CC BY
13
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
УДК 57.017.645
ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРОПОСТРОЕНИЯ ФАЦИЙ ПЛАЗМЫ КРОВИ И ФАЦИЙ ГОМОГЕНАТОВ ТКАНИ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС _ПРЕПУБЕРТАТНОГО ПЕРИОДА_
Никитина Юлия Викторовна,
Канд.биол.наук, доцент Князева Елена Сергеевна, Канд.биол.наук, доцент Щербатюк Татьяна Григорьевна,
Профессор, доктор биол.наук, заведующий кафедрой Кафедра биологии ФГБОУ ВО ПИМУМинздрава России,
г. Нижний Новгород
АННОТАЦИЯ
Целью нашего исследования явилось изучение особенностей построения фаций плазмы крови и фаций го-могенатов ткани головного мозга крыс препубертатного периода. Эксперименты выполнены на 52 белых нелинейных крысах: самцах и самках (2 и 3,5 месяцев). Структуропостроение фаций гомогенатов ткани головного мозга и фаций плазмы крови крыс оценивали методом клиновидной дегидратации [1]. Поведенческую активность крыс изучали в тесте «открытое поле» [2]. Для определения свободнорадикальных показателей использовали методы биохемилюминесценции [3], определения молекулярных продуктов пе-рекисного окисления липидов (ПОЛ) [4, 5, 6, 7], перекисного окисления белков [8, 9, 10], активности ан-тиоксидантных ферментов [11, 12, 13, 14]. Полученные данные были обработаны с помощью программ Microsoft Excel и Statistica 6.0. Выявлены возрастные изменения ширины периферической зоны и увеличение количества структур морфологической подложки в центральной зоне фаций плазмы крови крыс 3,5 месяцев по сравнению с 2 месячными животными. Обнаружена сходная картина фаций плазмы крови самок 2 месяцев и самцов 3,5 месяцев. Корреляционный анализ выявил взаимосвязь особенностей структурных элементов морфологической картины биожидкости и показателей свободнорадикального окисления, и показателей функционального состояния ЦНС крыс.
ABSTRACT
The purpose of our study was the investigation of morphological construction of facies of blood plasma and facies of brain tissue homogenates of rats prepubertal period, and identification the correlation between morphological construction of facies and values of behavioral activity of rats, and values of free radical processes in brain tissue and blood of animals. Experiments were included 52 white nonlinear males and females rats (2 and 3.5 months). The structure of facies was evaluated by the method of wedge dehydration [1]. Behavioral activity of rats was studied by method «open field test» [2]. The free radical values were determined by using the method of biochemiluminescence [3], the method of determination of the molecular products of lipid peroxidation (LPO) [4, 5, 6], protein peroxidation [7, 8, 9, 10] and the method of determination of an activity of antioxidant enzymes [11, 12, 13, 14]. The width of the peripheral zone of blood plasma facies was depended from the age of the animals. The number of morphological structures of the substrate in the central zone of blood plasma facies of rats 3.5 months increased compared to rats 2 months. Structures of the blood plasma facies of females 2 months and of males 3.5 months are similar. The correlation analysis showed the relationship of structural elements of facies and the parameters of free radical oxidation, and the parameters of the functional state of the Central nervous system of rats.
Ключевые слова: фации плазмы крови, фации гомогенатов ткани головного мозга, корреляционная зависимость, свободнорадикальные процессы, поведенческая активность самок и самцов крыс препубертатного периода.
Keywords: facies of blood plasma, facies of homogenates of the brain tissue, a correlation, free radical processes, the behavioral activity of female and male rats in prepubertal period.
