CC BY
38
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
УДК 581.1:577.1
ОСОБЕННОСТИ ПРОРАСТАНИЯ СЕМЯН ВИКИ В ПРИСУТСТВИИ ИОНОВ НИКЕЛЯ В СРЕДЕ
Э.А. Абрамова, В.В. Иванищев
Исследовали прорастание семян вики в широком диапазоне концентраций хлорида никеля (0 - 0,01 М). В работе показано, что процесс сопровождается значительным (почти 4-х кратным) повышением активности амилазы и неоднозначными изменениями активности уреазы. Дисбаланс между скоростями метаболизма углерода и азота может объяснить снижение выживаемости проростков к двухнедельному сроку, несмотря на высокие показатели всхожести семян. Результаты кластерного анализа экспериментальных данных полностью укладываются в рамки предложенных ранее теоретических представлений о влиянии физиологически значимых тяжелых металлов на растения.
Ключевые слова: никель, прорастание семян, уреаза, амилаза, активность ферментов.
Среди незаменимых металлов никель занимает одно из ключевых мест в метаболизме белков. Ранее нами показано, что в сформированных проростках вики даже присутствие минимально необходимого количества ионов металла вызывало проявление окислительного стресса, выражавшегося в изменении различных физиолого-биохимических показателей [1, 2]. Поэтому представляло интерес изучить биохимические особенности прорастания семян в этих условиях.
В семенах различных растений запасные питательные вещества представлены одними и теми же основными группами соединений -белками, углеводами и жирами, но соотношение их бывает неодинаковым. Так, например, у бобовых растений, к которым относится вика, содержание белка составляет 25-27 %, углеводов - 49,8 %, 1,7 % приходится на жиры и 3,2% - на минеральные вещества [3]. Органические вещества, входящие в состав семени, одновременно образуют его основу и представляют собой пул олигомеров, обеспечивающих рост и развитие зародыша.
Характер и интенсивность физиологических процессов, протекающих в прорастающих семенах, зависят от активности комплекса ферментов в них. Главная особенность прорастания и его общая биохимическая направленность - распад в эндосперме/семядолях высокомолекулярных веществ и, прежде всего, полисахаридов до растворимых низкомолекулярных углеводов под действием ферментов амилолитического комплекса [4], в результате чего моносахара становятся
первичными источниками энергии, а также многих разнообразных органических веществ до формирования автотрофной системы.
В то же время в семенах зернобобовых культур существенную роль играет метаболизм запасных белков. Важнейшей проблемой в таком случае является распад белков и аминокислот с образованием мочевины, которая служит источником азота для образования аминокислот, используемых в синтезе белков и ферментов de novo. Ключевая роль в процессе мобилизации аммония принадлежит уреазе - ферменту, активность которого абсолютно зависит от присутствия ионов никеля, входящего в активный центр фермента [5]. Другим источником азота для этой реакции являются запасные уреиды, в ходе метаболизма которых также образуется мочевина [6].
Никель, несмотря на его отнесение к группе тяжелых металлов, является незаменимым компонентом активного центра фермента уреазы [7] и влияет на многие физиологические процессы, протекающие в растении [5].
В экспериментах по влиянию тяжелых металлов обычно рассматривают физиолого-биохимические изменения в растениях, выросших на загрязнённой среде (субстрате) и не затрагивают вопрос об особенностях прорастания семян и формирования ювенильных растений. Поэтому цель работы состояла в изучении особенностей метаболизма прорастающих семян вики, важных для формирования проростков и поддержания их гомеостаза на самых ранних этапах развития.
Методика
Объектом исследования служили семена вики (Vicia sativa L.) сорта Орловская-84. Семена проращивали, как описано ранее [1]. Известное взаимодействие и конкуренция металлов объясняют отсутствие в среде иных компонентов, кроме дистиллированной воды.
Активность ферментов в семенах определяли на 3-й день прорастания. Амилазную активность в семенах определяли стандартным методом по убыли крахмала в реакционной среде [8]. Активность фермента выражали в милиграммах израсходованного крахмала на 1 г сырой массы семян в минуту. Определение активности уреазы основано на учете количества образовавшегося аммиака при действии препарата фермента на мочевину [9]. Активность фермента выражали в милиграммах азота за 1 мин на грамм сырой массы семян. На рисунках приведены только средние величины из трех-пяти биологических и аналитических повторностей. Результаты экспериментов обрабатывали статистически с использованием программы Statistica 6.0. Статистические данные приведены в подписях к рисункам.
Результаты и обсуждение
Исследование прорастания семян вики в присутствии ионов никеля показало следующую картину (рис. 1).
