CC BY
72
4. Мищенко, Л. Ю. Биохимические особенности линий льна масличного, различающихся по окраске семени / Л. Ю. Мищенко // Науч. - техн. бюл. ВНИИМК. - Краснодар. - 2001. - Вып.124. - С. 112-113.
5. Мищенко, Л. Ю. Наследование окраски цветков и семян у некоторых линий льна / Л. Ю. Мищенко // Научн.- техн. бюл. ИМК. - Запорожье, 2004. - Вып. 9. - С. 59-66.
6. Пороховинова, Е. А. Создание и изучение генетической коллекции льна (LINUM USITATISSIMUML.): автореф. дис. на соиск. степени канд. биол. наук: спец. 03.00.15 «Генетика» / Е. А. Пороховинова. - СПб, 2002. - 18 с.
7. Saeidi G., Rowland G.G. The inheritance of variegated seed color and palmitic acid in flax // J. Hered., 1997. - 88(6) - P. 466468.
8. Ягло, М. М. Успадкування забарвлення насшня у льону олшного / М. М. Ягло, I. О. Полякова, В. О. Лях // Вгсник аграрно! науки. - К., 2008. - Вип. № 3. - С. 47-48.
УДК 634.75
М. Ю. ШПАК, Т. В. НИКОНОВИЧ
ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ ЗЕМЛЯНИКИ САДОВОЙ (FRAGARIAxANANASSA DUCH.) В КУЛЬТУРЕ IN VITRO ПРИ РАЗЛИЧНОМ ОСВЕЩЕНИИ
(Поступила в редакцию 22.05.2015)
Показана эффективность применения света искусст- We have shown the influence of application of artificial light
венных диодов (СИД) на развитие растений-регенерантов diodes (LEDs) on the development of regenerated plants
Fragaria x ananassa Duch. в культуре in vitro на этапе проли- Fragaria x ananassa Duch. in vitro at the stage of proliferation.
ферации. Установлено, что посредством изменения физиче- We have established that by varying the physical parameters of
ских параметров освещения возможно управлять процесса- lighting it is possible to control the growth and development of
ми роста и развития растений, сводя к минимуму затраты plants, minimizing the cost of the use of growth regulators,
на использование регуляторов роста при сохранении высоких while maintaining high levels of reproduction coefficient. показателей коэффициента размножения.
Введение
Совокупность физических факторов оказывает воздействие на морфофизиологические характеристики растений как in vivo, так и in vitro [5, 7-9]. Одним из наиболее значимых физических условий для нормального роста и развития растений является свет, его интенсивность, спектральный состав и периодичность освещения.
Анализ источников
В культуре in vitro, немаловажное значение играет источник света и его физические характеристики. На сегодняшний день, перспективным направлением является использование светодиодного освещения для культивирования растений в условиях in vitro. Данная технология позволяет сократить расходы на искусственное освещение, а также дает возможность располагать источники света в непосредственной близости к растению, тем самым не влияя на условия температурного режима помещения, в котором культивируются растения. Действие узкополосного света может контролировать и управлять морфофизиологическими процессами, протекающими в растении на разных стадиях его развития. Наиболее значимыми в физиологическом отношении являются синяя и красная области спектра фотосинтетически активной радиации (ФАР), т. к. они способствуют синтезу белков, служат источником энергии для протекания процесса фотосинтеза, а также оказывают непосредственное влияние на скорость развития растительного организма [5, 7]. Данные о роли других спектров монохромного освещения представлены в научной литературе многими авторами и это свидетельствует о том, что рассмотрение вопроса вызывает большой интерес [2-5, 10, 12].
Методы исследования
Целью нашего исследования было изучение особенностей развития растений-регенерантов земляники садовой (Fragaria^ananassa Duch.) в культуре in vitro при различном освещении.
