CC BY
21
1999, Т. 1, № 3-4
Иммунорегуляция
использование этой процедуры на 2 сутки также достоверно уменьшало количество плазматических клеток. Контакт крови с агарозой 4Б на 3 и 4 сутки существенно повышал антителопродукцию и по сравнению с “холостой” гемоперфузией в те же сроки.
Таким образом, перфузия крови через гемоконтакт-ные препараты существенно влияет на процесс специфической антителопродукции в организме иммунизированных животных.
Индукция провоспалительных цитокинов in vitro иммунными комплексами, выделенными из плазмы больных ревматоидным артритом
Кузнецова С.А., Косицкая Л.С., Колосков A.B., Дорофейков В. В., Фрсйдлин И.С.
НИИ экспериментальной медицины РАМН Санкт-Петербург
Патогенетическая роль иммунных комплексов (ИК) в патогенезе ревматоидного артрита (РА) не вызывает сомнений. Исследованиями последних лет убедительно показана важная роль цитокинов, которые продуцируются активированными клетками и участвуют в процессах воспаления и деструкции тканей. Однако взаимосвязь продукции цитокинов с циркулирующими ИК до сих пор недостаточно изучена. Ранее нами было показано, что агрегированный человеческий сывороточный иммуноглобулин М, использованный в качестве модели ИК, значительно увеличивает продукцию ТНФ-а, ИЛ-1 ß, ИЛ-6, ИЛ-8 клетками периферической крови здоровых доноров. Целью настоящей работы было выделить и охарактеризовать ИК из плазмы больных РА и изучить их влияние на клетки крови здоровых доноров. ИК выделяли из плазмы больных РА (п=4), полученной путем плазмофереза (любезно предоставленной нам в ревматологическом центре Городской больницы № 25), с помощью водно-кислотного метода и растворяли в культуральной среде таким образом, чтобы концентрация ИК соответствовала исходной в плазме больного. Для характеристики полученных препаратов ИК использовали методы: осаждения полиэтиленпликолем, сорбции ге-терологичного комплемента, определения концентрации белка и концентрации иммуноглобулинов разных классов в составе ИК. Гепаринизированную цельную кровь (п=8) от здоровых доноров (любезно предоставленную нам в ге-матрансфузионном центре городской больницы № 26) разводили в 10 раз культуральной средой и инкубировали в течение 24 часов в присутствии ИК. Количество ТНФ-а и ИЛ-1 ß в надосадочной жидкости определяли методом им-муноферментного анализа. После инкубации с препаратами ИК от разных больных продукция ТНФ-а и ИЛ-1 ß дозозависимо возрастала. В случае инкубации с препаратами ИК в присутствии нейтрализующей антисыворотки к человеческому ИЛ-10 наблюдали дозозависимое увеличение уровней продукции ТНФ-а и ИЛ-1 ß. Таким образом,
мы показали, что ИК, циркулирующие в кровяном русле больных РА, индуцируют продукцию провоспалительных цитокинов, которая может быть ограничена эндогенным ИЛ-10, индуцированным теми же ИК. Эти результаты говорят о том, что ИК индуцируют секрецию клетками крови провоспалительных и противовоспалительных шггоки-нов, которые могут участвовать в патогенезе иммуноком-плексных заболеваний.
Работа поддержана фантом РФФИ № 97-04-48889.
Особенности Са2+-зависимой внутриклеточной сигнализации в Т-лимфоцитах памяти
Лнгвмнов И.С.1, Дедкова Е.Н.\ Хайдуков С.В.', Агафонова С.А.1,Зинченко В.П.2
'Институт биоорганическойХимии
им. М. М.Шемякина иЮ.А. Овчинникова РАН,
лаборатория иммунохимии,
'Институт биофизики клетка РАН
В процессе иммунного ответа в организме формируется пул клеток памяти, обеспечивающий ускоренный и больший по амплитуде ответ при повторном попадании того же самого антигена. Несмотря на значительное количество исследований, сведения о механизмах формирования и поддержания иммунологической памяти, а также свойствах клеток памяти весьма фрагментарны. Известной особенностью Т-клеток памяти является их резистентность к Са2*-ионофорам, что послужило основой для разработки метода их выделения. В данной работе был проведен сравнительный анализ Са2‘ -отпетов Т-клеток памяти и наивных Т-клеток мышей на Са2~-мобилизукнцие агенты: СопА, тапсигаргин и иономицин. Эти агенты не повышали [Са2*]( в изолированных Т-клетках памяти при концентрациях, действующих на наивные Т-клетки. Таким образом, вход Са2* в Т-клетки памяти не активируется истощением его внутриклеточных запасов. Определение размеров внутриклеточных запасов Са2\ мобилизуемых ионо-мицином и тапсигаргином в бескальциевой среде, выявило отсутствие в Т-клетках памяти пулов внутриклеточного Са2". С использованием БН-реагента — тимеросала показано значительное уменьшение системы входа Са2' через плазматическую мембрану в Т-клетки памяти. Обнаружена резистентность Т-клеток памяти к “Са2"-парадоксу”, т.е. отсутствие аномально большого входа Са2‘ в ответ на его добавление (2 мМ) после инкубации клеток в бескальциевой среде с 0.5 мМ ЕОТА. Это свойство Т-клеток памяти было использовано для разработки нового метода выделения Т-клеток памяти без использования ионофоров. Са2'-парадокс-резистентные Т-клетки нечувствительны к Са2'-ионофорам, СопА, тапсигаргину и тимеросалу. В использованных тестах нам не удалось обнаружит!, существенных различий между Са2т-парадокс-резистентнымиТ-клет-ками и иономицин-резистентными Т-клетками. Методом проточной цитометрии показано, что на поверхности Са2'-парадокс-резистентных Т-клеток и иономицин-резистент-
ных Т-клеток присутствуют маркеры, характерные для Т-клеток памяти. Са2"-парадокс-резистентные Т-клетки и иономицин-резистенгные Т-клетки обладали функциональными свойствами Т-клеток памяти, а именно: они способны к аптиген-специфическому пролиферативному ответу, оказывают помощь В-клеткам при синтезе антител и адаптивно переносят реципиентам резистентность к М. tuberculosis и к N. meningitidis.
