CC BY
90
ВЕСТНИК УДМУРТСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
409
2017. Т. 27, вып. 3
Краткие сообщения
УДК 581.3:502 (045)
Е.Н. Кузнецова, О.Г. Баранова
ОСОБЕННОСТИ ПРОРАСТАНИЯ СЕМЯН РЕДКОГО РАСТЕНИЯ ASTER AMELLUS L. В КУЛЬТУРЕ IN VITRO
Микроклональное размножение позволяет поддерживать в коллекции in vitro эксплантаты редких растений. В связи с этим были проведены работы по выявлению особенности ввода в стерильные условия с помощью семян редкого вида в Удмуртской Республике - Aster amellus L. Первоначальная проверка жизнеспособности семенного материала, а также ввод в культуру in vitro производились по общепринятым методикам. В нестерильных лабораторных условиях наилучший показатель всхожести (60 %) наблюдается при проращивании на свету и температуре 25 °С. Оптимальным вариантом стерилизации семян в условиях in vitro является сочетание 70 %-го раствора этилового спирта и 15 %-го раствора перекиси водорода, а также аналогичный комплекс, дополненный 1 %-м раствором нитрата серебра (всхожесть составила 30 % и 26,7 %). Использование многоступенчатой стерилизации семенного материала позволяет снизить степень зараженности первичных эксплантов, но в то же время резко увеличивается процент нежизнеспособных и аномальных эксплантов.
Ключевые слова: Aster amellus L., микроклональное размножение, прорастание семян, редкие растения, in vitro.
Использование биотехнологических методов существенно расширило возможности сохранения редких видов растений за пределами их естественных местообитаний (ex situ). Микроклональное размножение позволяет поддерживать в коллекции in vitro эксплантаты редких растений. В качестве первичных эксплантов возможно использование различных тканей и органов растений, в том числе и семенного материала. Но применение надземных и подземных частей растений как первичных экс-плантов сильно ограничено ввиду небольшого объема и сильной степени загрязненности подобного материала. Использование семян на этапе ввода редкого вида в культуру in vitro позволяет получить относительно большое количество стерильных эксплантов и тем самым повысить вероятность успешности дальнейших этапов микроклонального размножения. Однако в настоящий момент не существует унифицированной методики ввода с помощью семян в стерильные условия для многих редких видов, поэтому целью данной работы было выявление особенности прорастания семян редкого вида Aster amellus в условиях in vitro.
Материалы и методы исследований
Объектом исследования послужил вид Aster amellus L. (сем. Asteraceae), занесенный в Красную книгу Удмуртской Республики и имеющий 3 статус редкости [1]. Семена для экспериментов были собраны с растений, произрастающих в природной популяции в Малопургинском районе Удмуртии. Во всех экспериментах в каждом варианте опыта использовалось по 20 полновесных семян в трехкратной повторности. Первоначально был осуществлен подбор оптимального режима температуры и освещенности для прорастания семян, а также проверка жизнеспособности собранного семенного материала. Семена проращивались в чашках Петри на влажной фильтровальной бумаги по общепринятой методике [2]. Для подбора оптимальных условий проращивания были выбраны четыре варианта условий, отличающиеся как по температурному режиму, так и по режиму освещенности:
1) 25 °С, 16-часовой фотопериод;
2) стратификация (4 недели при 5 °С), после окончания стратификации проращивание при 16-часовом фотопериоде и температуре 25 °С;
3) 25 °С, отсутствие освещения;
4) стратификация (4 недели при 5 °С), после окончания стратификации проращивание при отсутствии освещения и температуре 25 °С.