Исследования проводили в лаборатории кафедры сельскохозяйственной биотехнологии и экологии УО «Белорусская государственная сельскохозяйственная академия». Использовали два сорта земляники садовой различного срока созревания Вента и Зенга-Зенгана. Растения культивировали в течение тридцати дней на питательной среде Мурасиге-Скуга по основному составу с добавлением бензиладенина (БА) в концентрации 0,5 мг/л, индолилмасляной кислоты (ИМК) - 0,1 мг/л и гиббе-релловой кислоты (ГК3) — 0,1 мг/л при температуре +23-25 °С, относительной влажности воздуха 70±3 %, при световом режиме 16/8 час. Повторность двукратная, по 5 растений на повторность.
В качестве экспериментальных источников освещения в культуре тканей использовали светодиодные ленты Arlight RT 2 - 500 12V: синего (470 нм), зеленого (525 нм), желтого (590 нм), красного
(625 нм) и белого спектра, а также светодиодные установки, сочетающие в себе комбинации различных спектров света: красный и желтый в соотношении 1:1, красный и зеленый в соотношении 1:1, красный и синий в соотношении 3:1, красный и синий в соотношении 1:1, а также полихромное освещение, т. е. сочетание красного, синего, белого, желтого и зеленого спектров в соотношении 1:1:1:1:1. Красная область спектра присутствует во всех вариантах светодиодных установок, так как красные лучи являются основным поставщиком энергии для фотосинтеза и влияют на процессы, связанные с изменением скорости развития растения [5, 7, 8]. В качестве контрольного варианта применяли люминесцентные лампы белого света Cool Daylight (765 нм) марки OSRAM с мощностью напряжения 36 Вт.
Для оценки эффективности воздействия источника искусственного освещения на развитие растений Fragaria x ananassa Duch. в культуре in vitro на этапе пролиферации были изучены следующие биометрические показатели: средний размер растения (определяли путем измерения высоты микроконгломерата после удаления крупных листьев, см), коэффициент размножения (количество микророзеток у отдельного конгломерата, шт.). Учет степени витрификации и каллусообразования вели по схемам, предложенными А. А. Змушко
Витрификация:
0 % - отсутствие витрификации;
0,1-33,3 % - слабовыраженная витрификация: легкий характерный блеск органов растения, слабо выраженная прозрачность, утолщение стебля у основания;
33,4-66,6 % - средневыраженная витрификация: уродливое увеличение стеблей и листьев, полупрозрачность тканей «цвета бутылочного стекла», хрупкость; описанные признаки характерны для тканей, составляющих от 1/3 до 2/3 от объема микроконгломерата;
66,7-100 % - сильновыраженная витрификация: уродливое увеличение стеблей и листьев, полупрозрачность тканей «цвета бутылочного стекла», хрупкость; описанные признаки характерны более чем для 2/3 объема микроконгломерата.
Каллусообразование:
0 % - отсутствие каллусообразования;
0,1-33,3 % - слабовыраженное каллусообразование, объем каллусных тканей составляет менее чем 1/3 от общего объема микроконгломерата;
33,4-66,6 % - средневыраженное каллусообразование, объем каллусных тканей составляет от 1/3 до 2/3 от общего объема микроконгломерата;
66,7-100 % - сильновыраженное каллусообразование, объем каллусных тканей составляет более 2/3 от общего объема микроконгломерата [6].
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили в программе MS Excel 2007.
Основная часть
Проведенные исследования позволили установить различия в биометрических параметрах у рас-тений-регенерантов Fragaria x ananassa Duch. при культивировании in vitro в условиях различного спектрального состава света (рис. 1).
S-
о
tí &
3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00
■Зенга-Зенгана
Вента
У
f
нср ,
„=0,53
•V
Ч*
Вариант освещения
Рис. 1. Влияние спектрального состава света на размер растений-регенерантов Fragaria x ananassa Duch.
