CC BY
44
ISSN 2304-9081
Учредители: Уральское отделение РАН Оренбургский научный центр УрО РАН
Бюллетень >ренбургского научного центра
УрО РАН
2015 * № 1
Электронный журнал On-line версия журнала на сайте http://www.elmag.uran.ru
© Коллектив авторов, 2015 УДК: 547.964:571.27
1 1 1 2 3
В.А. Зурочка , М.А. Добрынина , А.В. Зурочка , В.А. Гриценко ,
ОСОБЕННОСТИ ВЛИЯНИЯ СИНТЕТИЧЕСКОГО ПЕПТИДА АКТИВНОГО ЦЕНТРА ГМ-КСФ НА РОСТ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ КОККОВ IN VITRO
1 Институт иммунологии и физиологии УрО РАН, Екатеринбург, Россия
2 Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, Оренбург, Россия
о
Оренбургский научный центр УрО РАН, Оренбург, Россия
Цель. Установить характер влияния синтетического пептида активного центра гра-нулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) ZP-2 на рост в жидкой питательной среде грамположительных кокков разной таксономической принадлежности.
Материалы и методы. Объектами исследования послужили музейные культуры Micrococcus luteus var. lysodeikticus, Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis. В экспериментах использовали опытный образец синтетического пептида активного центра ГМ-КСФ - ZP2 (химическая формула - THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO), полученный твердофазным способом на синтезаторе «Applied Biosystems 430A». Влияние данного пептида на рост грамположительных кокков определялось in vitro при его внесении в жидкую питательную среду с градиентом концентраций (10, 30 и 100 мкг/мл) путем динамического замера оптической плотности (OD) бактериальных культур - 0, 2, 4, 6 и 24 часа.
Результаты. Синтетический пептид активного центра ГМ-КСФ - ZP2 при добавлении в жидкую питательную среду дозо-зависимо ингибировал рост грамположительных кокков. При этом выраженность ингибирующего эффекта ZP2 зависела от рода/вида бактерий и фазы роста бактериальной культуры.
Заключение. Синтетический пептид активного центра ГМ-КСФ - ZP2) оказывает на рост грамположительных кокков в жидкой питательной среде ингибирующее действие, особенности которого зависят от концентрации вещества, таксономической принадлежности бактерий и фазы развития бактериальной культуры.
Ключевые слова: гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), активный центр, синтетический пептид, грамположительные кокки, Micrococcus luteus var. lysodeikticus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, рост, инги-бирование.
1 1 1 2 3
V.A. Zurochka , M.A. Dobrynina , A. V. Zurochka , V.A. Gritsenko '
FEATURES OF SYNTHETIC PEPTIDES ACTIVE CENTER GM-CSF' INFLUENCE ON GROWHT OF GRAM-POSITIVE COCCI IN VITRO
1 Institute of Immunology and Physiology UrB RAS, Ekaterinburg, Russia
2 Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis UrB RAS, Orenburg, Russia
3
Orenburg Scientific Centre UrB RAS, Orenburg, Russia
Objective. To establish the nature of the influence of synthetic peptide of the active site of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) - ZP2 on the growth of grampositive cocci with different taxonomic affiliation in liquid medium.
Materials and methods. The objects of study were the museum cultures Micrococcus luteus var. lysodeikticus, Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. In experiments prototype of synthetic peptide of the active site of GM-CSF - ZP2 (chemical formula - THR
NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO), obtained by solid-phase method on a synthesizer «Applied Biosystems 430A» was used. Effect of peptide on the growth grampolozhi-tional cocci determined in vitro by its introduction into the liquid medium with a gradient of concentrations (10, 30 and 100 ug / ml) by measuring the dynamic optical density (OD) of bacterial cultures - 0, 2, 4, 6 and 24 hours
Results. A synthetic peptide of the active site of the GM-CSF - ZP2 when added to liquid culture medium dose-dependently inhibited the growth of gram-positive cocci. The expression of the inhibitory effect ZP2 depended on the genus/species of bacteria and the growth phase of the bacterial culture.