Одним из методов визуализации молекулярной структуры биожидкости является метод клиновидной дегидратации, позволяющий оценить изменения, происходящие в организме по изменению структуропостроения биожидкости. Показано, что метод клиновидной дегидратации дает возможность экспресс-оценки ответа организма на действие экзо-
генных и эндогенных факторов [15]. Дифференциро-вочные процессы в тканях в препубертатный период сопровождаются накоплением и закономерным распределением нуклеопротеидов, белков, ли-пидов и других биологически активных веществ, участвующих в построении тканей и органов, поставляющих энергию и осуществляющие специфические функции. В процессе развития происходит
не только накопление биологически активных веществ, но изменение их свойств (растворимости, электрофоретической активности), интенсивности обмена, способность образовать комплексы [16, 17]. Работами Карпухиной М.Б. и др. [18] выявлена взаимосвязь показателей липидного обмена с морфологическими структурами кристаллической картины биожидкости. Целью нашего исследования явилось изучение особенностей построения фаций плазмы крови и фаций гомогенатов ткани головного мозга крыс периода полового созревания и выявление корреляционных взаимосвязей особенностей построения структур фаций и показателей функциональной активности ЦНС, свободнорадикальных процессов в ткани головного мозга и крови животных.
Методы. Эксперименты выполнены на 52 белых нелинейных крысах: самцах и самках. Интакт-ные животные содержались в стандартных условиях вивария. Все процедуры обращения с экспериментальными животными соответствовали Приказу Минздрава России № 267 от 19.06.03 «Об утверждении правил лабораторной практики в Российской Федерации» и согласованы с правилами, установленными этическим комитетом при ГБОУ ВПО НижГМА Минздрава РФ. Забор экспериментального материала проводили при достижении животными возраста 2 месяца (препубертатный период I) и 3,5 месяца (препубертатный период II) [19].
Методом клиновидной дегидратации оценивали структуропостроение гомогенатов головного мозга и плазмы крови крыс [1]. С целью максимально быстрой фиксации ткани головного мозга для адекватного сохранения состояния обмена применяли метод замораживания головного мозга in situ. Гомогенат ткани головного мозга готовили из расчета 1 г ткани к 3 мл фосфатного буфера pH = 7,5. Исследуемый материал помещали на поверхность предметного стекла пипеточным микродозатором в объеме 0,01 мл (диаметр капли - 5-7 мм, средняя толщина - около 1мм). Высушивание проводили в течение 24 часов при температуре 20-250С, относительной влажности 65-70%, минимальной подвижности воздуха. Готовый к изучению образец исследовали с помощью светового микроскопа (увеличение х40). Проводили анализ общей структуры фации на наличие зон и детальный анализ особенностей структуры каждой зоны. Для наблюдаемых структурных признаков фаций определяли их степень выраженности в баллах, а также частоту встречаемости в группе в процентах.
Для выявления корреляционной взаимосвязи морфологических особенностей строения фаций и показателей свободнорадикальных активности проводили оценку возрастных изменений свобод-норадикальных процессов в ткани головного мозга и крови крыс на основе изучения показателей моле-
5
кулярных продуктов перекисного окисления липи-дов (ПОЛ): диеновых конъюгатов (ДК), триеновых конъюгатов (ТК), двойных связей (ДС) [4, 5], малонового диалдегида [6, 7], окислительной модификации белков (ОМБ): альдегид-динитрофенилгидра-зоны (АДНФГ) и кетон-динитрофенилгидразонов (КДНФГ) [8, 9, 10], активности антиоксидантных ферментов: супероксиддисмутазы (СОД) [11] и ка-талазы [12], биохемилюминесценции: максимальной интенсивности биохемилюминесценции (I max) и общей антиоксидантной активности (оАОА) [3].
Для выявления корреляционной взаимосвязи морфологических особенностей строения фаций гомогенатов ткани головного мозга и функционального состояния ЦНС крыс изучали поведенческую активность крыс в тесте «открытое поле» [2]. Определяли: горизонтальную двигательную активность - общее количество пересеченных квадратов в тесте «открытое поле»; ориентировочно-исследовательскую активность - количество пересеченных центральных квадратов и количество вертикальных стоек; уровень тревожности, которое характеризовалось общим временем реакции замирания; эмоциональное состояние, которое характеризовалось количеством актов груминга [20].