Контроль выживания Т-лимфоцитов: роль аутокринных факторов
Луценко Г.В., Дьячкова Л.Г., Сапожников А.М.
Иист итут биоорганической химии
им. М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
Москва, Россия
Введение. Выживание и гибель нормальных клеток млекопитающих находятся под “социальным” контролем, суть которого заключается в том, что клетка, для своего выживания, должна постоянно получать сигналы от других клеток. Если она не получает таких сигналов, запускается механизм программируемой гибели, и клетка выбывает из клеточного сообщества.
Цель и задачи. Целью данной работы было исследование роли аутокринных факторов (АФ) в “социальном” контроле выживания Т-лимфоцитов. Задачами работы были: разработка простой экспериментальной системы, позволяющей тестировать влияние АФ на выживание Т-клеток, и непосредственное изучение на данной модели механизмов действия АФ.
Материалы и методы. Среда для культивирования клеток, приготовленная на основе RPMI-1640, содержала 2мМ L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина, 5x10'5 М 2-меркаптоэтанола, 5% эмбриональной сыворотки теленка и 100 Ед/мл интерлейкина-2. В качестве клеточной модели использовали IL-2-зависимую Т-клеточную линию CTLL-2. Выживание клеток оценивали с использованием МТТ-теста. Уровень апоптозных клеток определяли с использованием цитофлуориметра по наличию гиподиплоидного пика при окрашивании клеток пропидиум йодидом.
Основные результаты. Для исследования роли АФ в социальном контроле выживания Т-клеток нами была предложена экспериментальная модель с прекультивированием клеток в течение 12-14 часов в культуре высокой плотности (ВП, 2x106 клеток/см1), характеризуемой повышенной концентрацией АФ, и последующим их переносом в свежей среде в культуру низкой плотности (НП, 2x10s клеток/см1). После такого переноса 80-100% клеток CTLL-2 погибало в течение 3-5 часов. Среди клеток, взятых из ВП-культуры, доля апоптозных клеток составляла не более 10%, и она не увеличивалась после их переноса в НП-культуру, что указывает на то, что клеточная гибель осуществляется по механизму некроза. Внесение во вторичную культуру кондиционированного супернатанта (КС, надосадка культуры высокой плот-
ности, содержащего АФ) предотвращало гибель клеток. Некроз клеток после их переноса в НП-культуру указывает на нарушение энергетического метаболизма как на возможную причину их гибели. Ингибиторный анализ, проведенный с использованием цитохалазина В, ингибитора транспорта глюкозы, и ингибиторов окислительного фосфорилирования антимицина А и азида натрия показал, что главную роль в энергетическом метаболизме клеток CTLL-2, перенесенных из ВП-культуры в НП-культуру и спасенных от гибели добавлением КС, играет гликолиз как и в случае нормальных Т-лимфоцитов. Вместе с тем, оказалось, что в отсутствие КС пиру-ват, субстрат цикла Кребса, также обладает способностью спасать клетки от некроза, вызванного их переносом из ВП-культуры в НП-культуру. Внесение 1 мМ пирува-та во вторичную культуру сохраняло выживание клеток после переноса на уровне 75%-80%. Более того: если клетки CTLL-2 ранее культивировали в присутствии пи-рувата, то их прекультивирование в ВП-культуре и последующий перенос в НП-культуру, содержащую пиру-ват, никак не сказывались на их выживании, которое сохранялось на уровне не ниже 95%.
Заключение. Полученные результаты указывают на то, что аутокринные факторы способны контролировать выживание клеток CTLL-2, причем после прекультиви-рования клеток в условиях высокой концентрации АФ (ВП-культура) они адаптируются к этим условиям и при попадании в культуру с низким содержанием АФ (НП-культура со свежей средой) погибают по механизму некроза. Кроме того, представленные данные свидетельствуют в пользу того, что АФ осуществляют свое действие через контроль транспорта глюкозы и/или гликолиза, в то время как пируват, переключая энергетический метаболизм с гликолиза на окислительное фосфо-рилирование, выводит клетки из под контроля АФ.
Данная работа выполнена при поддержке РФФИ (фанг 99-04-49620).
Изучение антимикробных пептидов животных
Матукова А.Д., Алешина Г.М., Кокряков В.Н.
НИИ экспериментальной медицины РАМН Санкт-Петербург, Россия
Введение. Антимикробные пептиды животных являются ведущими компонентами системы врожденного иммунитета, который обеспечивает защиту от патогенных микроорганизмов сразу же после заражения и помогает поддерживать определенный состав естественной микрофлоры.
В настоящее время охарактеризовано около 100 полипепетидов и белков с антимикробными свойствами выделенных из различных видов позвоночных и беспозвоночных животных, среди которых имеются пептиды —как локализованные в лизосомах фагоцитарных клеток, так и присутствующие в виде гуморальных фак-
