CC BY
114
Особенности регенерации поврежденных периферических нервов при трансплантации мезенхимальных стволовых клеток в составе комбинированного графта
Петрова Д.Ю., Подгайский В.Н., Недзьведь М.К., Анищенко С.Л.,
Мечковский С.Ю., Зафранская М.М., Юркевич М.Ю.
Белорусская медицинская академия последипломного образования, Минск Белорусский государственный медицинский университет, Минск Юродское клиническое патологоанатомическое бюро, Минск
Petrova DYu., Padhaiskii V.N., Nedzvedz M.K., Anishchanka S.L., Miachkouski SYu., Zafranskaya M.M., Yurkevich MYu.
Belarusian Medical Academy of Postgraduate Education, Minsk Belarusian State Medical University, Minsk City Clinical Pathoanatomical Bureau, Minsk
Features of the regeneration of the damaged peripheral nerves at transplantation of mesenchymal stem cells as a part of the combined graft
Резюме. Комбинацию метода тубуляции с формированием в трубке специального тканевого матрикса с клеточным компонентом для роста регенерирующих нервных волокон рассматривают как наиболее эффективный метод преодоления диастаза нерва. Использование проводника между проксимальным и дистальным концами поврежденного нерва обеспечивает эффективную навигацию молодых прорастающих аксонов и оптимальные условия для аксонального конуса роста. Для успешной индукции тканегенеза в месте имплантации необходимо создать высокую начальную концентрацию клеток. Простое введение суспензии клеток зачастую оказывается малоэффективным. В настоящее время ведется поиск адекватных носителей, поддерживающих выживание, пролиферативную активность, способность к миграции и фенотипические характеристики трансплантируемых клеток. Одним из таких материалов является гиалуроновая кислота. Ключевые слова: повреждения периферических нервов, мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани, комбинированный графт, гиа-луроновая кислота
Summary. The combination of the tubulation method wtth the formation of a special tissue matrix wtth cellular components in the tube for the growth of the regenerating nerve fibers is considered as the most effective method of overcoming the diastase of the nerve. The use of the conduit between the proximal and distal ends of the damaged nerve provides efficient navigation of young sprouting axons and the optimal conditions for axonal growth cone. For a successful tissuegenesis induction at the site of implantation needs to create a high initial concentration of cells. The simple introduction of the cell suspension is often noneffective. At present is the search for adequate carriers supporting survival, proliferation activity the ability to migrate and phenotypic characteristics of the transplanted cells. Hyaluronic acid is one of such materials. Keywords: damages of peripheral nerves, mesenchymal stem cells from adipose tissue, combined graft, hyaluronic acid.
Для решения вопроса дефицита нервной ткани при восстановлении дефектов периферических нервов разрабатываются новые методы. Как альтернатива нервным аутотрансплантатам предлагаются разнообразные проводники нерва. Эта технология называется «тубуля-ция». Метод предполагает соединение концов нерва трубкой из биологических тканей или искусственных материалов [7, 12].
Исследования показали, что использование проводника между проксимальным и дистальным концами поврежденного нерва обеспечивает эффективную навигацию молодых прорастающих аксонов и оптимальные условия для аксо-нального конуса роста [8,10]. В качестве проводников для тубуляции используются различные биодеградируемые и небиоде-градируемые материалы.
Комбинацию метода тубуляции с формированием в трубке специального тканевого матрикса с клеточным компонентом для роста регенерирующих нервных волокон рассматривают как наиболее эффективный метод преодоления диастаза нерва [6,10]. Для успешной индукции тканегенеза в месте имплантации необходимо создать высокую начальную концентрацию клеток. Простое введение суспензии клеток зачастую оказывается малоэффективным. Ведется поиск адекватных носителей, поддерживающих выживание, пролиферативную активность, способность к миграции и фенотипичес-кие характеристики трансплантируемых клеток [1].
Гидрогели, используемые в качестве носителей клеточного компонента, должны быть биосовместимыми по отно-
шению к клеткам, а также тканям, куда впоследствии они будут имплантированы. Чтобы внутри гидрогелевых каркасов из пролиферирующих клеток формировались ткани, гидрогель должен способствовать миграции клеток в объем мат-рикса, их последующему прикреплению, делению и дифференцировке. Один из таких материалов -гиалуроновая кислота. Это гликозаминогликан, естественный компонент межклеточного вещества мягких тканей позвоночных, перспективный материал в восстановительной хирургии и тканевой инженерии [1].
