Особенности строения гонад половозрелых животных в условиях метотрексат-индуцированной иммуносупрессии Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2018 - V. 25, № 3 - P. 160-165

УДК: 611.6+59.084:615.37

ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ ГОНАД ПОЛОВОЗРЕЛЫХ ЖИВОТНЫХ В УСЛОВИЯХ МЕТОТРЕКСАТ-ИНДУЦИРОВАННОЙ ИММУНОСУПРЕССИИ

С .А. КАЩЕНКО, А.А. ЗАХАРОВ

Государственное Учреждение Луганской Народной Республики «Луганский государственный медицинский университет имени Святителя Луки», кв. 50-летия Обороны Луганска, д. 1г, г. Луганск, 91045, Украина,

e-mail: masterhist@mail.ru

Аннотация. Исследования последних лет доказали, что наиболее быстро и активно в ответ на изменения внешней и внутренней среды реагируют регуляторные системы организма - нервная, иммунная и эндокринная. Отмечено, что очень часто интенсивное воздействие факторов различной природы приводит к состоянию системной иммуносупрессии разной степени выраженности. Без сомнений, влияние неблагоприятных факторов сказывается и на структуре и функционировании всех систем организма. Однако, зачастую вопросы, связанные с изменениями строения органов, которые, казалось бы, напрямую не связаны с реакцией на иммуносупрессию, остаются без должного внимания исследователей. В связи с этим, целью работы явилось изучение влияния острого угнетения иммунной системы на морфоструктуру семенников животных репродуктивного периода. Исследование выполнено на 60 белых крысах репродуктивного периода. Иммуносупрессию моделировали путем применения метотрексата в дозировке 10 мг/м2 однократно внутримышечно. Органы взвешивали, рассчитывали относительную массу, определяли линейные размеры и объём. Микроморфометриче-ские измерения включали больший и меньший диаметры, площадь извитого семенного канальца, высота и площадь эпителиосперматогенного слоя, индекс сперматогенеза, а также число сустенто-цитов и интерстициальных эндокриноцитов и объёмы ядер указанных клеток. Статистически значимое уменьшение всех массовых и линейно-объёмных параметров было установлено на 7, 15 и 30 сутки наблюдения. Микроморфометрические показатели, а также количественные клеточные показатели претерпевали аналогичные изменения в те же сроки. В результате исследования было установлено, что семенники животных репродуктивного возраста проявляют активную реакцию в ответ на применение иммуносупрессивной дозы метотрексата. Статистически значимое снижение мор-фометрических параметров гонад объясняется фармакокинетическими особенностями препарата и развитием нарушений со стороны транскрипционного аппарата клеток. Реакция со стороны микро-морфометрических параметров органа подтверждает изменения на макроскопическом уровне и включает в себя, в том числе, и сдвиги в локальных андрогензависимых механизмах регуляции структуры эпителиосперматогенного слоя. Отсутствие статистически достоверных отличий между исследуемыми показателями семенников животных контрольных и экспериментальных групп на 60 сутки после прекращения введения препаратов свидетельствует о развитии реадаптационных процессов в органе.

Ключевые слова: семенники, метотрексат, иммуносупрессия, крысы.

Актуальность. Как известно, в последние десятилетия происходит интенсивное изменение окружающей среды за счет резкого расширения промышленного производства, в том числе атомного и химического, роста количества отходов, загрязняющих окружающую среду. Все это непосредственно влияет на здоровье населения, наносит огромный ущерб экономике, резко уменьшает трудовые ресурсы, а также потенциально создает канцерогенную и мутагенную опасность не только для здоровья настоящих, но и будущих поколений. Здоровый организм постоянно обеспечивает оптималь-

ное функционирование всех своих систем в ответ на любые изменения окружающей среды. Сохранение оптимальной жизнедеятельности человека при взаимодействии с окружающей средой определяется тем, что для его организма существует определенный физиологический предел выносливости по любому фактору среды и за рубежом пределов этот фактор неизбежно будет оказывать угнетающее влияние на здоровье человека. Неизбежное воздействие на организм оказывает и постоянно расширяющийся спектр применяемых медицинских препаратов для лечения и профилактики разнооб-

JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2018 - V. 25, № 3 - P. 160-165

разных патологических состояний. Исследования последних лет доказали, что наиболее быстро и активно в ответ на изменения внешней и внутренней среды реагируют регуляторные системы организма - нервная, иммунная и эндокринная [5]. Отмечено, что очень часто интенсивное воздействие факторов различной природы приводит к состоянию системной иммуносупрессии разной степени выраженности [4]. Без сомнений, влияние неблагоприятных факторов сказывается и на структуре и функционировании всех систем организма. Однако, зачастую вопросы, связанные с изменениями строения органов, которые, казалось бы, напрямую не связаны с реакцией на имму-носупрессию, остаются без должного внимания исследователей.