а б
Рис. 1. Влияние ионов никеля на прорастание семян вики (энергия прорастания, Р<0,001 (а); всхожесть, Р<0,001 (б); достоверные отклонения от контроля (*)), К - контроль
В ходе эксперимента происходило постепенное уменьшение числа проросших семян. При этом падение энергии прорастания (на 10 %)
5 3
наблюдали при концентрации Ю" М и выше. После концентрации 10 М снижение показателя было более резким (на 30-85 %), но всё-таки сохранялось на минимальном уровне (15 %) даже при такой высокой концентрации соли никеля, как 10" М. В то же время всхожесть (на 7-й день прорастания в соответствии с ГОСТ 12038-84) для семян этого растения резко снижалась только при максимально изученной концентрации хлорида никеля, превышающей 5 мМ (рис. 1, б).
С другой стороны, как показали последующие эксперименты, несмотря на высокий процент всхожести на 7-й день, многие характеристики двухнедельных проростков свидетельствовали о нарушении гомеостаза проростков при гораздо более низких концентрациях хлорида никеля, что приводило к гибели растений при концентрации соли выше, чем 1 мМ [1, 10]. В этом аспекте высокая всхожесть семян при концентрациях исследуемой соли до 5 мМ вовсе не отражает возможность дальнейшего выживания проростков при таких концентрациях соли тяжёлого металла. Более того, многие физиолого-биохимические показатели формирующихся проростков меняются в негативную сторону примерно при тех же концентрациях, при которых наблюдали и снижение энергии прорастания семян [10-12]. Ранее стимуляция прорастания семян в присутствии низких концентраций солей никеля была показана для риса, пшеницы, тимофеевки, гороха, бобов, сои, люпина [5, 7].
В прорастании семян ключевая роль принадлежит их запасным веществам. Первыми источниками энергии и метаболитов, как известно, являются запасные углеводы, в мобилизации которых ключевая роль принадлежит ферментам амилазного комплекса. Исследование показало, что активность фермента росла с увеличением содержания соли никеля в среде (рис. 2).
3,5 -
I 3" Т 1 Ш
Е у —
| 2,5- Т I 1
ф |
® Т I 1
= 2~ п Г1 Г1 £
=1'5" о
5 1-^1
0,5 -
о -I——Ц—I——,_1—1_,——1_,———,_1——,_1—1_,——1_,———,_1--
К 1 5 10 50 100 500 1000 5000 10000
мкМ
Рис. 2. Изменение активности амилазы в зависимости от концентрации хлорида никеля в среде в трехдневных прораставших семенах вики (Р<0,001) (контроль (К))
Такие результаты говорят о том, что ионы никеля стимулируют синтез/активность фермента амилазы. Поэтому можно полагать, что негативное влияние высоких концентраций хлорида никеля не отражается существенно на скорости использования запасных углеводов, а затрагивает дальнейшие физиолого-биохимические процессы, обеспечивающие использование углеводов, мобилизуемых амилазой. Ранее на проростках гороха было показано, что в семядолях преобладает альфа-амилаза, активность которой возрастает, по крайней мере, в течение 10 первых дней прорастания [13-15]. Однако данных о влиянии никеля на активность фермента в этих работах, как и в иных, известных нам публикациях, не приведено.
Ранее показано негативное влияние присутствия цитрата на метаболизм азота в культуре тканей бобов сои, а также негативное влияние ацетата никеля на прорастание семян вики, связанное именно с присутствием ацетат-аниона [10]. Такие результаты предполагают, что указанные метаболиты, образуемые в процессе дыхания в ходе превращения запасных углеводов, в связи с увеличением активности амилазы (рис. 2) могут оказывать негативные последствия ввиду
дисбаланса скоростей с иными физиологическими процессами и путями метаболизма, возможно, в первую очередь через недостаточную скорость окисления углеводов в цикле Кребса. В пользу такой интерпретации свидетельствуют и данные о снижении активности ферментов дыхательных процессов в присутствии ионов тяжелых металлов, в т.ч. никеля [16].
Принадлежность вики к семейству Leguminosae предполагает интенсивный метаболизм белков и аминокислот в связи с обменом и нейтрализацией токсичного аммония, образуемого в ходе катаболизма веществ этой природы. Поэтому понятен интерес к изучению фермента уреазы, играющей ключевую роль в указанном процессе. Исследование показало, что наибольшая величина активности фермента проявлялась при концентрации хлорида никеля в среде, равной 10-5 М (рис. 3).
Рис. 3. Изменение активности уреазы в зависимости от концентрации хлорида никеля в среде в трехдневных прораставших семенах вики (Р=0,020) (контроль (К))
Такие результаты позволяют предположить, что отмеченная концентрация в наибольшей степени обеспечивала максимальное проявление активности фермента, осуществляющего утилизацию образующейся мочевины. В отсутствие и при минимальной концентрации соли никеля - металла ещё недостаточно, но при повышении концентрации наблюдали ингибирующий эффект.