Цель исследования - оценить эффективность регенерации периферического нерва при восстановлении диастаза с помощью комбинированного графта, представляющего собой трубчатую конструкцию из политетрафторэтилена с
взвесью мезенхимальных стволовых клеток (МСК), заполненную матриксом с инсталляцией МСК.
Материалы и методы
Исследование выполнено на 24 самцах белых беспородных крыс массой 265-320 г. Модель повреждения периферического нерва была создана по общепринятой методике [3]. Для проведения анестезии животным внутримышечно вводили раствор фентанила 0,005 % (1:1), из расчета 0,3 мл на 100 г веса, внутрибрюшинно. Седалищный нерв выделяли из доступа по задней поверхности правого бедра и пересекали его острым лезвием на уровне верхней трети бедра. Затем рану ушивали. Восстановление нерва выполняли через 3 недели после травмы.
В ходе эксперимента было выделено 3 группы. В контрольной группе (4 крысы) анастомоз формировали между протезом из политетрафторэтилена диаметром 2,2 мм и длиной 7 мм и концами нерва наложением швов нитью пролен 8/0 за эпиневрий и введением в просвет анастомоза раствора NaCl 0,9 % - 0,1 мл c использованием операционного микроскопа и микрохирургического инструментария, увеличение составляло до 8 крат. В качестве графта использовали сосудистый протез из политетрафторэтилена (ПТФЭ), который не подвергается распаду в условиях живого организма, сохраняя неизменность своих свойств независимо от времени, характеризуется высокоиммунологической толерантностью по сравнению с другими материалами. Во второй группе (10 крыс) в просвет анастомоза вводили взвесь МСК в количестве 1 х106/мл - 0,1мл, в третьей группе (10 крыс) просвет анастомоза заполняли матриксом с инсталляцией МСК в количестве 1 х 106/мл - 0,1 мл. В качестве матрикса использовали гель гиалуро-новой кислоты.
Выделение МСК из жировой ткани проводили по разработанному ранее протоколу [5]. Для трансплантации использовали клетки 2-го и 3-го пассажей.
Жизнеспособность клеток в геле гиалуроновой кислоты оценивали окрашиванием люминесцентными красителями: Хекст-33342 (Ho33342) и йодистый пропидий (PI) (Sigma, Германия). Рабочая концентрация каждого красителя составляла 10-5 М.
Через 8 недель после оперативного вмешательства производили забор и фиксацию материала. Зону анастомоза с протезом фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, после стан-
Рисунок 1
Выживаемость МСК в геле в течение: А - 5 мин, В - 1 час.
1 - жизнеспособные клетки (Хекст-33342);
2 - нежизнеспособные клетки (пропидий иодид)
Рисунок 2
Культивирование МСК в среде, содержащей 1/3 геля
Рисунок 3
Содержимое протеза и проксимальный конец седалищного нерва крысы, спустя 8 недель после восстановления, контрольная группа
2
| > I
vkiiÄ
ш
А-окраска по методу Ван-Гизона, В - окраска по методу MSB (Marcius-Scarlet-Blue), ув.5. 1 -сосудистый протез Gore-tex, 2 -концевая неврома,
3 - единичные коллагеновые волокна,
4 - скопления леммоцитов
дартной проводки заключали в парафиновые блоки. Оценку изменений нервной ткани проводили на продольных срезах. Для определения характера содержимого комбинированного графта, состояния аксонов поврежденного седалищного нерва в дистальном и проксимальном концах гистологические срезы препаратов окрашивали гематоксилин-эозином, MSB (Marcius-Scarlet-Blue) и по методам Ван-Гизона и Клювер-Баррера.
Результаты и обсуждение Определение жизнеспособности МСК в геле гиалуроновой кислоты. Используя
различные гидрогели в качестве матрикса для инсталляции МСК, необходимо учитывать их биосовместимость по отношению к клеткам и тканям, куда они будут имплантированы; свойства, способствующие миграции клеток в объеме матрикса, их последующему прикреплению, делению и дифференцировке [1]. На наш взгляд, гиалуроновая кислота отвечает этим требованиям.
Клетки окрашивали люминесцентными красителями: Хекст-33342 (Ho33342) и йодистый пропидий (PI) (Sigma, Германия). Рабочая концентрация каждого красителя составляла 10-5 М. Хекст 33342 применяли для визуализации ядер всех клеток, в то время как пропидий йодид
- для определения апоптоза и некроза, так как он проникает через мембраны только нежизнеспособных клеток.