Цель исследования - изучение влияния острого угнетения иммунной системы на мор-фоструктуру семенников животных репродуктивного периода.

Материалы и методы исследования. Исследование выполнено на 60 белых крысах репродуктивного периода, полученных из вивария лабораторных животных ГУ ЛНР «Луганский государственный медицинский университет им. Святителя Луки». Иммуносупрессию моделировали путем применения метотрексата в дозировке 10 мг/м2 однократно внутримышечно. Животные, получавшие аналогичные объемы 0,9% раствора NaCl по той же схеме, входили в контрольную группу. Крыс выводили из эксперимента под эфирным наркозом через 1, 7, 15, 30 и 60 суток после прекращения введения препарата. При работе с животными руководствовались Директивой 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета Европейского Союза по охране животных, используемых в научных целях [2]. Органы взвешивали на торсионных весах, рассчитывали относительную массу, определяли линейные размеры с помощью штангенциркуля: длину, ширину и толщину. По формуле объёма эллипсоида рассчитывали объём органа: V = где А - длина, В - ширина и С - толщина.

Семенники подвергались стандартной гистологической проводке, полученные срезы толщиной 4-5 мкм окрашивались гематоксилин-эозином и фотографировались с помощью морфометрического комплекса «Olympus CX-41». Микроморфометрические измерения объектов проводили путём анализа полученных цифровых изображений в компьютерной про-

грамме АСКОН «Компас-3.0 17.0», используя калибровочный файл, созданный с помощью фотографий объект-микрометра в аналогичных режимах съёмки. В исследовании использовались только те канальцы, по которым срез прошел перпендикулярно его центральной оси. Измерялись больший и меньший диаметры, площадь канальца, высота и площадь эпители-осперматогенного слоя. Индекс сперматогенеза (I) рассчитывали по формуле: I = —, где А -

а

количество рядов сперматогенных клеток, обнаруженных в каждом канальце (1 ряд - спер-матогонии, 2 - сперматоциты, 3 - сперматиды, 4 - сперматозоиды); n - количество изученных канальцев [1].

Число сустентоцитов подсчитывалось в 100 срезах извитых семенных канальцев. Устанавливали относительное количество интерстици-альных эндокриноцитов, приходящихся на поперечный срез одного канальца. Также определялись объёмы ядер указанных клеток по формуле вытянутого эллипсоида вращения [3, 6].

Полученные данные обрабатывали с использованием лицензионной программы «StatSoft Statistica v6.0». Применялись методы параметрической статистики, так как использование критерия Шапиро-Уилка позволило установить нормальное распределение показателей в выборке. Достоверность различий между показателями экспериментальных и контрольных групп определяли с помощью критерия Стьюдента-Фишера с вероятностью ошибки р<0,05, допустимой для медико-биологических исследований.

Результаты и их обсуждение. Семенники являются парными органами, что обусловливает необходимость изучения каждого из них. Однако, полученные данные свидетельствуют, что в контрольных и экспериментальных группах достоверных различий между аналогичными параметрами правой и левой гонады установлено не было, поэтому в дальнейшем будут приведены результаты исследования правого органа.

Семенники крысы располагаются в мошонке, непосредственно соединяющейся с брюшной полостью, имеют овальную форму, в каждом различают краниальный и каудальный полюса, медиальную и латеральную поверхности, вентральный и дорсальный края. Снаружи орган покрыт соединительнотканной оболочкой, разделяющей его на дольки, содержащие извитые семенные канальцы, которые расположены в

разных плоскостях. Эпителиосперматогенный слой плотно прилегает к стенке канальца и представлен сустентоцитами, а также рядами предшественников сперматозоидов, находящихся на разных стадиях сперматогенеза. Орга-нометрические показатели семенников крыс контрольных групп подвергались незначительным возрастным изменениям в связи с закономерными процессами их морфогенеза (табл.).