сортов Зенга-Зенгана и Вента в культуре in vitro
Наиболее крупные растения-регенеранты Fragaria x ananassa Duch. сорта Зенга-Зенгана были сформированы под люминесцентными лампами белого света (контроль) — 2,87 см по сравнению с растениями, выращенными под экспериментальными источниками освещения. Сочетание красного и синего света в соотношении 1:1 способствовало формированию наиболее компактных растений (1,76 см) в сравнении с контрольным вариантом, различия между данными составили 1,6 раза. Под воздействием других вариантов освещения формировались растения, имеющие размер 1,84-2,68 см. Различия в сравнении с контрольным вариантом составили от 1,07 до 1,6 раза соответственно. Размер растений-регенерантов сорта Вента, культивируемых на синем свету, был выше (2,98 см), чем растений контрольного варианта (2,36 см) в 1,3 раза. Воздействие красного и синего спектров в соотношении 3:1 способствовало замедлению роста растений-регенерантов земляники садовой сорта Вента — 2,08 см.
Благоприятные условия для формирования растений сорта Вента создавали белый и зеленый спектры в сравнении с контрольным вариантом. Размеры растений под указанными вариантами освещения составили 2,89 и 2,81 см и превосходили контроль в 1,2 раза.
Таким образом, для получения растений-регенерантов наибольшего размера Fragaria x ananassa Duch. в культуре in vitro для сорта Зенга-Зенгана целесообразно использовать люминесцентные лампы белого света (контроль), а для сорта Вента — синий свет светодиодов. Менее пригодными для данного процесса являются сочетание красного и синего света в соотношении 1:1 для сорта Зенга-Зенгана и комбинация красного и синего спектров в соотношении 3: 1 для сорта Вента.
Установлено, что для получения наибольшего числа микророзеток растений-регенерантов земляники садовой сорта Зенга-Зенгана в условиях культуры in vitro целесообразно использовать зеленый спектр света светодиодов (15,9 шт.), значения по данному показателю превышали контроль (12,4 шт.) в 1,3 раза. Менее пригодным для данного процесса являлось сочетание красного и зеленого спектров в соотношении 1:1. Значение показателя коэффициента размножения при этом освещении ниже контрольного варианта в 1,8 раза. Выявлено, что использование красного спектра света способствовало увеличению коэффициента размножения растений-регенерантов Fragaria x ananassa Duch. сорта Вента (14,9 шт.) в сравнении с контрольным вариантом (9,6 шт.). Различие между значениями составило 1,6 раза. Данные о положительном влиянии красного спектра света на коэффициент размножения земляники садовой в культуре in vitro в данном случае согласуются с проведенными нами ранее исследованиями по изучению влияния спектрального состава света на рост и развитие растениий-регенерантов земляники садовой сорта Дачница [12]. У сорта Вента, в отличие от сорта Зенга-Зенгана, на зеленом свету получено наименьшее количество микророзеток (5,0 шт.), что в 1,9 раза ниже, чем в контрольном варианте (рис. 2).
18,00 g 16,00 £ 14,00
8 12,00
9,60 9,2
■Зенга-Зенгана
■Вента
НСР0 05=3,27 (для вариантов освещения)
Вариант освещения
Рис. 2. Влияние спектрального состава света на коэффициент размножения растений-регенерантов Fragaria x ananassa Duch. сортов Зенга-Зенгана и Вента в культуре in vitro
Таким образом, для получения наибольшего числа микророзеток растений-регенерантов земляники садовой сорта Зенга-Зенгана в условиях культуры in vitro целесообразно использовать зеленый спектр света, а для культивирования растений-регенерантов сорта Вента на этапе собственномикро-размножения наиболее оптимальным является использование красного света.
Корреляционный анализ данных показал, что для сорта Зенга-Зенгана при красном, желтом, зеленом и синем спектрах значения размера и коэффициента размножения находятся в сильной прямой зависимости (0,71; 0,82; 0,76; 0,74). Для сорта Вента выявлена средняя прямая зависимость между признаками на полихромном свету 1:1:1:1:1 (0,61), а также сильная обратная зависимость между размером и коэффициентом размножения при желтом — -0,71 и синем освещении — -0,87 (табл. 1).