Conclusion. A synthetic peptide of the active site of the GM-CSF - ZP2 has on the growth of Gram-positive cocci in a liquid nutrient medium inhibitory effect, whose characteristics depend on the substance concentration, taxonomic origin of bacteria and development phases of a bacterial culture.
Key words: granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), the active center, synthetic peptide, Gram-positive cocci, Micrococcus luteus var. lysodeikticus, Staphylo-coccus aureus, Staphylococcus epidermidis, growth, inhibition.
Введение
Любые повреждения тканей макроорганизма сопровождаются воспалительной реакцией с выработкой клетками иммунной системы различных ци-токинов, выполняющих регуляторную функцию [1].
Одним из таких цитокинов является гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), состоящий из 127 аминокислот и стимулирующий костномозговое кроветворение, в частности рост и диф-ференцировку гемопоэтических клеток таких линий, как гранулоциты, макрофаги и эозинофилы [2]. В то же время результаты последующих исследований биологических эффектов активного центра ГМ-КСФ и его синтетических аналогов показали, что эти соединения обладают плейотропным действием, проявляя помимо основной функции иммуномодулирующую, репарационную и антибактериальную активность [3-6], что определяет перспективность их использования в качестве основы при создании новых лекарственных препаратов для клинической практики [7].
Особый интерес привлекают синтетические пептиды активного центра ГМ-КСФ и, в частности, ZP2 (химическая формула - THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO), который обладает относительно высокой активностью во всем спектре указанных биологических эффектов [4, 5]. Вместе с тем пока отсутствуют данные об особенностях влияния этого синтетического пептида на рост в жидкой питательной среде грамположи-тельных кокков, принадлежащих к разным таксонам (род/вид) и отличающихся друг от друга степенью патогенности.
В этой связи целью настоящего исследования явился анализ характера влияния синтетического пептида активного центра ГМ-КСФ - ZP2 на рост в жидкой питательной среде грамположительных кокков разной таксономической принадлежности.
Материалы и методы
Объектами исследования служили музейные культуры Micrococcus lu-teus var. lysodeikticus (АТСС 4698), Staphylococcus aureus 209P (ATCC 6538-P) и Staphylococcus epidermidis №711 (из коллекции ИКВС УрО РАН).
В работе использован опытный образец синтетического пептида активного центра ГМ-КСФ - ZP2 (химическая формула - THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO), полученный твердофазным способом на синтезаторе «Applied Biosystems 430A». Влияние данного пептида на рост грамположительных кокков определялось in vitro при его внесении в жидкую питательную среду с градиентом концентраций: 10, 30 и 100 мкг/мл.
Исследование влияния ZP-2 на рост грамположительных кокков производилось путем инкубации бактериальной культуры в течение 24 часов в микроячейках пластиковой планшеты в присутствии ZP-2. Для этого 25 мкл
о
бактериальной взвеси, содержащей 5х10 КОЕ/мл, приготовленной из суточной агаровой культуры бактерий, и 25 мкл раствора ZP-2 вносились в микроячейки, содержащие 200 мкл мясо-пептонного бульона (МПБ), с последующей инкубацией в термостате при 370С. Развитие бактерий в жидкой среде определялось путем измерения оптической плотности культуры ^Д) в каждой из микроячеек при длине волны (X) 492 нм на Multiscan Accent (Thermo Labsystems, Финляндия). В настоящем исследовании ОД культур замерялась на 0 (исходный уровень), 2, 4, 6 и 24 часах инкубации.
Для определения выраженности влияния ZP-2 на рост бактериальных культур рассчитывали Индекс ингибирования (ИИ) по формуле [8]:
ИИ= OДк - OДо/OДк* 100%,
где ИИ - Индекс ингибирования (%); OДк и O До - оптическая плотность контрольной и опытной культур соответственно. Индекс ингибирова-ния бактериальных популяций оценивался на 2, 4, 6 и 24 часах.