Полученные данные были обработаны с помощью программ Microsoft Exel и Statistica 6.0. Оценку достоверности отличий проводили по критериям непараметрической статистики.
Результаты. Морфологическая картина плазмы крови животных в возрасте 2 месяцев характеризуется наличием среднего количества радиальных трещин, небольшим количеством конкреций в периферической зоне. В центральной зоне морфологическая подложка представлена дендри-тами средней величины (рис.1). Сравнение фаций плазмы крови животных по половому признаку в пределах группы 2 месяца показало, что у самок, во-первых, шире периферическая зона, во-вторых, большее количество дендритов в центральной зоне.
Структуропостроение плазмы крови крыс в возрасте 3,5 месяцев имеют существенные различия как по сравнению с группой 2 месячных животных, так и в пределах группы между самцами и самками. В фациях самцов увеличилась ширина периферической зоны и количество дендритов в центральной зоне, то есть морфологическая картина плазмы крови крыс-самцов 3,5 месяцев имеет такое же структуропостроение, как у крыс-самок 2 месяцев, что возможно связано с тем, что самки млекопитающих достигают половой зрелости раньше самцов. В фациях плазмы крови самок в возрасте 3,5 месяцев в отличие от самок 2 месяцев периферическая зона представлена хаотичной сетью трещин, которые продолжаются в центральную зону. Морфологическая подложка центральной зоны характеризуется большим количеством завитков.
ИРЛт- у самцы 2 месяца Щ Гу|| самки 2 месяца
самцы 3,5 месяца самки 3,5 месяца
Рисунок 1. Морфологическая картина фаций плазмы крови крыс 2 и 3,5 месяцев
Структура фаций гомогенатов мозга крыс 2 и 3,5 месяцев (рис. 2) имеет незначительные различия. Исследуемые образцы гомогенатов ткани головного мозга животных в возрасте 2 месяцев характеризуются узкой периферической зоной с сетью мелких трещин и наличием тонких, ветвящихся дендритов в центральной зоне и кристаллическими крестообразными включениями.
В гомогенатах головного мозга крыс 3,5 месяцев увеличение ширины краевой зоны и количества в ней трещин. В морфологической подложке отмечалось повышение размеров всех структурных элементов и увеличение количества тонких, линейных крестообразных с различной степенью разветвления дендритов. Структуропостроение фаций самцов характеризуется большим количеством крестообразных линейных дендритов, в отличие от самок.
Рисунок 2. Морфологическая картина гомогенатов ткани головного мозга крыс 2 и 3,5 месяцев
Корреляционный анализ (г - коэффициент линейной корреляции Спирмена, р - уровень статистической значимости) показал, что ширина периферической зоны фации плазмы крови обратно пропорциональна активности каталазы (г=-0,71; р=0,03) и интенсивности продуктов окислительной модификации белков (г=-0,72; р=0,028). Конкреции периферической зоны: количество, размер, форма прямо пропорциональны продуктам перекисного
окисления липидов: ТК (г=0,78; р=0,021), МДА (г=0,85; р=0,03) и общей антиоксидантной активности, определенной методом биохемилюминесцен-ции (г=0,84; р=0,017). Форма конкреций находилась в обратной зависимости от резервных возможностей организма к окислительному стрессу (г=-0,82; р=0,01), расчет которых проводили по фор. ЮО%<ОМБ.-ОМБвд) х 100 %
Выявлена положительная корреляционная связь между показателями интенсивности перекис-ного окисления липидов и размером и формой трещин периферической зоны: ДК и ДС (r=0,79; р=0,03), МДА (r=0,59; р=0,03), I max (r=0,79; р=0,036), оАОА (r=-0,95; р=0,0008). Количество трещин периферической зоны обратно пропорционально общей АОА (r=-0,83; р=0,02). Показано, что количество трещин, количество конкреций и ширина периферической зоны зависят от количества общего белка в плазме крови (r=0,75; р=0,0003). Выявлена обратная корреляционная взаимосвязь между количеством, размером листов, количеством морщин и показателями интенсивности окислительной модификации белков (r=-0,8; р=0,017) и активностью каталазы в крови (r=-0,72; р=0,028).