Таблица 1. Значение коэффициента корреляции (r) между размером и коэффициентом размножения растений-регенерантов Fragaria x ananassa Duch. сортов Зенга-Зенгана и Вента в культуре in vitro
Сорт Контроль (лампа дневного света) Белый Красный Красный/Же лтый 1:1 Красный/Зеле ный 1:1 Крас-ный/Син ий 3:1 Поли-хромный 1:1:1:1:1 Желтый Зеленый Крас-ный/Син ий 1:1 Синий
Размер растения, см
Коэфф. рзмн., шт. Зенга-Зенгана -0,20 0,03 0,71** 0,04 0,25 0,21 0,19 0,82** 0,76** -0,13 0,74**
Вента -0,21 -0,03 0,3 0,2 0,38 0,44 0,61* -0,71** -0,17 -0,01 -0,87**
Примечание: Корреляция * - 0,5<r<0,7 - средняя; ** - r>0,7 - сильная (уровень значимости Р<0,05).
Установлено, что культивирование растений-регенерантов сорта Зенга-Зенгана под монохромным красным, желтым, зеленым и синим освещением позволяет получать более крупные растения с наибольшим коэффициентом размножения, что снижает затраты на использование регуляторов роста и значительно облегчает работу с такими растениями в культуре in vitro. Для сорта Вента наиболее крупные растения наряду с высоким коэффициентом получены при использовании полихромного освещения 1:1:1:1:1.
Биологические особенности культуры и проявление сортоспецифичности не дают возможность образовать крупные с высоким коэффициентом размножения растения-регенеранты сорта Вента при использовании желтого и синего освещения, в отличие от сорта Зенга-Зенгана.
На этапе собственно микроразмножения необходимо получать максимальное количество мери-клонов, для этого в составе питательной среды используются высокие концентрации цитокининов, которые могут повлиять на качество посадочного материала и вызвать формирование растений с измененной морфологией, подавление пролиферации пазушных меристем, образование гипероводнен-ных побегов (витрификацию) или избыточное каллусообразование [11]. В связи с этим в эксперименте было изучено влияние спектрального состава света на проявление признаков витрификации и кал-лусообразования на фоне 0,5 мг/л бензиладенина (рис. 3, 4).
Вариант освещения
Рис. 3. Влияние спектрального состава света на степень витрификации и каллусообразования растений-регенерантов Fragaria x ananassa Duch. сорта Зенга-Зенгана в культуре in vitro
Рис. 4. Влияние спектрального состава света на степень витрификации и каллусообразования растений-регенерантов
Fragaria x ananassa Duch. сорта Вента в культуре in vitro
Значения показателей витрификации побегов у растений-регенерантов Fragaria x ananassa Duch. сортов Зенга-Зенгана в культуре in vitro находились в пределах от 3,3 до 56,7 %. Проявление признака витрификации тканей на слабом уровне отмечено при культивировании растений земляники садовой сорта Зенга-Зенгана при контрольном варианте освещения, белом, красном освещении, при сочетании красного и желтого спектров в соотношении 1:1, красного и синего спектров в соотношении 3:1, полихромном 1:1:1:1:1, желтом и зеленом освещении. Наибольший процент верифицированных тканей на данном уровне отмечен у растений-регенерантов, культивируемых при полихромном освещении - 23,3 %, что в 7 раз выше, чем в контрольном варианте (3,3 %). Средняя степень гиперо-водненности была характерна для растений-регенерантов, выращенных на красно-зеленом 1:1 (36,7 %) и красно-синем 1:1 (50,0 %) свету. Наибольший процент верифицированных тканей выявлен у растений-регенерантов, выращенных на монохромном синем свету - 56,7 %, что в 17 раз выше, чем в контрольном варианте.
Слабая степень каллусообразования отмечена при воздействии каждого из используемых источников освещения от 3,3 до 33,3 %). Взаимное проявление эффектов гипероводненности и каллусооб-разования выявлено на всех вариантах освещения, кроме желтого спектра.
