CC BY
34
ОСОБЕННОСТИ СТАНОВЛЕНИЯ ГЕНЕРАТИВНОЙ ФУНКЦИИ ЯИЧНИКОВ У СВИНЕЙ
О.Б. Сеин, Д.О. Сеин
Приводятся результаты исследований становления генеративной функции яичников у ремонтных свинок крупной белой породы. Получали яйцеклетки из яйцеводов через 48 часов после начала половой охоты с использованием специального устройства. Было установлено, что становление генеративной функции у свинок завершается к третьей овуляции, когда увеличивается количество полноценных яйцеклеток, продуцируемых яичниками.
Ключевые слова: генеративная функция, матка, половая функция, свиньи, становление, устройство, яичники, яйцеклетка, яйцеводы.
Для яичников - половых желез самок, свойственна эндокринная и генеративная функция. Результатом первой является выработка половых трмонов, а второй - «продукция» яйцеклеток.
Генеративная функция яичников у самок домашних животных представляет большой практический интерес, так как от неё во многом зависят количество и качество получаемого приплода. Установлено, что на генеративную функцию яичников большое влияние оказывают условия содержания, кормления, возраст животных и другие факторы (А.В. Квасницкий и др. 1949; IO.A. Магакян, 1957; И.Г. Питкянен, 1961; А.М. Жмурин и др., 1964; R.H. Hunter, 1985; S. Xie et al., 1987). Однако в литературе практически не встречается сведений о становлении генеративной функции яичников у свиней, о качественных и морфологических особенностях яйцеклеток, образующихся в этот период онтогенеза.
Учитывая вышеизложенное, нами были проведены эксперименты по изучению формирования генеративной функции у свиней. Объектом исследований являлись ремонтные свинки крупной белой породы, наблюдение за которыми осуществляли с периода полового созревания и до насту пления у них ритмичной половой цикличности.
Яйцеклетки у свинок получали из яйцеводов через 48 часов после начала половой охоты. Для этого животных убивали или проводили лапаротомию с последующей ампутацией яйцеводов, которые затем разрезали на равные
три сегмента и вымывали из них яйцеклетки средой Дюльбекко при помощи шприца.
С целью многократного получения яйцеклеток от одних и тех же животных использовали специальное устройство, разработанное нами (Сеин О.Б., Бабанин Н.А., патент на изобретение № 1802701), состоящее из улавливающей головки и двух канального катетера (рисунок 1).
Улавливающая головка данного устройства имеет фиксирующее кольцо с отверстиями и патрубок с подсоединенным к нему двухканальным катетером, состоящим из полихлорви-ниловой трубки и находящейся внутри нее второй трубки меньшего диаметра, которая одним концом проходит через патрубок вовнутрь улавливающей головки. Сверху на катетере закреплены ограничительное кольцо, фетровый шлейф и наружный фланец, фиксирующийся на катетере с помощью крепежных болтов и двух полуовальных пластинок, вставляющихся в отверстие на фланце. Свободные концы обеих трубок катетера для предотвращения их от загрязнения закрываются пробками.
Для использования устройства с целью извлечения яйцеклеток у свиней, после предварительной голодной диеты и интраперитонеаль-ного тиопенгал-натриевого наркоза, в области голодной ямки проводили лапаротомию с соблюдением всех правил хирургического вмешательства. После рассечения всех слоев брюшной стенки и брюшины отыскивали рог
Сведения об авторах
Сеин Олег Борисович, доктор биологических наук, профессор, декан факультета ветеринарной медицины, заведующий кафедрой «Терапия и акушерство» Курской государственной сельскохозяйственной академии имени профессора И.И. Иванова, тел. (4712) 53-14-04.
Сеин Дмитрий Олегович, кандидат биологических наук, ассистент кафедры «Терапия и акушерство» Курской государственной сельскохозяйственной академии имени профессора И.И. Иванова, тел. (4712)33-57-69.
2 Л
б
Рисунок 1 - Устройство для извлечения яйцеклеток из матки у свиней: а - общий вид устройства; б - схема устройства (1 - улавливающая головка; 2 - фиксирующее кольцо; 3 - патрубок; 4 - двухканальный катетер; 5 - грубка для введения промывной жидкости; 6 - трубка для выведения промывной жидкости; 7 - ограничительное кольцо; 8 - фетровый шлейф; 9 - наружный фланец; 10 - крепежный болт; 11 - полуовальная пластинка; 12,13 - пробки.