При окрашивании МСК, находящихся в геле, содержащем в соотношениях 1:1 и 1:2 PBS+5% FCS (фосфатный буфер + 5% сыворотка), Хекст-33342 и йодистым пропидием жизнеспособность клеточных культур составила 98% и практически не изменялась в течение 30 мин
- 1часа (рис. 1).
Адгезивную способность МСК в геле оценивали путем культивирования МСК в среде, содержащей 1/3 геля, на куль-туральном адгезивном пластике. Уже на 1-е сутки МСК полностью прикреплялись к пластику и приобретали фибробласто-подобную морфологию (рис. 2).
Таким образом, в течение 1-2 часов в среде, содержащей фракцию геля, жизнеспособность и адгезивные свойства МСК не изменялись. Это подтверждает возможность использования геля гиалу-роновой кислоты в качестве матрикса для инсталляции МСК.
Гистологическое исследование. Через 8 недель после восстановления дефекта иссекали зону анастомоза вместе с протезом во всех экспериментальных группах. Гистологические срезы препаратов окрашивали гематоксилин-эозином, MSB (Marcius-Scarlet-Blue) и по методам Ван-Гизона и Клювер-Баррера.
Оценка морфологических изменений в контрольной группе. В препаратах контрольной группы отмечается очаговая лимфоплазмоцитарная инфильтрация, умеренная пролиферация шванновс-ких клеток. Некоторые аксоны резко истончены, что свидетельствует об их дегенерации. В проксимальном отрезке определяется картина, характерная для формирования регенерационной невромы: воспалительные круглоклеточные инфильтраты, единичные гигантские клетки,
беспорядочно расположенные аксоны. Анализ препаратов, окрашенных по MSB, выявил пролиферацию фибробластов и коллагеновых волокон (рис. 3).
Оценка морфологических изменений в опытной группе при трансплантации комбинированного графта из ПТФЭ с взвесью МСК. При трансплантации комбинированного графта с взвесью МСК просвет протеза заполнен светло окрашенным основным веществом с небольшим количеством фибробластоподобных клеток и единичными плазматическими клетками, отмечается образование многочисленных мелких кровеносных сосудов. В проксимальном конце определяется несколько большее количество аксонов по сравнению с контрольной группой. Для регенерационной невромы характерна упорядоченность аксонов, меньшее содержание коллагена. В дис-тальном конце беспорядочно расположены миелиновые волокна, цепочки лем-моцитоподобных клеток (рис. 4).
Более выраженный процесс ангиоге-неза обусловлен продукцией МСК проан-гиогенных факторов [4]. Трансплантация МСК приводит к улучшению васкуляриза-ции и, как следствие, улучшению регенерации нервного волокна.
В проксимальном отделе нерва наблюдается образование нежных кол-лагеновых волокон, по ходу которых определяются многочисленные мелкие вакуоли (рис. 5). Наличие многочисленных вакуолей является показателем активного пиноцитоза экзогенных белков, что характерно для аксонального конуса роста [2, 11]. Избирательное адгезивное взаимодействие между конусом роста и окружающим его субстратом определяет направление роста аксона.
Оценка морфологических изменений в опытной группе при трансплантации комбинированного графта из ПТФЭ, заполненного матриксом на основе геля ги-алуроновой кислоты с инсталляцией МСК. При заполнении протеза матриксом на основе геля гиалуроновой кислоты с инсталляцией МСК в зоне дефекта по-прежнему определяется большое количество шванновских клеток и меньшее - макрофагов, одиночные очаги воспалительной инфильтрации. Для регенерационной невромы характерна заметная упорядоченность аксонов, однако некоторые из них располагаются косо (рис. 6).