Таблица

Органометрические показатели органов животных контрольных групп репродуктивного периода (M±m, n=30)

Параметры Сроки наблюдения, сутки

1 7 15 30 60

Абсолютная масса, мг 1760,21±62,35 1770,12±33,54 1840,11±34,55 1855,18±41,21 1892,14±45,78

Относительная масса, мг/г 8,35±0,33 8,50±0,11 7,81±0,12 7,89±0,08 8,17±0,27

Длина, мм 29,88±0,87 29,25±0,52 30,35±0,64 30,83±0,71 31,44±0,52

Ширина, мм 11,76±0,46 12,73±0,25 12,86±0,31 14,52±0,22 15,11±0,32

Толщина, мм 12,52±0,24 12,77±0,31 13,51±0,22 14,79±0,18 15,64±0,37

Объём, мм3 2303,45±95,64 2489,61±48,52 2760,84±66,88 3466,52±46,53 3890,18±112,33

Рис. Изменения длины (А), ширины (Б), толщины (В) и объёма (Г) семенников после применения метотрексата и в контроле. Примечание: и * - статистически значимое отличие от контрольных данных ^<0,05)

После введения метотрексата общий план строения гонад не претерпел существенных изменений, однако были отмечены отклонения макроморфометрических показателей органов. Так, статистически значимое уменьшение абсо-

лютной массы на 13,07, 10,78 и 7,91% было установлено на 7, 15 и 30 сутки наблюдения. Значения относительной массы изменялись аналогично: уменьшение параметров составило 12,46, 7,86 и 4,59% соответственно. Линейные и объёмные параметры органов после применения иммуносупрессора претерпевали сходные изменения. Так, достоверные отклонения были установлены на 7, 15 и 30 сутки (рис.).

После окончания введения метотрексата изменения микроморфометриче-ских параметров гонад наблюдались в аналогичные сроки наблюдения, имея тенденцию к снижению в сравнении с данными контрольных групп крыс.

При иммуносупрессии линейные показатели извитых семенных канальцев достоверно уменьшались относительно контрольных данных. Так, больший и меньший диаметры снижались на 11,58%, 18,31%, 15,35% и 10,57%, 17,16%, 17,19% соответственно 7, 15 и 30 суткам наблюдения. Синхронно уменьшались площади канальца и эпите-лиосперматогенного слоя -на 9,14%, 12,60%, 11,08% и 11,65%, 13,23%, 16,13% соответственно. Высота последнего, а также индекс сперматогенеза статистически значимо снижались в сравнении с данными контрольных групп животных. Так, на 7, 15 и 30 сутки после прекращения введения иммуносупрессора эти параметры уменьшались на 15,40%, 12,19%, 14,31% и 18,70%, 28,12%, 29,88% соответственно. На 60 день наблюдения, как и на ранних сроках, все исследуемые параметры органа достоверно не отличались от контрольных данных.

Количество сустентоцитов в извитых семенных канальцах гонад крыс контрольной

JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2018 - V. 25, № 3 - P. 160-165

группы статистически значимо превышало аналогичный показатель у животных после иммуносупрессии на 23,28% (7 сут.), 21,16% (15 сут.) и 18,41% (30 сут.). Также было установлено достоверное снижение объёма ядер клеток в те же сроки наблюдения на 15,29%, 20,06% и 19,85% соответственно.

Сходная динамика параметров интерсти-циальных эндокриноцитов отмечалась через 7, 15 и 30 суток после прекращения применения метотрексата: так, количество клеток снижалось на 18,53%, 19,94% и 15,75%, объём ядер клеток - на 15,79%, 19,58% и 13,82% соответственно.

Развитие изменений морфометрических параметров семенников свидетельствует об интенсивном ответе со стороны органов на иммуносупрессию. Полученные данные могут быть объяснены непосредственным действием метотрексата на ферментный комплекс, участвующий в синтезе компонентов ДНК, что приводит к нарушениям транскрипционных и трансляционных процессов в клетке [8]. Этот же механизм угнетает регенераторную способность эпителиосперматогенного слоя, что выражается снижением индекса сперматогенеза у животных, получавших иммуносупрессор. Meyer S.C., Levine R.L. (2014) в исследованиях доказали способность метотрексата угнетать активность ряда ферментов, участвующих в передаче сигнала от цитокинового комплекса к ядерным генам-мишеням. Это приводит к нарушению их экспрессии, что проявляется снижением митотической активности и синтетических процессов в клетках эпителиосперматогенного слоя [7]. С другой стороны, Spurlock C.F. III et al. доказали, что метотрексат обладает способностью активировать фермент семейства мито-

ген-активированных протеинкиназ, что, в свою очередь, приводит к активации генов проапоп-тоза и увеличивает чувствительность клеток к апоптозу [8]. Данный факт может объяснить снижение количественных показателей извитых семенных канальцев, а также уменьшение числа и ядерных показателей поддерживающих клеток и гландулоцитов. Последний факт также играет роль в изменении морфометрических параметров гонад в связи со снижением андро-гензависимой стимуляции сперматогенеза, в котором существенную регуляторную роль играют сустентоциты, создающие специфическое микроокружение для созревающих клеток.