матки и извлекали его наружу. Отступая 3-4 см от маточно-трубного сочленения со стороны большой кривизны рогов, делали поперечный разрез до противоположной стенки рога. Затем накладывали двухэтажный шов на разрез в каудальной части рога магки, а в отверстие краниальной части рога вставляли улавливающую головку, которую фиксировали там путем прошивания свободного края рога матки через отверстия в кольцо головки.
После зашивания брюшины отступали несколько сантиметров от края разреза и делали в брюшной стенке остроконечным скальпелем контрапертуру, через которую с помощью зажима извлекали свободный конец катетера, при этом ограничительное кольцо и фетровый шлейф располагались под брюшной стенкой. Затем зашивали непрерывным швом апоневрозы брюшной стенки.
С внешней стороны брюшной стенки на катетере фиксировали наружный фланец (рисунок 2) с помощью болтов, которые при закручивании через посредство полуовальных пластинок сдавливают катетер, оставляя при этом свободным просвет канала. Ограничительное кольцо и фетровый шлейф, который со временем прорастает фибрином, а также наружный фланец не позволяют свободно перемещаться катетеру в брюшной полости, что предотвращает отрыв устройства от рога матки.
После окончания операции и последующие трое суток один раз в сутки через устройство пропускали раствор фурацилина (1:5000). Затем промывание устройства проводили ежесуточно стерильным физиологическим раствором или жидкостью Дюльбекко независимо от физиологического состояния яичников. Для промывания устройства и вымывания яйцеклеток использовали шприц, который подсоединяли к тонкой трубке катетера. Собирали промывную среду в приемный сосуд через трубку с большим диаметром.
До использования устройство хранили в 70°-ном спирте, а непосредственно перед операцией его тщательно промывали стерильным физиологическим раствором.
Наблюдения показали, что устройство не вызывает болезненного раздражения, побочных явлений и послеоперационных осложнений у подопытных животных.
Полученную промывную жидкость подвергали исследованию с целью обнаружения яйцеклеток. Для этого использовали специально сконструированное нами устройство (Сеин О.Б., Сеин Д.О., Григоренко В.В., свидетельство на полезную модель №18909). Данное устройство (рисунок 3) состоит из тонкого капилляра, расположенного между покровными стёклами, которые скреплены между собой канадским бальзамом. С целью предохранения по-
Рисунок 2 - Устройство зафиксированное в брюшной стенке ремонтной свинки (а), и процесс извлечения яйцеклеток из матки (б)
Рисунок 3 - Устройство для обнаружения яйцеклеток: а - общий вид; б - схема устройства (1 -стеклянный капилляр; 2 - покровные стекла; 3 - футляр; 4 - овальное отверстие; 5 - капилляр, соединяющийся с сосудом-отстойником; 6 - сосуд-отстойник; 7 - шприц; 8 - свободный конец капилляра; 9 - сосуд-приемник)
кровных стёкол и капилляра от механических повреждений их помещают в футляр, состоящий из двух предохранительных пластин из оргстекла и которые имеют форму предметного столика для микроскопа. В центре верхней предохранительной пластины находится овальное отверстие, напротив которого располагается капилляр, закрепленный между покровными стёклами. К одному из свободных концов капилляра подсоединяется тефлоновая трубка, соединяющаяся с коническим сосудом-отстойником, который, в свою очередь, соединён со шприцем. С помощью шприца в системе создаётся давление, позволяющее выталкивать жидкость из сосуда-отстойника и продвигать её по капилляру. Через второй конец стеклянного капилляра удаляется промывная жидкость с яйцеклетками, которые «улавливают» в сосуд-приёмник с целью дальнейшего их исследования.
Для применения устройства его закрепляют на предметном столике микроскопа, а затем в конический сосуд-отстойник вносят промывную жидкость с яйцеклетками. Шприцем создают давление в сосуде-отстойнике, в результате чего промывная жидкость поступает из сосуда в капилляр и продвигается по нему. Во время попадания яйцеклетки в поле зрения микроскопа её осматривают и оценивают, а затем через свободный конец капилляра яйцеклетку улавливают в сосуд-приёмник.
