимо было применять наименее токсичные реагенты, подбирая их концентрацию и экспозицию стерилизации. Развитие вегетативных почек фейхоа в условиях in vitro зависело от сезона года, на протяжении которого изолировали первичные экспланты. В результате проведенных нами экспериментов установлено, что наилучшим сроком отбора эксплантов фейхоа является июнь-сентябрь, с появлением зеленых вызревших побегов. В этот период они лучше переносят стерилизацию и активнее начинают развиваться. На этапе введения в культуру in vitro применение известных способов стерилизации оказалось не эффективным, так как при этом наблюдалась низкая жизнеспособность эксплантов и высокий уровень контаминации. Для получения асептической культуры фейхоа было изучено действие различных реагентов, их концентраций и экспозиций (табл.1). Как видно из таблицы 1, оптимальной оказалась ступенчатая стерилизация, которая выполнялась в следующей последовательности: растительный материал погружали в 70%-ный раствор этилового спирта, затем 0,3% раствор Дез ТАБ и 1% раствор Thimerosal. После
каждого реагента экспланты промывали в стерильной дистиллированной воде, что позволило получить до 80% свободных от контаминации. При этом экспланты не меняли окраску и проявляли высокую способность к морфогенезу. При использовании 2-4% раствора гипохлорита натрия эффективность стерилизации была низкой: уровень контаминации составлял 65-75%. Регенерационный потенциал стерильных эксплантов был низким и не превышал 3-8%. Как видно из данных, приведенных в таблице 1, только 3-8% стерильных эксплантов были способны к дальнейшей регенерации микропобегов. Сокращение экспозиции стерилизации увеличивало частоту контаминации эксплантов.
Таблица 1
Результаты стерилизации различными способами эксплантов Feijoa sellowiana Berg.
Способ Режим Количество эксплантов, %
стерилизации стерилизации, мин инфицированных развившихся
1. 70 %-ный С2Н5ОН 1 20,0 ± 5,6 50,0 ± 11,7
0,3%-ный р-р Дез 6-15
ТАБ 10
1% р-р ТЫшего8а1
2. 70%-ный С2Н5ОН 1 75,0 ± 7,36 8,0 ± 4,5
2%-ный р-р Боше81о8 6-18
3. 70%-ный С2Н5ОН 1
4%-ный р-р Боше81;о8 6 65,0 ± 16,5 3,0 ± 1,9
Жизнеспособные экспланты фейхоа помещали на питательную среду МС в нашей модификации, дополненную регуляторами роста. Применение питательной среды МС обусловлено тем, что в ее составе содержится повышенная концентрация неорганического азота за счет присутствия аммонийного и нитратного азота. Это обеспечивает стабильность протекания процессов дифференциации и способствует получению регенерантов. Для снижения отрицательного воздействия на растительные ткани фенолов, которые, как правило, у древесных растений выделяются на месте среза растительных тканей, обычно используют антиоксиданты: аскорбиновую кислоту, глютатион [2, 10, 13]. Нашими опытами показано положительное влияние аскорбиновой кислоты на первом этапе культивирования, что снижало ингибирующее действие фенолов и способствовало повышению жизнеспособности эксплантов. Эксперименты показали, что испытанные нами регуляторы роста оказывали различное влияние на рост основного побега и активацию пазушных почек, которые наблюдали в течение первого пассажа (до 55%). При этом одновременно с развитием главного побега было отмечено формирование 1-2 адвентвных почек. Такие побеги разделяли на микрочеренки с вегетативной почкой и культивировали на среде МС, дополненной 1,85-2,73 мкМ зеатина или 2,22-3,55 мкМ БАП (табл. 2). Дальнейшее увеличение концентрации цитокининов приводило к формированию каллуса, оводнению микропобегов и их гибели. Уменьшение
концентрации зеатина до 0,91-1,36 мкМ и БАП до 2,22 мкМ в питательной среде заметно снижало частоту побегообразования, но способствовало вытягиванию. Сравнительный анализ результатов испытания регуляторов роста на индукцию побегообразования показал необходимость введения последнего в состав питательной среды МС. Исключение цитокинина из состава питательной среды полностью подавляло как образование пазушных побегов, так и апикальный рост. Культивирование микропобегов в течение двух пассажей на среде МС без зеатина приводило к некрозу верхушек побегов, потемнению стебля, отмиранию листьев и завершалось полной гибелью побега. Как видно из данных, представленных в таблице 2 при концентрации БАП 0,88-1,33 мкМ ни в одном из вариантов опытов формирование микропобегов не отмечено. Кинетин в используемых нами концентрациях (0,93 - 9,30 мкМ) замедлял регенерацию микропобегов исследуемых генотипов фейхоа, при этом активизировал образование и рост каллуса в базальной части вегетативной почки. Полученные данные согласуются с ранее полученными результатами по размножению отдельных сортов и форм фейхоа с применением культуры органов и тканей [2, 3]. Полученные в процессе эксперимента микропобеги достигали 4,5-5 см и при этом не имели морфологических отклонений.
Таблица 2
Влияние концентрации БАП и зеатина на регенерацию микропобегов из изолированных вегетативных почек Feijoa sellowiana Berg, после 4-х недельного культивирования в условиях in vitro
Концентрация цитокинина, Среднее количество микропобегов /
мкМ на изолированную почку, шт.