Выводы:

1. Семенники животных репродуктивного возраста проявляют активную реакцию в ответ на применение иммуносупрессивной дозы ме-тотрексата.

2. Статистически значимое снижение мор-фометрических параметров гонад отмечается на 7, 15 и 30 сутки наблюдения, что объясняется фармакокинетическими особенностями препарата и развитием нарушений со стороны транскрипционного аппарата клеток.

3. Реакция со стороны микроморфометри-ческих параметров органа подтверждает изменения на макроскопическом уровне и включает в себя, в том числе, и сдвиги в локальных анд-рогензависимых механизмах регуляции структуры эпителиосперматогенного слоя.

4. Отсутствие статистически достоверных отличий между исследуемыми показателями семенников животных контрольных и экспериментальных групп на 60 сутки после прекращения введения препаратов свидетельствует о развитии реадаптационных процессов в органе.

FEATURES OF THE GONAD STRUCTURE OF MATURE ANIMALS UNDER THE CONDITIONS OF METHOTREXATE-INDUCED IMMUNOSUPRESSION

S.A. KASHCHENKO, A.A. ZAKHAROV

SI LPR « St. Luke Lugansk State Medical University», 91045, Lugansk, 50th anniversary of the Defense of Lugansk

bl., 1g. E-mail: masterhist@mail.ru

Abstract. Studies of recent years have shown that the most rapid and active in response to changes in the external and internal environment are the regulatory systems of the body - nervous, immune and endocrine. It is noted that very often-intensive exposure to factors of different nature leads to a state of systemic immunosuppression of varying degrees of severity. Without a doubt, the influence of unfavorable factors affects the structure and functioning of all body systems. However, often the issues related to changes in the structure of organs that seemingly are not directly related to the response to immunosuppression remain without due attention of researchers. In this regard, the aim of the work was to study the effect of acute in-

hibition of the immune system on the morphology of the testes of animals of the reproductive period. The study was carried out on 60 white rats of the reproductive period. Immunosuppression was modeled by the use of methotrexate in a dosage of 10 mg/m2 once intramuscularly. The organs were weighed, the relative mass was calculated, linear dimensions and volume were determined. Micromorphometric measurements included larger and smaller diameters, seminiferous tubule area, height and area of the epitheliospermato-genous layer, spermatogenesis index, as well as the number of sustenocytes and interstitial endocrinocytes and the nuclei volumes of these cells. A statistically significant decrease in all mass and linear-volumetric parameters was established on the 7th, 15 th and 30th day of observation. Micromorphometric indices, as well as quantitative cellular indices, underwent similar changes in the same terms. As a result of the study it was found out that testes of animals of reproductive age show an active reaction in response to the use of an immunosuppressive dose of methotrexate. The pharmacokinetic features of the preparation and the development of disorders from the transcriptional apparatus of the cells explain a statistically significant decrease in the morphometric parameters of the gonads. The reaction from the micromorphometric parameters of the organ confirms the changes at the macroscopic level and includes, among other things, shifts in the local androgen-dependent mechanisms of the regulation of the structure of the epitheliospermatogen-ous layer. The absence of statistically significant differences between the test parameters of the testes of control and experimental animals in the 60 days after the discontinuation of the administration of the preparations indicates the development of the re-adaptation processes in the organ.

Key words: testes, methotrexate, immunosuppression, rats.

Литература

References

1. Бессалова Е.Ю. Биометрические показатели семенников крыс при парентеральном введении спинномозговой жидкости // Вкник проблем бю-логл та медицини. 2011. №4 (90). С. 195-197.

1. Bessalova EYU. Biometricheskie pokazateli se-mennikov krys pri parenteral'nom vvedenii spinno-mozgovoj zhidkosti [Biometric parameters of rat testes with parenteral administration of cerebrospinal fluid]. Visnik problem biologiï ta medicini. 2011;4(90):195-7. Ukraine.

2. Директива Европейского Парламента и Совета Европейского Союза по охране животных, используемых в научных целях от 2010 г. № 2010/63/БИ // НП «Объединение специалистов по работе с лабораторными животными». Санкт-Петербург, 2012. 48 с.