Все извлечённые яйцеклетки подвергались исследованию. Для этого определяли как «прижизненное» их состояние, так и после фиксации. В первом случае использовали малое увеличение микроскопа, во втором-приготавливали гистопрепараты. В связи с микроскопическими размерами яйцеклеток перед изготовлением гистопрепаратов их «вылавливали» пастеровской пипеткой и помещали в небольшие участки яйцепроводов (1 см) или в «мешочки» из фимбрии, которые затем фиксировали в 10% формалине или в жидкостях Буэна, Корнуа и Цинкера. После обезвоживания в спиртах возрастающей концентрации и ксилоле материал заливали в парафин. Из парафиновых блоков делали гистосрезы толщиной 6-8 мкм. Окрашивали гистосрезы гематоксилином по Гейденгайну и гематоксилин-эозином. С использованием винтового окулярмикрометра определяли линейные параметры яйцеклеток, на основании которых расчётным способом вычисляли объём. Выявленные наиболее характерные морфологические изменения яйцеклеток фотографировали и зарисовывали.
Результаты исследований показали, что яйцеклетки в яйцеводах свинок после овуляции распределялись неравномерно (рисунок 4). Так, после 1 и 2 овуляции они преимущественно находились в первом сегменте яйцевода.
Значительно меньше яйцеклеток было во втором сегменте и только единичные экземпляры встречались в третьем сегменте яйцевода. По завершении 3 овуляции яйцеклетки распределялись в пером и втором сегментах почти равномерно, а после 4 и 5 овуляций большая часть яйцеклеток находилась во втором сегменте яйцевода.
Что касается морфологических особенностей яйцеклеток, то большинство из них имели округлую или слегка овальную форму с хорошо выраженной прозрачной оболочкой и овоплаз-мой, плотно заполненной желточными зернами.
Неоплодотворенные яйцеклетки, извлеченные из разных участков яйцевода, внешне не имели характерных различий, за исключением яйцеклеток из верхней трети яйцевода, среди которых встречались экземпляры, окруженные остатками фолликулярных клеток (рисунок 5). В то же время нередко обнаруживались яйцеклетки с различными отклонениями от нормы, которые проявлялись в виде изменения формы, неравномерной толщины прозрачной оболочки и ее деформации, малого содержания желточных зерен, наличия дегенеративных изменений.
Некоторые яйцеклетки имели овальную, бобовидную или неправильную форму. Так как такие яйцеклетки встречались достаточно часто, то можно предположить, что эти морфологические изменения не относятся к патологическим случаям. По-нашему мнению, это связано с разностью осмотического давления в яйцеклетках и жидкой среды, окружающей её в яйцеводе. Данное предположение подтверждается тем, что после непродолжительного нахождения яйцеклеток с изменённой формой в жидкости Дюльбекко они принимали правильную округлую форму.
Прозрачная оболочка яйцеклеток при обычном микроскопировании имеет нечёткие контуры, её толщина колеблется довольно в широких границах (7,2-24,0 мкм). Известно, что прозрачная оболочка играет большую роль в «жизнедеятельности» яйцеклетки. Она защищает яйцеклетку от механических повреждений. Благодаря её эластичности яйцеклетка способна противостоять перистальтическим движениям яйцевода.
Рисунок 4 - Распределение яйцеклеток (%) в яйцеводах свинок через 48 часов после
начала половой охоты
Рисунок 5 - Яйцеклетки, полученные у ремонтной свинки через 48 часов после начала половой охоты: а - яйцеклетка, окруженная остатками фолликулярного эпителия (верхняя треть яйцевода); б -полноценная яйцеклетка (средняя треть яйцевода); в - яйцеклетка с элементами деформации (средняя треть яйцевода); г - яйцеклетка с элементами дегенерации и лизиса (средняя треть яйцевода).
При оценке яйцеклетки важное значение имеет состояние перивителлярного пространства, так как соотношение между объёмом яйца и величиной перивителлярного пространства является косвенным показателем обмена веществ в яийцеклетке.
Наблюдения показали, что у яйцеклеток, извлечённых непосредственно из фолликулов яичников, перивителлярное пространство от-
сутствует и появляется только после перемещения яйцеклетки в яйцепровод. В среднем на долю перивителлярного пространства приходится 40-50% от общего объёма яйцеклетки. В то же время обнаруживались яйцеклетки с достаточно выраженными отклонениями от этого соотношения. Можно предположшъ, что такие яйцеклетки являются биологически неполноценными.