Полученные данные обработаны с помощью программы Statistica 10 (StatSoft Inc., 2011) методами вариационной статистики с вычислением из 5 измерений средней арифметической и ее ошибки (M±m). О достоверности отличий между контролем и опытом судили по критерию Стьюдента - t [9].
Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2015, № 1 Результаты и их обсуждение
Как видно из рисунка 1, внесение в питательную среду синтетического пептида активного центра ГМ-КСФ - ZP2 оказывало заметное тормозящее влияние на рост M. luteus var. lysodeikticus.
0 2 4 6 24 Время инкубации (час)
Рис. 1. Влияние на рост популяции M. luteus var. lysodeikticus (ОД, усл. ед.) ZP2 при разной концентрации (мкг/мл): 1 - 10; 2 - 30; 3 - 100; К -контроль; * - достоверные отличия от контроля ф<0,05).
При этом ингибирующий эффект ZP2 в отношении микрококка зависел как от концентрации фактора в среде культивирования, так и от фазы развития бактериальной популяции (табл. 1).
Следует отметить, что в диапазоне изученных концентраций ZP2 (10100 мкг/мл) Индекс ингибирования роста популяции M. luteus var. lysodeikti-cus градиентно увеличивался на 4, 6 и 24 часах культивирования, свидетельствуя о дозо-зависимом эффекте влияния данного соединения на размножение микрококка в жидкой питательной среде (МПБ). Максимально выраженное ингибирование размножения M. luteus var. lysodeikticus наблюдалось на 24 часах, и при концентрациях ZP2 10, 30 и 100 мкг/мл оно соответственно
составило 24,5±0,6, 34,9±2,1 и 42,8±2,0% относительно контроля.
Таблица 1.Зависимость Индекса ингибирования (ИИ, %) роста в жидкой питательной среде M. luteus var. lysodeikticus от концентрации 7Р2 и фазы культивирования
Время культивирования Индекс ингибирования (ИИ, %) роста бактерий при разной концентрации 7Р2 в питательной среде
10 мкг/мл 30 мкг/мл 100 мкг/мл
2 час -13,3±0,8* -15,3±1,1* -14,7±1,2*
4 час 1,2±0,3 3,9±0,8 5,3±0,4
6 час 14,3±0,5* 21,4±1,4* 28,6±1,2*
24 час 24,5±0,6* 34,9±2,1* 42,8±2,0*
* - достоверные отличия от контроля (p<0,05); то же - для таблиц 2 и 3.
Вместе с тем обращает на себя внимание тот факт, что на ранней фазе культивирования (2 часа инкубирования) наблюдался парадоксальный эффект - ZP2 «стимулировал» рост микрококка, о чем свидетельствовали более высокая оптическая плотность (ОД) опытных культур (0,017 против 0,015 усл.ед. в контроле) и отрицательные значения Индекса ингибирования (-13,3±0,8...-15,3±1,1%).
Возможно, это явление связано с особенностями действия ZP2 на взвесь M. luteus var. lysodeikticus, приготовленную из суточной агаровой культуры микрококка, в которой бактериальные клетки находились в стационарной фазе развития и, очевидно, проявляют меньшую чувствительность к ингибирующей активности данного пептида. Указанное предположение подтверждается увеличением Индексов ингибирования (с 1,2-5,3 до 14,328,6%) на более поздних сроках инкубирования - на 4 и 6 часах соответственно, когда культуры вступают в фазу с интенсивного роста. Следует подчеркнуть, что аналогичный характер влияния антибактериальных веществ на рост микроорганизмов ранее описан применительно к катионному пептиду лейкоцитов «Интерциду» в отношении Escherichia coli К12, когда эшерихии в присутствии данного соединения демонстрировали более высокий темп роста на ранних стадиях развития культуры в сравнении с контролем [8].