В экспериментах на семенах арабидопсиса минимально необходимой считалась концентрации соли никеля, равная 1 мкМ [7]. При этом абсолютные величины активности в расчете на 1 мг белка в минуту были сходными. Интересно, что в первые два дня прорастания семян расходуется имеющийся пул фермента, после чего происходит его синтез
de novo [7]. Поэтому результаты наших экспериментов, в большей степени, относятся к имеющемуся пулу фермента, чем к вновь синтезируемым его фракциям.
Для культуры клеток бобов сои показано, что присутствие 300 мкМ никеля в среде приводило к увеличению активности фермента в 30 раз. Однако в условиях нашего эксперимента за такой короткий период прорастания семян фермент, по-видимому, не успевал синтезироваться de novo. В отмеченной работе также показано, что присутствие 10 мкМ ионов никеля приводило к 10-кратному увеличению активности уреазы. Результаты наших экспериментов показывают только двукратное увеличение активности фермента (рис. 3) при этой концентрации никеля, что, возможно, обусловлено использованием в эксперименте целого объекта, а не отдельных его клеток.
Таким образом, показано, что в ходе прорастания семян вики повышение концентрации хлорида никеля в среде приводило к снижению энергии прорастания и всхожести семян. При этом активность амилазы возрастала, в то время как активность уреазы менялась в условиях эксперимента. Можно предположить, что при прорастании семян вики в присутствии высоких концентраций соли никеля нарушается баланс между метаболизмом углеводов и белков, которые связаны через продукты цикла Кребса, что может служить задачей дальнейших исследований.
Полученные результаты были подвергнуты кластерному статистическому анализу (метод Уорда для построения «деревьев») в рамках модели, которая предусматривает деление спектра концентраций физиологически значимых тяжелых металлов на ряд зон, соответствующих разному физиологическому состоянию растений [17]. Результаты показали, что однозначно выделяется кластер, объединяющий две максимальные концентрации соли никеля в эксперименте (рис. 4).
На несколько меньшем евклидовом расстоянии происходит объединение концентраций 5, 10 и 50 мкМ. Отдельный кластер формируют промежуточные концентрации в 100, 500 и 100 мкМ. Некоторым диссонансом является объединение с этим кластером точки, соответствующей 1 мкМ соли в среде. Тем не менее, в целом результаты позволяют выделить пределы концентраций хлорида никеля, которые оказывают физиологически разное влияние на процессы прорастания семян и сказываются на формировании проростков [18, 19]. Так, кластер, образуемый двумя максимальными концентрациями хлорида никеля, соответствует точкам, в которых проростки не доживали до двухнедельного срока и погибали. Поэтому они были отнесены нами к зоне токсических концентраций - зоне гибели проростков [19]. Зоны с точками 5, 10 и 50 мкМ (рис. 4) соответствуют зонам физиологической необходимости и толерантности (недостаточного и оптимального количества) никеля для формирования и поддержания гомеостаза
проростков вики. Точки 100, 500 и 1000 мкМ (рис. 4) соответствуют зонам концентраций, которые были отнесены нами к зоне, где происходит нарушение гомеостаза через увеличение окислительного стресса из-за избытка металла в среде и проростках. Но при этом проростки сохраняли жизнеспособность к двухнедельному сроку [18-20].
Tree Э&з гаи 1&г 9 Cases
. . *TK7Bd
МКМ Ejclöeai dlsQxes
1
100
500
1000 5
50
10
5000 10000
00 05 10 2 Я 25 -5 А 55
ШадеС^м
Рис. 4. Кластеризация результатов исследования семян вики
Таким образом, полученные результаты физиолого-биохимических особенностей прорастающих семян вики в условиях возрастающих концентраций хлорида никеля в среде вполне укладываются в рамки предложенных зон концентраций для физиологически значимых металлов [17], а также схемы, описывающей разное физиологическое состояние проростков вики в условиях эксперимента [19].
Библиографический список
1. Абрамова Э.А., Иванищев В.В. Исследование морфогенеза проростков при прорастании семян вики в присутствии ионов никеля // Известия ТулГУ. Естественные науки. 2012, а. Вып. 2. С. 246-252.
2. Абрамова Э.А., Иванищев В.В. Исследование показателей проявления окислительного стресса в проростках вики в присутствии хлорида никеля // Бутлеровские сообщения. 2013. Т. 33. № 1. С. 43-46.
3. Павловская Е.Н. Биохимия зерновых и крупяных культур. Орел: Орел ГАУ, 2010. 299 с.
4. Хелдт Г.-Х. Биохимия растений. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2011. 471 с.