Корреляционный анализ особенностей построения фаций гомогенатов ткани головного мозга крыс и показателей поведенческой активности крыс в тесте «открытое поле» выявил прямую зависимость между прозрачностью фации и ориентировочно-исследовательской активностью животных (r=0,97; р=0,0003), между формой морщин центральной зоны и ориентировочно- исследовательской активностью животных (r=-0,92; р=0,009). Показана отрицательная корреляционная зависимость между формой морщин центральной зоны и уровнем тревожности крыс (r=-0,75; р=0,013), количеством морщин центральной зоны и ориентировочно- исследовательской активностью животных (r=-0,84; р=0,036).
Ширина периферической зоны фации ткани головного мозга обратно пропорциональна показателям ориентировочно-исследовательской активности (r=-0,7; р=0,025), горизонтальной двигательной активности (r=-0,83; р=0,042) и прямо пропорциональна уровню тревожности крыс, который характеризовался временем реакции замирания животных (r=0,72; р=0,019).
При статистическом анализе данных полученных при изучении фаций гомогенатов ткани головного мозга и показателей перекисного окисления липидов были выявлены следующие корреляционные взаимосвязи: прозрачность фаций прямо коррелировала с интенсивностью перекисного окисления липидов и активностью СОД в ткани головного мозга (МДА (r=0,53; р=0,04) и СОД (r=0,72; р=0,028)). Ширина периферической зоны имела обратную зависимость от количества ТК (r=-0,83; р=0,04) и прямую - от активности СОД (r=0,82; р=0,007). Выявлена прямая корреляция между количеством морщин центральной зоны и активностью антиоксидантных ферментов: СОД (r=0,87; р=0,01) и каталазы (r=0,67; р=0,007). Обратная корреляционная связь показана между количеством морщин центральной зоны и количеством продуктов перекисного окисления липидов: ДК (r=-0,84; р=0,03) и ТК (r=-0,84; р=0,03). Форма морщин центральной зоны находилась в обратной корреляционной зависимости от активности антиоксидант-ных ферментов: СОД (r=-0,83; р=0,021) и каталазы (r=-0,55; р=0,03).
7
Заключение. Таким образом, в результате проведенного исследования выявлены возрастные изменения ширины периферической зоны и увеличение количества структур морфологической подложки в центральной зоне фаций плазмы крови крыс 3,5 месяцев по сравнению с 2 месячными животными. Обнаружена сходная картина фаций плазмы крови самок 2 месяцев и самцов 3,5 месяцев. В фациях гомогенатов головного мозга крыс 3,5 месяцев наблюдалось незначительное изменение всех исследуемых параметров по сравнению с фациями гомогенатов головного мозга крыс 2 месяцев.
Корреляционный анализ выявил связь свобод-норадикального окисления с элементами морфологической картины биожидкости, а также связь морфологической картины фаций гомогенатов мозга с функциональным состоянием ЦНС. Известно, что периферическая зона фации образована органическими компонентами, в частности, белковыми и ли-пидными, в связи с этим, изменение размера, формы структурных элементов можно объяснить изменением метаболических процессов. Показано, что ширина периферической зоны, количество трещин и конкреций фации плазмы крови зависят от количества общего белка в ней. Ширина периферической зоны, количество листов и морщин, размер листов находились в обратной зависимости от активности каталазы и значений показателей окислительной модификации белков в плазме крови. Количество, размер, форма конкреций и трещин периферической зоны были прямо пропорциональны значению показателей продуктов перекисного окисления липидов и общей антиоксидантной активности в крови крыс.
При статистическом анализе данных полученных при изучении фаций гомогенатов ткани головного мозга были выявлены следующие корреляционные взаимосвязи: прозрачность фаций прямо коррелировала с интенсивностью перекисного окисления липидов и активностью СОД в ткани головного мозга. Ширина периферической зоны, количество морщин в центральной зоне напрямую зависели от активности антиоксидантных ферментов. Форма морщин центральной зоны, напротив, находилась в обратной корреляционной зависимости от активности антиоксидантных ферментов в ткани головного мозга крыс периода полового созревания.