Наличие признаков витрификации и каллусообразования у растений-регенерантов земляники садовой в культуре in vitro повлияло на коэффициент размножения. Микророзетки, которые обладали данными признаками, выбраковывали как непригодные для дальнейшего использования.
Степень проявления витрификации для растений-регенерантов сорта Вента варьировала от 0 до 50,02 %. Отсутствие витрификации тканей у данного сорта наблюдалось в варианте с красным светом и при сочетании красного и синего спектров в соотношении 3:1. Наряду с этим на указанных спектрах зафиксирована слабая степень каллусообразования 13,3 и 3,3 % соответственно. Слабая степень витрификации тканей отмечена при культивировании растений земляники садовой сорта Вента на всех спектрах экспериментального освещения, кроме зеленого. Для данного спектра характерна средняя степень витрификации тканей на уровне 50,02 %, что превышает контроль в 2,5 раза. При выращивании растений-регенерантов на контрольном варианте освещения, белом, красном освещении, при сочетания красного и зеленого спектров в соотношении 1:1, красного и синего спектров в соотношении 3:1, полихромном 1:1:1:1:1, желтом, зеленом освещении, в варианте, сочетающем красный и синий спектры в соотношении 1:1, а также синем спектре наблюдали слабую степень калусо-образования от 3,3 до 33,3 %. При использовании красного и желтого спектров в соотношении 1:1 степень каллусообразования находилась на среднем уровне и составила 53,4, что в 2 раза выше, чем в контрольном варианте. Взаимное проявление витрификации и каллусообразования отмечено при культивировании растений на всех вариантах освещения в различном процентном соотношении, кроме красного спектра света и при сочетании красного и синего спектров в соотношении 3:1.
Таким образом, снизить проявление признаков гипероводненности и каллусообразования до уровня 3,3 % у растений-регенерантов сорта Зенга-Зенгана позволяет культивирование на белом свету. Для сорта Вента на этапе пролиферации для устранения эффекта гипероводненности (0 %) и снижения степени каллусообразования до слабого уровня (3,3 и 13,3 %) целесообразно использовать сочетание красного и синего спектров в соотношении 3:1 и монохромного красного света соответственно.
Заключение
Выращивание растений-регенерантов Fragaria x ananassa Duch. сортов Зенга-Зенгана и Вента в культуре in vitro при различном освещении показало, что размер растений-регенерантов сорта Зенга-Зенгана был наибольшим при использовании люминесцентных ламп белого света (контроль), для сорта Вента — синего света светодиодов. Менее пригодными являлись сочетания красного и синего света в соотношении 1: 1 для сорта Зенга-Зенгана и комбинация красного и синего спектров в соотношении 3:1 для сорта Вента.
Для получения наибольшего числа микророзеток растений-регенерантов земляники садовой сорта Зенга-Зенгана в условиях культуры in vitro целесообразно использовать зеленый спектр света, а для культивирования растений-регенерантов сорта Вента на этапе собственномикроразмножения наиболее оптимальным является использование красного света.
Увеличение размера растений с сохранением высокого коэффициента размножения возможно при выращивании растений сорта Зенга-Зенгана на красном, желтом, зеленом и синем свету, для растений сорта Вента - при полихромном 1:1:1:1:1 освещении.
Снизить проявление признаков гипероводненности и каллусообразования до уровня 3,3 % у расте-ний-регенерантов сорта Зенга-Зенгана позволяет культивирование на белом свету. Для сорта Вента на этапе пролиферации для устранения эффекта гипероводненности (0 %) и снижения степени каллусообразования до слабого уровня (3,3 %) целесообразно использовать сочетание красного и синего спектров в соотношении 3:1. Данный эффект может быть достигнут при использовании низких концентраций цитокининов в питательной среде при сочетании с рекомендуемым спектральным составом света.
Таким образом, при культивировании растений-регенерантов Fragaria x ananassa Duch. сорта Зен-га-Зенгана, использование белого света светодиодов позволяет получить достаточно крупные растения (2,68 см) с приемлемым коэффициентом размножения (14,1 шт.) и низким уровнем витрифика-ции и каллусообразования (3,3 %) в сравнении с контрольным вариантом. Для сорта Вента, с этой целью, следует использовать монохромный красный свет.