Наличие макрофагов как в контроле, так и в препаратах опытных групп подтверждает мнение ряда ученых о том, что данные клетки действуют совместно со шванновскими клетками в процессе
Рисунок 4
Седалищный нерв крысы
А - проксимальным конец седалищного нерва крысы и содержимое протеза, В - дистальный конец нерва. Опытная группа (в полость протеза введена взвесь МСК). Окраска MSB (Marcius-Scarlet-Blue), ув. 5. 1 - основное вещество, заполняющее протез, 2 - миелиновые волокна, 3 - кровеносные сосуды
Рисунок 5
Проксимальный конец седалищного нерва крысы
Опытная группа (в просвет протеза введена взвесь МСК). Окраска по методу MSB (Marcius-Scarlet-Blue), ув. 20. 1 - миелиновые волокна, 2 - кровеносные сосуды, 3 -вакуоли
Рисунок 6
Дистальный конец седалищного нерва крысы
«-4
Опытная группа (протез заполнен мат-риксом на основе геля гиалуроновой кислоты с инсталляцией МСК). А - окраска MSB (Marcius-Scarlet-Blue), ув. 5. В - окраска по методу Клювер-Баррера, ув.5. 1 - миелиновые волокна, 2 - шванновские клетки, 3-коллаге-новые волокна,4-кровеносные сосуды
фагоцитоза миелина, что ускоряет процесс Валлеровской дегенерации и ведет к более быстрой регенерации нервного волокна [9].
Гиалуроновая кислота является естественным компонентом межклеточного вещества, ингибирует пролиферацию фибробластов, ее относительно высо-
Рисунок 7
Содержимое
комбинированного
графта
А - содержимое протеза при введении взвеси МСК, окр. по методу Клю-вер-Баррера, ув.10, В - содержимое протеза при его заполнении матриксом на основе геля гиалуроновой кислоты с инсталляцией МСК, окр. по Клювер-Баррер, ув.10. 1 - миелиновые волокна, 2 - шванновские клетки, 3 - кровеносные сосуды, 4 - бюнгне-ровские ленты
кая концентрация во внеклеточном пространстве в первую фазу регенерации тканей частично ограничивает отложения внеклеточного матрикса и коллагена, что играет роль в предотвращении фиброза и формировании рубцовой ткани [1].
При сравнительном анализе препаратов обеих опытных групп более активный процесс определяется при заполнении протеза матриксом с инсталляцией МСК: выраженная васкуляризация и регенерация аксонов, большее количество продольно ориентированных миелиновых волокон, шванновских клеток, образующих цепочки, так называемые бюнгнеровские ленты, которые служат направляющими путями для регенерирующих аксонов (рис. 7).
Таким образом, проведенные нами исследования свидетельствуют об улучшении процессов посттравматической регенерации нервных волокон в периферическом нерве при восстановлении диастаза с помощью комбинированного графта на основе трубчатой конструкции из политетрафторэтилена и мезенхи-мальных стволовых клеток. В качестве тканевого матрикса может быть использован гель гиалуроновой кислоты, так как он обладает биосовместимостью по отношению к клеткам и тканям, не препятствует миграции клеток в объеме матрикса. Трансплантация МСК способствует васкуляризации и усиливает регенерацию нервного волокна, что обусловлено продукцией МСК проангио-генных факторов. При восстановлении дефекта комбинированным графтом, заполненным матриксом на основе геля гиалуроновой кислоты с инсталляцией МСК, снижается удельный объем фиброзного компонента, улучшается рост
аксонов и их проксимально-дистальная ориентация и, как результат, активизируется процесс восстановления периферического нерва.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Волова Т.Г., Шишацкая Е.И., Миронов П.В. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии [Электрон. ресурс] : электрон. учеб. пособие. - Красноярск: ИПК СФУ 2009.
2. Одинак М.М., Живолупов С.А. Заболевания и травмы периферической нервной системы (обобщение клинического и экспериментального опыта). Рук. для врачей. - СПб.: СпецЛит, 2009. - 367 с.
3. ПодгайскийВ.Н., Мечковский С.Ю., ПетроваД.Ю., и др. //Мед. новости. - 2009. -. № 9.- С.62-64.
4. Хулуп Г.Я., Ламовская Н.В., Багатка С.С. и др.// Медицина. - 2009.- № 3. - С. 70-75.
5. Хулуп Г.Я., Ламовская Н.В, Нижегородова Д.Б. и др. Сравнительная характеристика мезенхималь-ных стволовых клеток жировой ткани и костного мозга человека // М-лы науч.-практ. конф. «Состояние и перспективы трансплантологии». - Минск, 2008. - С. 156-161.
6. Челышев Ю.А., Богов А.А. // Невролог. вестн. -2008. - T.XL, вып.4. - С.101-109.