5. Серегин И.В., Кожевникова А. Д. Физиологическая роль никеля и его токсическое действие на высшие растения // Физиология растений. 2006. Т. 53. № 2. С. 285-308
6. Shelp B.J., Ireland R. Ureide metabolism in leaves of nitrogen fixing soybean plants // Plant Physiol. 1985. V. 77. P. 779-783.
7. Zonia L.E., Stebbins N.E., Polacci J.C. Essential role of urease in germination of nitrogen-limited Arabidopsis thaliana seeds // Plant Physiol. 1995. V. 107. P. 1097-1103.
8. Иванищев В.В. Биохимический эксперимент. Проведение, обработка и интерпретация результатов. Практикум. Тула: Изд-во ТГПУ им. Л.Н.Толстого, 2002. 75 с.
9. Плешков Б.П. Практикум по биохимии растений. М.: Колос, 1968. 178с.
10. Абрамова Э.А., Иванищев В.В. Влияние различных солей никеля на характеристики проростков вики // Современные проблемы науки и образования. 2012, б. № 4; URL: http://www.science-education.ru/104-6690 (дата обращения: 16.07.2012).
11. Абрамова Э.А., Иванищев В.В. Содержание воды в проростках вики и накопление ими биомассы в присутствии ионов никеля // Научные ведомости БелГУ. 2012, в. № 15 (134). Вып. 20. С. 42-45.
12. Абрамова Э.А., Иванищев В.В. Содержание фотосинтетических пигментов и аскорбиновой кислоты в проростках вики в присутствии хлорида никеля // Научные ведомости БелГУ. 2012. № 9 (128). Вып. 19. С.152-155.
13. Yomo H, Varner J.E. Control of the formation of amylases and proteases in the cotyledons of germinating peas // Plant Physiol. 1973. V. l 51. P. 708-713.
14. Monerri C, Garcia-Luis A, Guardiola J.L. Sugar and starch changes in pea cotyledons during germination. // Physiol Plant. 1986. V. 67. P. 49-54.
15. Beers E.P., Duke S.H. Characterization of a-amylase from shoots and cotyledons of pea (Pisum sativum L.) seedlings // Plant Physiology. 1990. V. 92 (4). P. 1154-1163.
16. Бездудная Е.Ф. Влияние солей тяжелых металлов на активность ферментов глиоксилатного цикла и митохондриальной сукцинатдегидрогеназы в прорастающих семенах сои // Физиология и биохимия культурных растений. 2002. Т. 41. № 2. С. 176-182.
17. Prasad M.N.V. Heavy Metal Stress in Plants: From Biomolecules to Ecosystems. 2010.
18. Абрамова Э.А., Иванищев В.В. Физиолого-биохимические процессы в семенах и проростках вики в условиях возрастающих концентраций хлорида никеля // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов: Межрегиональный сборник научных работ. Вып. 15. ВГУ: 2013. С. 22-26.
19. Абрамова Э.А. Влияние различных концентраций ионов никеля на прорастание семян и формирование проростков вики. - Автореф. дис... канд. биол. наук. М., 2016.
20. Ivanishchev V.V., Abramova E.A. Accumulation of nickel ions in seedlings of Vicia sativa L. and manifestations of oxidative stress // Environ Sci Pollut Res. 2015. V. 22 (10). P. 7897-7905. DOI 10.1007/s11356-015-4173-8.
Абрамова Эльвира Александровна, инженер кафедры биологии и экологии, abramea@mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный педагогический университет им. Л.Н. Толстого,
Иванищев Виктор Васильевич, д-р биол. наук, старший научный сотрудник, зав. кафедрой, avdey_ VV@mail. ru, Россия, Тула, Тульский государственный педагогический университет им. Л.Н. Толстого
Characteristics of vetch seed germination in the presence of nickel ions in the
medium
E.A. Abramova, V.V. Ivanishchev
The seed vetch germination was studied in a wide range of nickel chloride concentrations (0 - 0.01 M). It is shown that the process is accompanied by a significant (almost 4fold) increase in amylase activity and ambiguous changes of urease activity. The imbalance between the rates of carbon and nitrogen metabolism may explain the decrease in survival rate of seedlings to two weeks, in spite of the high rates of seed germination. The results of cluster analysis of experimental data completely fall within the previously proposed theoretical ideas about the influence of physiologically indispensable heavy metals on plants.
Key words: nickel, seed germination, urease, amylase, enzyme activity.
Abramova Elvira Alexandrovna, engineer of Department of Biology and ecology, abramea@mail.ru, Tula, Russia, Tula State Lev Tolstoy Pedagogical University
Ivanishchev Viktor Vasiljevich, Doctor of Biology, Senior Researcher, Head of the Department, avdey_ VV@mail. ru, Russia, Tula, Tula State Lev Tolstoy Pedagogical University