Синтетический пептид активного центра ГМ-КСФ - ZP2 существенно и дозо-зависимо влиял на рост S. aureus 209P в жидкой питательной среде, снижая биомассу бактерий, оцениваемую по величине оптической плотности контрольных и опытных культур в динамике их развития (рис. 2).
Рис. 2. Влияние на рост популяции S. aureus 209P (ОД, усл. ед.) ZP2 при
разной концентрации (мкг/мл): 1 - 10; 2 - 30; 3 - 100; К - контроль.
При этом наиболее выраженный ингибирующий эффект ZP2 наблюдался на 6 часах инкубации S. aureus 209P и составил 14,7±0,6, 18,8±0,6 и 20,3±0,7% для концентраций - 10, 30 и 100 мкг/мл соответственно (табл. 2).
Таблица 2. Зависимость Индекса ингибирования (ИИ, %) роста в жидкой питательной среде S. aureus 209P от концентрации ZP2 и фазы культивирования
Время культивирования Индекс ингибирования (ИИ, %) роста бактерий при разной концентрации ZP2 в питательной среде
10 мкг/мл 30 мкг/мл 100 мкг/мл
2 час -1,1±0,2 1,1±0,4 3,3±0,3
4 час 11,2±0,4* 14,6±0,5* 16,6±0,5*
6 час 14,7±0,6* 18,8±0,6* 20,3±0,7*
24 час 4,2±0,5 8,2±0,8* 16,5±0,7*
Сравнивая особенности влияния синтетического пептида активного центра ГМ-КСФ - ZP2 на рост музейных штаммов золотистого стафилококка и микрококка, следует подчеркнуть обнаруженное сходство и имеющиеся межродовые отличия реакции этих бактерий на данный пептид. В обоих случаях ингибирующий эффект ZP2 зависел от концентрации фактора (дозо-зависимость) и нарастал при переходе бактериальных культур в фазу интенсивного роста (с 2 до 6 часов). Однако максимальные значения Индекса ин-гибирования роста S. aureus 209P наблюдались на 6 часах, тогда как наиболее выраженное снижение биомассы (относительно контроля) у M. luteus var. ly-sodeikticus регистрировалось на 24 часах.
Характер роста популяции S. epidermidis №711 в МПБ при воздействии
Рис. 3. Влияние на рост популяции epidermidis №711 (ОД, усл. ед.) 7Р2 при разной концентрации (мкг/мл): 1 - 10; 2 - 30; 3 - 100; К - контроль; * - достоверные отличия от контроля (р<0,05).
Как и в опытах с S. aureus 209P, культуры эпидермального стафилококка наиболее выражено замедляли свой рост в присутствии ZP2 на 4-6 часах, когда отмечался четкий дозо-зависимый эффект ингибирования развития популяций бактерий (табл. 3).
Таблица 3. Зависимость Индекса ингибирования (ИИ, %) роста в жидкой питательной среде S. epidermidis №711 от концентрации ZP2 и фазы культивирования
Время культивирования Индекс ингибироЕ разной концент ания (ИИ, %) роста бактерий при рации ZP2 в питательной среде
10 мкг/мл 30 мкг/мл 100 мкг/мл
2 час 0,1±0,1 -3,8±0,4 -2,6±0,4
4 час 16,9±0,3* 20,2±0,4* 23,6±0,3*
6 час 21,4±0,7* 25,0±0,6* 32,1±0,8*
24 час 24,7±0,7* 25,0±0,5* 25,3±0,6*
Вместе с тем особенностью влияния ZP2 на рост S. epidermidis №711 являлось то, что Индекс ингибирования на 24 часах сохранялся на относительно высоких уровнях (24,7-25,3%), тогда как в опытах с золотистым стафилококком значения этого показателя к 24 часам снижались (относительно 6 часов) и не превышали 4,2-16,5% (см. табл. 2).