2. Direktiva Evropejskogo Parlamenta i Soveta Evropejskogo Soyuza po ohrane zhivotnyh, ispol'zuemyh v nauchnyh celyah ot 2010 g. № 2010/63/EU. NP «Ob"edinenie specialistov po rabote s laboratornymi zhivotnymi» [Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of the European Union on the protection of animals used for scientific purposes of 2010. NP " Association of specialists in work with laboratory animals»]. Sankt-Peterburg; 2012. Russian.

3. Дуденкова Н.А., Шубина О.С. Изменения мор-фофункционального состояния и продуктивности семенных желез белых крыс при воздействии ацетата свинца // Фундаментальные исследования. 2013. №10 (часть 6). С. 1253-1259.

3. Dudenkova NA, SHubina OS. Izmeneniya morfo-funkcional'nogo sostoyaniya i produktivnosti semen-nyh zhelez belyh krys pri vozdejstvii acetata svinca [Changes in the morphofunctional state and productivity of the seminal glands of white rats under the influence of lead acetate]. Fundamental'nye issledovaniya. 2013;10(chast' 6):1253-9. Russian.

4. Кащенко С.А., Бобрышева И.В. Особенности гистологического строения белой пульпы селезенки крыс в разные периоды постнатального онтогенеза в условиях экспериментальной имму-носупрессии // Журнал Гродненского государственного медицинского университета. 2014. №1. С. 51-54.

4. Kashchenko SA, Bobrysheva IV. Osobennosti gistologicheskogo stroeniya beloj pul'py selezenki krys v raznye periody postnatal'nogo ontogeneza v usloviyah ehksperimental'noj immunosupressii [Features of the histological structure of the white pulp of the rat spleen in different periods of postnatal ontogenesis in experimental immunosuppression]. ZHurnal Grodnenskogo gosudarstvennogo

medicinskogo universiteta. 2014;1:51-4. Russian.

JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2018 - V. 25, № 3 - P. 160-165

5. Кащенко С.А., Ерохина В.В. Ультрамикроскопические изменения паращитовидных желез крыс после коррекции циклофосфан-индуцированной иммуносупрессии имунофаном // Украшський морфолопчний альманах. 2014. Т. 12, №1. С. 6164.

5. Kashchenko SA, Erohina VV. Ul'tramikroskopi-cheskie izmeneniya parashchitovidnyh zhelez krys posle korrekcii ciklofosfan-inducirovannoj immunosupressii imunofanom [Ultramicroscopic changes in the parathyroid glands of rats after correction of cyclophosphane-induced

immunosuppression by imunophan]. Ukraïns'kij morfologichnij al'manah. 2014;12(1):61-4. Ukraine.

6. Кривецький В.В., Москаленко Р.А., Карпенко Л.I., Закорко 1-М. С. Особливосп морфофункщ-онального досл1дження ендокринного компоненту сш'яниюв в умовах експерименту // Журнал клiнiчних та експериментальних медичних дослЬ джень. 2013. Т. 1, №2. С. 149-153.

6. Krivec'kij VV, Moskalenko RA, Karpenko LI, Zakorko I-MS. Osoblivosti morfofunkcional'no-go doslidzhennya endokrinnogo komponentu sim'yanikiv v umovah eksperimentu [Features of morphofunctional study of the endocrine component of the testes under experimental conditions]. ZHurnal klinichnih ta eksperimental'nih medichnih doslidzhen'. 2013;1(2):149-53. Ukraine.

7. Meyer S.C., Levine R.L. Molecular pathways: molecular basis for sensitivity and resistence to JAK kinase inhibitors // Clin Cancer Res. 2014. №20. P. 2051-2059. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-13-0279.

7. Meyer SC, Levine RL. Molecular pathways: molecular basis for sensitivity and resistence to JAK kinase inhibitors. Clin Cancer Res. 2014;20:2051-9. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-13-0279.

8. Spurlock C.F. III, Tossberg J.T., Fucgs H.A. Methotrexate increases expression of cell cyclic checkpoint genes via JNK activation // Arthritis Rheum. 2012. №64. P. 1780-1789. D01:1002/art.34342

8. Spurlock CF III, Tossberg JT, Fucgs HA. Metho-trexate increases expression of cell cyclic checkpoint genes via JNK activation. Arthritis Rheum. 2012;64:1780-9. D0I:1002/art.34342