Далее производился ввод A. amellus в культуру in vitro по общепринятым методикам [3; 4]. Посев семян осуществлялся на питательную среду Мурасиге-Скуга (MS) по стандартной прописи без добавления фитогормонов. Данная среда считается универсальной для культивирования большинства
410
2017. Т. 27, вып. 3
Е.Н. Кузнецова, О.Г. Баранова
БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
видов растений [4]. Основной задачей на этапе ввода в культуру in vitro был подбор сочетаний стерилизующих агентов, незначительно влияющих на жизнеспособность семян и проростков, но одновременно обеспечивающих высокую степень освобождения семенной поверхности от различных патогенов. Для стерилизации материала были использованы различные химические вещества с разным временем экспозиции в них: 70 %-й раствор этилового спирта (время экспозиции семян в растворе составляет 1 мин), 15 %-й раствор перекиси водорода (10 мин), 1 %-й раствор нитрата серебра (1 мин), 10 %-й раствор препарата «Белизна» (5 мин). В ходе экспериментов была проведена ступенчатая стерилизация с использованием различных сочетаний указанных выше дезинфектантов.
Во всех экспериментах оценка проростков производилась по следующим параметрам, указанным в литературе [5]:
1) проросток обладает хорошо развитой корневой системой, включая главный корень;
2) у проростка хорошо развитое и целое подсемядольное колено;
3) проросток обладает неповрежденной почечкой с хорошо развитыми зелеными листьями;
4) у проростков двудольных две семядоли;
5) проростки двудольных с одной семядолей или незначительным повреждением верхних частей обеих семядолей без повреждения верхушечной почечки.
Статистическая обработка полученных экспериментальных данных производилась с использованием базового пакета анализа данных программы Microsoft Excel. Сравнение статистической достоверности различий при обработке результатов проводилось с помощью t-критерия Стьюдента, различия считали статистически значимыми при P<0,05.
Результаты и их обсуждение
Перед началом экспериментов была проведена оценка собранных семян по морфометрическим параметрам. Семена A. amellus темно-коричневые, яйцевидные, уплощенные. Семенная поверхность опушена короткими волосками, что может затруднить ее освобождение от инфекции при помощи комплекса стерилизующих агентов. Данные по количественным параметрам приведены в табл. 1.
Таблица 1
Морфометрические характеристики семян Aster amellus
Длина семян (без хохолка), мм Ширина семян, мм Масса 1000 семян, г
2,43±0,05 1,04±0,02 0,71±0,01
Исходя из полученных данных по морфометрическим характеристикам, семена А. аше11ш легковесные, небольшие. Имеются незначительные расхождения выявленных параметров семян с указанными в литературе [6; 7], что может быть связано с жизнеспособностью особей данного лесостепного вида на северном пределе распространения.
Согласно данным М.Г. Николаевой [8], для большинства видов семейства А81етаееае характерны светочувствительность, а также неглубокий физиологический тип покоя семян, преодолеваемый кратковременным воздействием низких положительных температур. При проращивании в нестерильных условиях (табл. 2) наилучший показатель всхожести был выявлен у семян, проращиваемых на свету при температуре 25 °С (60 %, различия статистически достоверны), что подтверждает литературные данные о светочувствительности семян. При стратификации всхожесть снижается, что может быть связано с продолжительным воздействием низких положительных температур на зародыш. В дальнейшем для данного вида предпосевная подготовка в виде стратификации не использовалась, семена проращивались на свету при 25 °С. Прорастание А. аше11ш начинается на 4-6 день от закладки опыта, аномалий в развитии проростков не наблюдалось.
Таблица 2
Всхожесть семян Aster amellus в нестерильных условиях
Без стратификации Стратификация
16-часовой фотопериод, % Освещение отсутствует, % 16-часовой фотопериод, % Освещение отсутствует, %
60,0±5,8 6,7±3,0 35,0±2,9 10,0±1,2
Особенности прорастания семян редкого растения Aster amellus L.
БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
411
2017. Т. 27, вып. 3
Для ввода семян в культуру in vitro были использованы четыре сочетания указанных выше стерилизующих агентов. Соотношение нормально проросших семян, инфицированных семян, аномалий в развитии проростков показано в табл. 3.