Контроль* 0,2 ± 0,1
Зеатин
0,91 1,7 ± 0,1
1,36 2,5 ± 0,1
2,73 2,9 ± 1,3
4,56 3,1 ± 0,8
9,12 3,7 ± 1,2
БАП
0,88 0
1,33 0
2,22 1,3 ± 0,1
4,40 1,8 ± 0,1
Примечание. *Контроль - питательная среда без цитокинина
ВЫВОД
Таким образом, в процессе исследований разработаны приемы получения асептической культуры эксплантов фейхоа сорта Никитская Ароматная и селекционных форм Ф1 и Ф2. Установлены особенности морфогенеза вегетативных почек в условиях in vitro и подобраны оптимальные концентрации регуляторов роста
в питательной среде МС для этапов индукции развития морфогенеза эксплантов и регенерации микропобегов.
Список литературы
1. Субтропические плодовые и орехоплодные культуры: Научно-справочное издание. - Симферополь: ИТ «АРИАЛ», 2012. - С. 157-168.
2. Кондратенко О.Н. Влияние различных концентраций витаминов на рост и развитие растений фейхоа в культуре in vitro / О.Н. Кондратенко, И.В. Митрофанова // Ученые записки Таврического нац. ун-та им. В.И. Вернадского. Серия Биология. - 2003. - Т. 16 (55), № 2. - С. 98-102.
3. In vitro morphogenesis in Feijoa sellowiana. Somatic embryogenesis and plant regeneration / M.P. Guerra, R. Pescador, L. Dal Vesco [et al.] // Acta Hort (ISHS). - 1997. - Vol. 452 - Р. 27-36.
4. Protocolo de micropropagajao da goiabeira serrana (Acca sellowiana (Berg) Burret) / A.C. Oltramari, L.L.D. Vesco, E.L. Pedrotti [et al.] // Ciencia Rural. - 2000. - V. 30, №. 1. - Р. 61-68
5. Somatic embryogenesis from floral tissues of feijoa (Feijoa sellowiana Berg) / S. Stefanello, L.L. Dal Vesco, J.P. Ducroquet [et al.] // Scientia Horticulturae. - 2005. - Vol. 105, №1. - P. 117-126.
6. Калинин Ф.Л. Технология микроклонального размножения растений./ Калинин Ф.Л., Кушнир Г.П., Сарнацкая В.В. - Киев: Наукова думка, 1992. - 232 с.
7. Митрофанова О.В. Методы биотехнологии в селекции и размножении субтропических и косточковых плодовых культур / О.В. Митрофанова, И.В. Митрофанова, А.В. Смыков, Н.П. Лесникова // Интенсификация селекции плодовых культур: Труды Никит. ботан. сада. - 1999. - Т. 118 - С. 189-200.
8. Murashige T. A revised medium for rapid growth and bioassays tobaco tissue culture / T. Murashige, F. Skoog // Physiol. Plant. -1962. - Vol. 15, № 3. - P. 473-497.
9. Иванова Н.Н. Клональное микроразмножение некоторых лиственных декоративных растений / Н.Н. Иванова // Биотехнологические исследования садовых и других ценных многолетних культур: Труды Никит. ботан. сада. - 1977. - Т. 119. - С. 153-168.
10. Черевченко Т.М. Биотехнология тропических и субтропических растений in vitro. / Черевченко Т.М., Лаврентьева А.Н., Иванников Р.В. - Киев: Наукова думка, 2008. - 559 с.
11. Basal S.K. Ornamental Plant sand Biotechnology. / Basal S.K. - Iaipur : Book Enclave, 2007. - V. VIII. - 308 p.
12. Dixson R.A. Plant cell culture: a practical approach. / Dixson R.A. - Oxford, Washington: IPL Press Limited, 1985. - 236 p.
13. Митрофанова И.В. Регенерация in vitro микропобегов из вегетативных почек зизифуса китайского (Zizyphus jujuba Mill.) и физические факторы культивирования / И.В. Митрофанова // Бюл. Никит. бот. Сада. - 2003. - Вып. 87. - С. 63-66.
1ванова Н.М. Особливост розвитку експлан™ фейхоа на еташ введення в умови in vitro / Н.М. 1ванова, 1.В. Митрофанова, О.Л. Шишкша // Вчеш записки Тавршського нацюнального ушверситету iм. В.1. Вернадського. Серiя „Бюлопя, хiмiя". - 2012. - Т. 25 (64), № 4. - С. 67-71. Розроблено споЫб отримання асептично! культури фейхоа в умовах in vitro, який дозволяе отримати до 80% життездатних експланив, вшьних вщ контамшацп. Показано вплив зеатину та БАП в модифкованому поживному середовищi МС на регенеращю мжропагошв в умовах in vitro. Ключовi слова: фейхоа, експлантЦ морфогенез, регенеращя, мкропапн.
Ivanova N.N. Peculiarities of development of feijoa explants in condition in vitro on the stape of introduction / N.N. Ivanova, I.V. Mitrofanova, E.L. Shishkina // Scientific Notes of Taurida V.I. Vernadsky National University. - Series: Biology, chemistry. - 2012. - Vol. 25 (64), No 4. - Р. 67-71. The method of obtaining of aseptical culture of feijoa in condition in vitro allawed to receive 80% of vitable explants free from contamination has been worked out. The peculiarities of development of primary explants on the stage of introduction in culture in vitro have been studied. The influence of zeatine and BA in modificated medium MS on the regeneration of feijoa microshoots has been shown. Keywords: explants, morphogenesis, regeneration, microshoot.
Поступила в редакцию 17.11.2012 г.