7. Battiston B. et al. // Microsurgery. - 2005. - Vol.25. -P. 258-267.
8. Delton A.L., Mackiinnon S.E. // Plastic. Reconstr. Surg. - 1988. - Vol. 82. -P. 849-856.
9. Hrrata K., Kawabuchi M. // Microscop. Research Technique. - 2002. - Vol.57. - P. 541-547.
10. Mackiinnon S.E., Delton AL. // J. Hand. Surg.-1988. - Vol. 6. - P. 935-941.
11. MakwanaM, Raivich G.// FEBS Journal. - 2005. -Vol. 272. - P. 2628-2638.
12. Siemionow M. et al. // Microsurgery. - 2010. -Vol. 30. - P. 574-588.
Поступила 24.05.2011 г.
Выявление аденомиоза матки с помощью УЗИ у женщин различных возрастных групп в зависимости от числа родов и абортов в анамнезе
Магалов И.Ш.
Азербайджанский медицинский университет, Баку
Magalov I.Sh.
Azerbaijan Medical University, Baku
Sonographic detection of adenomyosis uterin in women of different age depending on the number of abortion and deliveries
Резюме. Изучены сонографические признаки аденомиоза у 290 прооперированных автором женщин. Заранее было решено исключить пациенток в состоянии беременности (как маточной, так и внематочной), в послеродовом периоде, с отсутствием матки и прооперированных в экстренном порядке. Сонографические признаки аденомиоза матки чаще всего встречались у женщин в возрасте 41-50 лет, имеющих более 2-3 родов (%2=10,2; p <0,01) или абортов (%2=11,2; p < 0,001) в анамнезе. Однако нередко они обнаруживались и в более молодом возрасте при наличии репродуктивного желания. Ключевые слова: аденомиоз, ультразвуковое исследование, роды.
Summary. Sonographic examination of 290 patients operated by the same op-team was conducted in order to detect the prevalence of adenomyois uteri. A priori it has been decided to exclude gravidas and puerperas, women without uterus and those operated for emergency causes. It was revealed that adenomyosis was frequently met in women aged 41-50 with 2-3 deliveries (%2=10,2; p <0,01) and/or abortions (x2=11,2; p < 0,001) in anamnesis. At the same time adenomyosis turned to be not infrequent in earlier reproductive age by infertile patients. Keywords: adenomyosis, ultrasound examination, delivery.
В
современной гинекологии пересматривается взгляд на аденомиоз матки как патологию исключительно позднего репродуктивного возраста. Во многом это связано с развитием методов лучевой диагностики, позволяющих исследовать изменения в структуре маточной стенки in vivo у молодых женщин [4, 6]. Практическое значение имеет раннее и точное определение характера поражения, степень его распространения, что важно не только для выбора лечебных мероприятий, но и для контроля над их эффективностью [3].
Ультразвуковое исследование - один из простых и широко доступных методов визуализации в современной гинекологии. Несмотря на то что эхографические критерии диагностики аденомиоза матки нуждаются в совершенствовании [1, 3, 5], последние опубликованные в научной литературе сведения позволяют считать
сонографию достаточно информативной в отношении данного патологического состояния [7].
Цель исследования - выявить с помощью УЗИ встречаемость аденомиоза матки в различных возрастных группах в зависимости от числа родов и абортов в анамнезе
Материалы и методы Сонографические признаки аденомиоза изучались у 290 прооперированных нами женщин. Заранее было решено исключить пациенток в состоянии беременности (как маточной, так и внематочной), в послеродовом периоде, с отсутствием матки и прооперированных в экстренном порядке.
уЗи ТАС/ТВС (трансабдоминальная и трансвагинальная сонография) проводилось на аппаратах LOGIC-500GE (США) и MEDiSONSA-8000 (Корея) с использованием датчиков с частотой 5 МГц и 7 МГц. Для ультразвуковой диагностики адено-
миоза применялись критерии, описанные Демидовым В.Н., [усом А.И. [2].
Для статистической обработки полученных цифровых данных использовались вариационный и корреляционный (х2-критерий Пирсона) анализы. Результаты и обсуждение При ультразвуковом исследовании наличие аденомиоза было заподозрено в 110 случаях (37,9±2,8%).
Сонографические признаки адено-миоза матки чаще встречаются в возрасте 31-40 лет и 41-50 лет: 43,1±5,8 и 60,9±5,2% соответственно. Гораздо реже среди самых молодых (21 - 30 лет) и пожилых (старше 60 лет) женщин: 18,9±4,1 и 11,1±10,5% соответственно. Также было отмечено, что почти у половины женщин, имеющих в анамнезе 2 и более родов, на основании УЗИ можно предполагать наличие аденомиоза матки (60 из 124 женщин т.е. 48,4±4,5%). Однако сонографически