Таблица - Морфологические показатели яйцеклеток в возрастном аспекте
Овуля- ция Количество исследуемых яйцеклеток Диаметр яйцеклетки, мкм Толщина прозрачной оболочки, мкм Диаметр овоплазмы, мкм Объем яйцеклетки, млн мкм’ Количество дегенеративных яйцеклеток %
1 40 146,8*3,67* 12,6±0,88* 94,6*1,97* 1,78*0,14* 37,5
2 39 145,7*3,71* 11,0*0,70* 91,9*2,90* 1,70*0,14* 38,5
3 45 162,0±2,90 14,4*0,53 111,3*1,89 232*0,12 22,2
4 60 163,9*2,45 14,9±0,38 113,0*2,18 2,40*0,10 23,3
5 55 160,6±2,58 14,7*0,37 109,6*1,75 2,26*0,10 18,2
* - при Р<0,05, достоверность различий по сравнению с показателями, полученными в 5 овуляцию
При исследовании внутреннего содержимого яйцеклетки обнаруживаются скопления желточных зёрен, которые представляют собой тёмные округлые образования, равномерно располагающиеся по всей протоплазме. Размеры желточных зёрен колеблются довольно в широких пределах. Наблюдения показали, что при «старении» и дегенерации яйцеклеток желточные зёрна в протоплазме распределяются неравномерно. Как правило, они скапливаются в центре яйцеклетки, на периферии находятся -только единичные экземпляры. Также отмечено, что при «старении» яйцеклетки желточные зёрна могут агглютенировать и образовывать плотные скопления. При большом скоплении желточных зёрен яйцеклетки приобретают тёмную окраску, а когда их мало, то яйцеклетки имеют более светлую структуру.
В протоплазме яйцеклеток свиней встречаются также включения в виде округлых образований различного размера. Данные включения имеют липидную природу, так как после проводки в спиртах и ксилоле они экстрагировались и на их местах образовывались овальные пустоты.
Сравнительный анализ морфологических параметров яйцеклеток в возрастном аспекте показал, что в первые овуляции размеры яйцеклеток были меньше, по сравнению с последующими (таблица 1). Так, в 1 и 2 овуляции диаметр яйцеклеток соответственно составлял 146,8±3,67 и 145,7±3,71 мкм, толщина прозрачной оболочки - 12,6±0,88 и 11,0±0,70 мкм, диаметр овоплазмы - 94,6± 1,97 и 91,9±2,90 мкм, средний объём яйцеклетки - 1,78±0,14 и 1,70±0,14 мкм. В последующие 3-5 овуляции изучаемые параметры увеличились и колебались соответственно в пределах 160,6±2,58 -162,0±2,90 мкм; 14,4±0,53 - 14,9±0,38 мкм; 109,6± 1,75-113,0±2,18 мкм; 2,26±0,10 -
2,40±0,10 мкм. Нами также было установлено, что яйцеклетки с дегенеративными изменениями в первые овуляции у ремонтных свинок
встречались чаще (37,5-38,5%), чем в последующие овуляции (18,0-22,2%).
Таким образом, использование традиционных и оригинальных методов исследования генеративной функции яичников свидетельствует о том, что у ремонтных свинок крупной белой породы её становление завершается к третьей овуляции. В этот период количество полноценных яйцеклеток, продуцируемых яичниками, увеличивается. При этом большая часть яйцеклеток находится в средней трети яйцевода, что создаёт наиболее благоприятные условия для их «встречи» со спермиями и оплодотворения. Поэтому при включении ремонтных свинок в воспроизводительный процесс необходимо учитывать не только возраст и массу животных, но и количество овуляций, предшествующих первому осеменению.
Список использованных источников
1 Квасницкий, А.В. Вопросы возрастной физиологии размножения животных / А.В. Квасницкий // В кн. Возрастная физиология животных.-М.: Колос, 1967.-С. 354-412.
2 Магакян, Ю.А. Некоторые вопросы управления эмбриональным развитием свиней / ЮЛ. Магакян // Тр. Армянского НИИ животноводства и ветеринарии. - Ереван, 1957.-Т.2. Вып.б.-С.П 1-120.
3 Жмурин, А.М. Морфологические и гистологические изменения яйцеклеток свиней в процессе их развития / J1.M. Жмурин, В.А. Румянцева // Тр. ВНИИФиБ с.-х. животных. -1964.-Т. 1.-С. 199-207.
4 Питкянен, И.Г. Новое в оплодотворении и повышении плодовитости свиней / И.Г. Питкянен.- М.: Сельхозгиз, 1961. -277с.
5 Hunter, R.H.F. Massive spontaneous superovulation in a sexsually mature pig / R.H.F. Hunter // Eur. J. Obstet., Ginecol. and Reprod. Biol. -1985. -V.19. -№4. -P.261-266.
6 Xie S. Skewed distribution of ovulation in gilts / S. Xie, M.N. Wilde, K.P. Nephew // J. Anim. Sci. -1987. -V.65. -P. 367-368.