Таблица 3
Сравнение комплексов стерилизующих агентов по эффективности и тератогенному воздействию на семена Aster amellus в условиях in vitro
Вариант стерилизации Нормально проросшие семена, % Аномалии развития, % Непроросшие семена, % Инфицированные семена, %
70 % спирт +10 % «Белизна» 6,7±З,З 1З,З±1,7 ЗЗ,З±6,7 З1,7±1,1
70 % спирт +15 % перекись З0,0±5,8 20,0±2,9 45,0±2,9 5,0±0
70 % спирт +1 % нитрат серебра 20,0±5,0 11,7±1,7 40,0±2,9 28,З±1,7
70 % спирт +15 % перекись + 1 % нитрат серебра 26,7±1,7 15,0±5,0 55,0±2,9 З,З±1,7
При проращивании в условиях in vitro доля нормально проросших семян во всех вариантах опыта достоверно ниже по сравнению с аналогичным показателем в нестерильных условиях. При использовании любого из указанных сочетаний стерилизующих агентов возникают аномалии в развитии проростков: выявлены проростки либо без хорошо развитой корневой системы, либо с отклонениями в цвете вегетативных органов. Вероятно, снижение всхожести и появление аномалий может быть связано с высокой степенью токсичности использованных веществ и их негативным влиянием на зародыш семени. Наблюдались незначительные задержки в прорастании семян в условиях in vitro по сравнению с проращиванием в нестерильных условиях, прорастание A. amellus в условиях in vitro начинается на 8-10 день от закладки опыта.
Наиболее эффективными сочетаниями стерилизующих агентов оказались комплексы, состоящие из 70 %-го этилового спирта и 15 %-ой перекиси водорода, а также аналогичное сочетание с добавлением 1 %-го раствора нитрата серебра (всхожесть составила 30 % и 26,7 % соответственно), при этом доля контаминированных семян в данных вариантах обработки достоверно низкая (от 3,3 % до 5,0 %). Высокий процент инфицированных семян наблюдается при обработке комплексами веществ, состоящих из 70 %-го спирта и 10 %-го раствора препарата «Белизна» или 1 %-го раствора нитрата серебра. Данные комплексы дезинфектантов неэффективно освобождают поверхность семени от патогенов, вероятно, вследствие наличия опушения на семенной поверхности.
Заключение
В результате проведенных экспериментов выявлены особенности прорастания семян редкого вида Aster amellus в стерильных условиях. Оптимальным режимом температуры и освещенности для проращивания семян данного вида является 16-часовой фотопериод и температура 25 °С, всхожесть в нестерильных условиях составила около 60 %. При использовании стерилизующих агентов для ввода семян как первичных эксплантов в культуру in vitro следует учитывать влияние дезинфектантов на зародыш семени. Многоступенчатая стерилизация значительно снижает жизнеспособность семян и проростков Aster amellus, ведет к увеличению аномалий развития, но одновременно способствует устранению патогенов с семенной поверхности. Наиболее эффективными сочетаниями стерилизующих агентов для стерилизации семян A. amellus явились сочетания этилового спирта, перекиси водорода и нитрата серебра (всхожесть составила 26,7 % и 30 % соответственно).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Красная книга Удмуртской Республики. 2-е изд. / отв. ред. О.Г. Баранова. Чебоксары: Перфектум, 2012. 458 с.
2. Николаева М.Г., Лянгузова И.В., Поздова Л.М. Биология семян. СПб.: НИИ химии СПбГУ, 1999. 233 с.
3. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе. М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. 160 с.
4. Smith R.H. Plant tissue culture. Techniques and experiments. San Diego: Academic press, 2013. 188 p.
412
2017. Т. 27, вып. 3
Е.Н. Кузнецова, О.Г. Баранова
БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
5. Международные правила анализа семян / Пер. с англ. Н.Н. Антошкиной. М.: Колос, 1984. 310 с.
6. Броувер В., Штелин А. Справочник по семеноведению сельскохозяйственных, лесных и декоративных культур с ключом для определения важнейших семян / Пер. с нем. В.И. Леунова. М.: Тов-во науч. изд. КМК, 2010. 694 с.
7. Munzbergova Z., Raabova J., Castro S., Pankova H. Biological flora of Central Europe: Aster amellus L. (Asteraceae) // Perspectives in plant ecology, evolution and systematics. 2011. Vol. 13, iss. 2. Р. 151-162.