ЛИТЕРАТУРА
1. Алексеенко, Л. B. Влияние спектрального состава света на биометрические показатели эксплантов земляники в культуре in vitro / Л. В. Алексеенко, Л. В. Белякова, В. А. Высоцкий // Плодоводство и ягодоводство России: сб. научн. работ. - М., 2009. -Т. XXII. - Ч. 1. - С. 183-188.
2. Высоцкий, В. А. Влияние спектрального состава света на развитие эксплантов земляники in vitro / В. А. Высоцкий , Л. В. Алексеенко, Л. В. Белякова // Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий и Инновации в биологии для развития биоиндустрии сельскохозяйственной продукции, 4-10 июля 2011г., ИНГУ им. Н. И. Лобачевского. - Нижний Новгород, 2011. - С. 163-164.
3. Головацкая, И. Ф. Роль криптохрома 1 и фитохромов в регуляции фотоморфогенетических реакций растений на зеленом свету // Физиология растений. - 2005. - Т. 52, № 6. - С. 822-829.
4. Головацкая, И. Ф. Регуляторное влияние зеленого света на фотосинтез растений Lichnis chalcedonica / И. Ф. Головацкая, Р. А. Карначук, М. С. Гинс // Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования. Матер. I межд. симп. - Пущино, 1995. - С. 41-43.
5. Дорофеев, В. Ю. Оптимизация светового режима при культивировании оздоровленных растений картофеля in vitro с целью повышения продукционного процесса / В. Ю. Дорофеев, Ю. В. Медведева, Р. А. Карначук // Материалы VI Московского международного конгресса, часть 1 (Москва, 21-25 марта, 2011 г.). - М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2011. - С. 238-239.
6. Змушко, А. А. Морфогенез, изменчивость и оздоровление в культуре in vitro клоновых подвоев яблони : дис. ...канд. с/х наук : 06.01.05 / А. А. Змушко. - Самохваловичи, 2013. - 128 с.
7. Карначук, Р. А. Влияние света на баланс фитогормонов и морфогенез в культуре ткани зародышей пшеницы / Р. А. Карнарчук, Е. С. Гвоздева // Физиология растений. -1998. - Т. 45, № 2. - С. 289 - 295.
8. Карначук, Р.А. Гормональный статус, рост и фотосинтез растений, выращенных на свету разного спектрального состава / Р. А. Карнарчук, И. Ф. Головацкая // Физиология растений. - 1998. - Т. 45, вып. 6. - С. 925-934.
9. Карначук, Р. А. Фоторегуляция роста и продуктивности растений картофеля при размножении in vitro / Р. А. Карнарчук, В. Ю. Дорофеев, Ю. В. Медведева / VII Съезд общества физиологов растений России, Международная конференция «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» 4-10 июля 2011. - Нижний Новгород, 2011. - С. 313-314.
10. Никонович, Т.В. Влияние спектрального состава света на морфофизиологические реакции растений-регенерантов Solanum tuberosum в условиях культуры in vitro / Т. В. Никонович, М. Ю. Шпак, А. В. Левый // Биотехнологические приемы в сохранении биоразнообразия и селекции растений: Междунар. науч. конф. - Минск, 2014.
11. Семенас, С. Э. Клональное микроразмножение земляники садовой и оздоровление от патогенных вирусов : дис. ... канд. с/х наук : 06.01.05 / С. Э. Семенас. - Самохваловичи, 2004. - 112 с.
12. Шпак, М. Ю. Влияние спектрального состава света на развитие растений-регенерантов Fragaria*ananassa Duch. в условиях культуры in vitro /М. Ю. Шпак, Т. В. Никонович// Агропромышленный комплекс: контуры будущего. Материалы Междунар. науч.-практ. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых. - Курск, 2014.