Заключение
Оценивая полученные результаты в целом, можно констатировать, что синтетический пептид активного центра ГМ-КСФ - ZP2 при добавлении в жидкую питательную среду дозо-зависимо ингибировал рост грамположи-тельных кокков. При этом выраженность ингибирующего эффекта ZP2 зависела от таксономической принадлежности (род/вид) микроорганизмов и фазы роста бактериальных культур.
Исходя из представленных данных, указанный пептид наиболее интенсивно ингибировал развитие популяций грамположительных кокков в фазу их максимальной ростовой активности, которая наблюдалась в период со 2 часа по 6 час. При этом проявления ингибирующего эффекта ZP2 на 24 часах в большей степени сохранялись в случаях M. luteus var. lysodeikticus и S. epidermidis №711, тогда как в опытах с S. aureus 209P значения Индекса инги-бирования несколько снижались, что могло отражать своеобразную адаптацию этих микроорганизмов к антибактериальному действию данного пептида и/или более высокую устойчивость золотистых стафилококков, переходящих
8
в стационарную фазу, характеризующуюся замедлением темпа роста.
Учитывая, что этиологическими агентами многих инфекционно-воспалительных заболеваний, в том числе эндогенной природы, являются золотистые и коагулазоотрицательные стафилококки, описанные особенности влияния синтетический пептид активного центра ГМ-КСФ - ZP2 на эталонные микроорганизмы могут служить реперной информацией для дальнейших исследований, конечной целью которых должно стать обоснование использование указанного пептида в качестве действующего начала новых лекарственных препаратов для борьбы с инфекционной патологией [4, 6, 7].
ЛИТЕРАТУРА
1. Иммунология: структура и функции иммунной системы / Под ред. Р.М. Хаитова. М., 2013. 280 с.
2. Murphy J.M., Young I.G. IL-3, IL-5, and GM-CSF signaling: crystal structure of the human beta-common receptor. Vitam. Horm. 2006. 74: 1-30. DOI:10.1016/S0083-6729(06)74001-8.
3. Зурочка А.В., Зурочка В.А., Суховей Ю.Г. и др. Иммунотропные и биологические эффекты синтетических пептидов активного центра ГМ-КСФ. Вестник уральской медицинской академической науки. 2011. 2/2 (35): 23-24.
4. Зурочка А.В., Зурочка В.А., Костоломова Е.Г. и др. Антибактериальные, иммунотропные и репарационные свойства пептидов активного центра ГМ-КСФ, различных де-фенсинов и веществ, полученных из супернатантов CD34+45--клеток - предшественников гемопоэза. Российский иммунологический журнал. 2012. Т. 6 (14). 3 (1): 78-79.
5. Зурочка А.В. Зурочка В.А., Костоломова Е.Г. и др. Сравнительная характеристика антибактериальных свойств синтетических пептидов активного центра GM-CSF и веществ, полученных из супернатантов CD34+45dim клеток-предшественников гемопоэза. Цитокины и воспаление. 2012. Т. 11. 2: 96-99.
6. Зурочка А.В., Зурочка В.А., Добрынина М.А., Зуева Е.Б., Гольцова И.А., Гриценко В.А. Новые подходы к изучению спектра биологической активности синтетических пептидов активного центра ГМ-КСФ. Российский иммунологический журнал 2014. Т. 8 (17). 3: 690-693.
7. Гриценко В.А., Аминин Д.Л., Зурочка А.В. и др. Некоторые биологические эффекты иммономодуляторов естественного и синтетического происхождения in vitro как основа создания новых лекарственных средств для борьбы с эндогенными инфекциями. Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН. 2012. 3: 1-17 (URL: http:// el-mag.uran.ru/magazine/Numbers/2012-3%20/Articles/15GricenkoVA-ADL-ZAV.pdf).
8. Бухарин О.В., Гриценко В.А. Влияние in vitro препарата лейкоцитарного катионного белка "Интерцид" на Escherichia coli. Антибиот. и химиотер. 2000. 45 (1): 16-20.
9. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1990. 352 с.