8. Николаева М.Г. Особенности прорастания семян растений из подклассов Dilleniidae, Rosidae, Lamiidae и Asteridae // Бот. журн. 1989. Т. 74, № 5. С. 651-668.
Поступила в редакцию 18.07.17
E.N. Kuznetsova, O. G. Baranova
FEATURES OF SEED GERMINATION OF RARE PLANT ASTER AMELLUS L. IN CULTURE IN VITRO
Microclonal reproduction allows to maintain in the collection in vitro explants of rare plants. In this connection, work was carried out to identify the peculiarities of entering into sterile conditions with the help of seeds of a rare species in the Udmurt Republic - Aster amellus L. Initial check of the viability of seeds, as well as introduction to culture in vitro were performed according to standard techniques. In non-sterile laboratory conditions the best index of germination (60 %) is observed at germinating in the light and temperature of 25 °C. The best option of seeds sterilization is a combination of 70 % ethanol and 15 %> hydrogen peroxide solution and a similar set supplemented with 1% silver nitrate solution (germination was 30 % and 26,7 % respectively). The use of multistage sterilization of seed can reduce the degree of contamination of initial explants, but at the same time the percentage of non-viable and abnormal explants abruptly increases.
Keywords: Aster amellus L., microclonal reproduction, seed germination, rare plants, in vitro.
REFERENCE
1. Krasnaya kniga Udmurtskoj Respubliki. 2-e izd. [The Red Book of the Udmurt Republic. 2-d edition], O.G. Baranova (ed.), Cheboksary: Perfectum, 2012, 458 p. (in Russ.).
2. Nikolaeva M.G., Layanguzova I.V. and Pozdova L.M. Biologiya semyan [Biology of seeds], Saint Petersburg.: RI of chemistry SPBU, 1999, 233 p. (in Russ.).
3. Butenko R.G. Biologiya kletok vysshikh rasteniy in vitro I bioteknologiya na ikh osnove [Cell biology of higher plants in vitro and biotechnology based on them], М.: FBK-PRESS, 1999, 160 p. (in Russ.).
4. Smith R.H. Plant tissue culture. Techniques and experiments, San Diego: Academic press, 2013, 188 p.
5. Mezhdunarodnyyepravila analiza semyan [International rules of seed analysis], М.: Kolos, 1984, 310 p. (in Russ.).
6. Brower B. and Shtelin А. Spravochnikpo semenovedeniyu selskokhozyaystvennykh. lesnykh i dekorativnykh kultur s klyuchom dlya opredeleniya vazhneyshikh semyan [Reference book on study of seeds of agricultural, forest and decorative growth with a key for identifying the most important seeds], М.: Tovarishchestvo nauchnykh izdaniy KMK, 2010, 694 p. (in Russ.).
7. Munzbergova Z., Raabova J., Castro S. and Pankova H. Biological flora of Central Europe: Aster amellus L. (Asteraceae), in Perspectives in plant ecology, evolution and systematic, vol. 13, iss. 2, 2011, pp. 151-162.
8. Nikolaeva M.G. [Features of seed germination of plants of subclass Dilleniidae. Rosidae. Lamiidae and Asteridae], in Botanical journal, 1989, vol. 74, no 5, pp. 651-668 (in Russ.).
Кузнецова Екатерина Николаевна, аспирант E-mail: pteris-2008@mail.ru
Баранова Ольга Германовна, доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой ботаники и экологии растений E-mail: ob@uni.udm.ru
Kuznetsova E.N., postgraduate student E-mail: pteris-2008@mail.ru
Baranova O.G.,
Doctor of Biology, Professor, Head of Department of botany and plant ecology E-mail: ob@uni.udm.ru
ФГБОУ ВО «Удмуртский государственный университет» 426034, Россия, г. Ижевск, ул. Университетская, 1 (корп. 1)
Udmurt State University
Universitetskaya st., 1/1, Izhevsk, Russia, 426034