Список литературы:
1. Шабалин, В.Н., Шатохина С.Н. Морфология биологических жидкостей человека, М.: Хри-зостом, 2001. - 304 с.
2. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Д.П.. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения, М.: Высш. шк., 1991. - 399 с.
3. Кузьмина Е.И., Нелюбин М.К., Щенникова А.С. Применение индуцированной хемилюминес-ценции для оценки свободнорадикальных реакций в биологических субстратах / Межвузовский сборник биохимии и биофизики микроорганизмов. -Горький, 1983. - С. 179 - 183.
4. Fletcher D.L. Measurement of fluorescent lipid peroxidation products in biological system and tissues / D.L. Fletcher, C.J. Dillared, A.Y. Tappel // Ana-lyt. Biochem. - 1973. - V. 52. - N. 3. - P. 497 - 499.
5. Folch, J. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues / J. Folch, M. Less, S. Stanley // Biol. Chem. - 1957. - V. 226. - N. 2. - P. 497 - 509.
6. Smith J.B. Malondialdehyde formathionas an indicathion of prostoglandin production by human pleteles // J.B. Smith, C.M. Jngerman, M.I. Silver // I. Lab. Clin. Med. - 1976. - V. 88. - N. 4. - P. 167 - 172.
7. Современные методы в биохимии / под ред. Ореховича В.Н. - Медицина, 1977. - 392 с.
8. Determination of carbonyl content in oxida-tively modified proteins / Levine R.L. [et al.] // Methods Enzymol. -1990. - Vol. 186. - P. 464 - 478.
9. Окислительные модификации белков сыворотки крови человека, метод ее определения / Е.Е. Дубинина [и др.] // Вопр. мед. химии. - 1995. -Т. 41.- № 1. - С. 24 - 26.
10. Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма: методические рекомендации. СПб.: Фолиант, 2000.104 с.
11. Nishinimi M. The occurrence of superoxide anion in reactions of redused phenaxi-nemetasulfate and molecular oxygen / M. Nishinimi, A. Roo, K. Xagi // Biochem. Biophys. res. commun. - 1972. - V. 146. -№ 2. - P. 849 - 854.
12. Aebi Y. Methoden der enzymatischen analyses / Y. Aebi // Verlag Chemie. - Academic Press Inc.
- 1970. -V. 2. - P. 636 - 647.
13. Метод определения активности каталазы / М.А. Карасюк [и др.] // Лабораторное дело. - 1988.
- № 1.- С. 16 - 18.
14. Определение антиоксидантных параметров крови и их диагностическое значение в пожилом возрасте / С.И. Чевари [и др.] // Лабораторное дело. - 1991. -№ 10. - С. 9 - 13.
15. Маркевич В.Э. и др. Методы клиновидной дегидратации биологических жидкостей / Морфология. - 2014. - Т.8. - №1. - С.113 - 117.
16. Безруких М.М., Сонькин В.Д., Фарбер Д.А. Возрастная физиология: (физиология развития ребенка): учебн. пособие. - М.: Издательский центр «Академия», 2008. - 416 с.
17. Мак-Ильвейн Г. Биохимия и ЦНС. М.: Медицина, 1962. - 413с.
18. Карпухина М.Б. и др. Морфология плазмы крови и биохимические показатели при дисцирку-ляторной энцефалопатии / Медицинский альманах.
- 2011. - №5. - С. 252 - 254.
19. Западнюк, И. П. Западнюк В.П., Захария Е. А. Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте. Киев: Наукова думка, 1974. - С.23 - 24.
20. Шульговский В.В. Физиология высшей нервной деятельности с основами нейробиологии: учебник для студ. биол. спец. вузов. - М.: Академия, 2003. - 464 с.