Поступила 30.03.2015 г.
(Контактная информация: Зурочка Владимир Александрович - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Института иммунологии и физиологии УрО РАН; адрес: 620049, г. Екатеринбург, ул. Первомайская, 106; тел.: +7(343)374-00-70; Email: v_zurochka@mail.ru;
Добрынина Мария Александровна - аспирант Института иммунологии и физиологии УрО РАН; адрес: 620049, г. Екатеринбург, ул. Первомайская, 106; тел.: +7(343)374-00-70; E-mail: secretar@iip.uran.ru;
Зурочка Александр Владимирович - доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник Института иммунологии и физиологии УрО РАН; адрес: 620049, г. Екатеринбург, ул. Первомайская, 106; тел.: +7(343)374-00-70; E-mail: av zurochka@mail.ru;
Гриценко Виктор Александрович - доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, ученый секретарь Президиума Оренбургского научного центра УрО РАН; адрес: 460000, г. Оренбург, ул. Пионерская, 11; тел.: +7(3532)77-05-12; E-mail: vag59@mail.ru)
LITERATURA
1. Immunologija: struktura i funkcii immunnoj sistemy / Pod red. R.M. Haitova. M., 2013. 280 s.
2. Murphy J.M., Young I.G. IL-3, IL-5, and GM-CSF signaling: crystal structure of the human beta-common receptor. Vitam. Horm. 2006. 74: 1-30. DOI:10.1016/S0083-6729(06)74001-8.
3. Zurochka A.V., Zurochka V.A., Suhovej Ju.G. i dr. Immunotropnye i biologicheskie jeffekty sinteticheskih peptidov aktivnogo centra GM-KSF. Vestnik ural'skoj medicinskoj akademicheskoj nauki. 2011. 2/2 (35): 23-24.
4. Zurochka A.V., Zurochka V.A., Kostolomova E.G. i dr. Antibakterial'nye, immunotropnye i reparacionnye svojstva peptidov aktivnogo centra GM-KSF, razlichnyh de-fensinov i veshhestv, poluchennyh iz supernatantov CD34+45--kletok - predshestvennikov gemopojeza. Rossijskij immunologicheskij zhurnal. 2012. T. 6 (14). 3 (1): 78-79.
5. Zurochka A.V. Zurochka V.A., Kostolomova E.G. i dr. Sravnitel'naja harakteristika antibakterial'nyh svojstv sinteticheskih peptidov aktivnogo centra GM-CSF i veshhestv, poluchennyh iz supernatantov CD34+45dim kletok-predshestvennikov gemopojeza. Citokiny i vospalenie. 2012. T. 11. 2: 96-99.
6. Zurochka A.V., Zurochka V.A., Dobrynina M.A., Zueva E.B., Gol'cova I.A., Gricenko V.A. Novye podhody k izucheniju spektra biologicheskoj aktivnosti sinteticheskih peptidov aktivnogo centra GM-KSF. Rossijskij immunologicheskij zhurnal 2014. T. 8 (17). 3: 690-693.
7. Gritsenko V.A., Aminin D.L., Zurochka A.V. i dr. Nekotorye biologicheskie jeffekty immonomoduljatorov estestvennogo i sinteticheskogo proishozhdenija in vitro kak osnova sozdanija novyh lekarstvennyh sredstv dlja bor'by s jendogennymi infekcijami. Bjulleten' Orenburgskogo nauchnogo centra UrO RAN. 2012. 3: 1-17 (URL: http:// elmag.uran.ru/magazine/Numbers/2012-3%20/Articles/15GricenkoVA-ADL-ZAV.pdf).
8. Buharin O.V., Gritsenko V.A. Vlijanie in vitro preparata lejkocitarnogo kationnogo belka "Intercid" na Escherichia coli. Antibiot. i himioter. 2000. 45 (1): 16-20.
9. Lakin G.F. Biometrija. M.: Vysshaja shkola, 1990. 352 s.
