CC BY
136
Известия ТСХА, выпуск 1, 2007 год
УДК 576.35:631.533.1
ОСОБЕННОСТИ ПРОЛИФЕРАЦИИ БОКОВЫХ ПОБЕГОВ ПРИ МИКРОКЛОНАЛЬНОМ РАЗМНОЖЕНИИ САДОВЫХ РАСТЕНИЙ
В.И. ДЕМЕНКО, И.А. ПОЗДНЯКОВ (Кафедра плодоводства)
Сделан анализ второго этапа микроклонального размножения. Показана зависимость его эффективности от содержания азота и соотношения аммиачной и нитратной формы. Выявлены факторы, увеличивающие количество больших побегов.
Степень пролиферации и качество побегов зависит от солевого, гормонального состава среды, условий выращивания, количества пассажей. В конечном счете коэффициент размножения связан с апикальным доминированием. Ранние исследования предполагали, что апекс ингибирует развитие боковых почек вследствие лимитированного снабжения их питанием. Несмотря на то, что эта гипотеза была подтверждена экспериментально, открытие ауксина показало, что он может заменить апекс, т.е. в апикальном доминировании стала превалировать гормональная теория. Однако работы Гордона [1] показали, что апикальное доминирование может контролироваться азотом и фосфором. Таким образом, коэффициент размножения in vitro зависит не только от регуляторов роста, но и от минерального состава среды. При этом основная роль в снятии апикального доминирования отводится цитокининам. Как правило, те сорта и культуры, которые быстро поглощают и быстро разрушают цитокинины, обладают высоким коэффициентом размножения in vitro [3]. Добавление ауксинов улучшает качество побегов. Следует отметить, что эти вещества стимулируют производство этилена [2], чрезмерный синтез которого может вызвать аномальное развитие побегов.
Окончательный коэффициент размножения растений in vitro зависит от условий, созданных для роста боковых меристем первичного экспланта.
Условия и методы исследований
Конгломераты культивировали при 16-часовом дне, температуре 23-25°С, освещенности 3000-3500 лк. Деление конгломератов проводили после 3-го пассажа. Продолжительность пассажа — 3_4 недели. Культуры хранили в бытовом холодильнике при температуре 2~4°С. Электростатическое поле создавали генератором высокого напряжения 524 В. Интенсивность выделения этилена эксплантами груши определяли методом газожидкостной хроматографии.
Результаты исследований
Способность экспланта к пролиферации зависела от предварительного воздействия на него. Обработка низкими положительными температурами эксплантов земляники, актинидии увеличивала их приживаемость и количество боковых побегов, что, возможно, связано с аккумулированием предшественника ауксина в почках [4]. На этапе пролиферации экспланты актинидии развивали большие листья, кото-
рые поднимали эксплант над средой, что уменьшало коэффициент размножения. Удаление листьев и размещение побегов горизонтально стимулировало развитие боковых побегов и их рост.
При отделении экспланта от маточного растения сохраняются некоторое время коррелятивные связи между примордиальными листьями и пазушными меристемами экспланта. Прорастание их в побеги зависело от места взятия эксплантов и наличия примор-диальных листьев (табл. 1).
Таблица 1 Влияние типа экспланта и наличия листьев на пролиферацию боковых побегов земляники (среда М.С., 6 БАП
0,3 мг/л, сорт Гренада, 1985 г.)
Тип экспланта
Количество боковых побегов, шт.
Приживаемость, %
Верхушки усов 500 мкм,
без листьев 2,6 75 Верхушки усов 500 мкм, с листьями 5,2 80 Почка первого междоузлия уса без листьев 3,5 78 Почка первого междоузлия с листьями 4,1 100 НСР05 1,3
Удаление листьев уменьшало приживаемость верхушек побегов земляники и их пролиферацию на 1-м пассаже. Аналогичные результаты получены в опытах с крыжовником. Электростатичское поле стимулировало развитие боковых побегов только у земляники на средах с высоким содержанием 6БАП (5 мг/л) за счет развития адвентивных побегов.
Этот вывод подтверждается данными, которые получены нами в опытах с использованием цветоложа земляники. В контроле цветоложе развивалось в ягоду, а в условиях электростатического поля — в конгломерат побегов.
Пролиферация боковых побегов земляники зависела от состава и формы питательной среды. На среде Мюлле-на отмечена массовая гибель эксплан-тов. Среда Енига стимулировала рост
в длину центрального побега, что угнетало развитие боковых. Среда Фос-сарда способствовала образованию конгломерата без ярко выраженного лидера и в отличие от среды М.С. не вызывала развитие каллуса. Максимальное число боковых побегов получено на твердых средах М.С. и Фоссарда. Среда М.С. отличается от других сред в первую очередь содержанием азота. При уменьшении концентрации азота и увеличении кальция в среде М.С. в 2 раза повышалось побегообразователь-ная способность земляники, особенно в сосудах небольшого объема.
Пролиферация боковых побегов земляники и розы зависела от соотношения аммиачной и нитратной формы азота.
Таким образом, 2-й этап микрокло-нального размножения земляники следует проводить на модифицированной среде М.С. с общей концентрацией азота 20 мМ при соотношении МН4: N0,, 1:2. В этом случае признаки стекло-видности отсутствовали (табл. 2).
Па среде М.С. экспланты розы развивались толстые, короткие боковые побеги. Больше половины из них были с признаками стекловидности. Существенное уменьшение содержания азота в питательной среде ухудшало качество побегов роз. Максимальный коэффициент размножения получен на средах, с содержанием азота 10,3-13,7 мМ. Концентрацию кальция необходимо рассчитывать с учетом сортовой реакции (табл. 3).
Рост эксплантов роз и их пролиферация зависели от соотношения МН4: Ш3 (табл. 4).
При добавлении в среду МН4С1 лучшее развитие конгломерата отмечено в варианте МН4 : 1 : 2, а при ис-
пользовании (МН4)2 S04 — 1:3. Побе-гообразовательная способность земляники зависела от концентрации 6 БАП и состава питательной среды предыдущего пассажа. Отсутствие регуляторов роста в средах 1-го пассажа существенно сказалось на побегообразо-
Таблица 2
Влияние концентрации общего азота и соотношения N^^03 на рост и развитие конгломератов земляники
(среда М.С., 6 БАП 0,3 мг/л, ИМК 0,2 мг/л, ГКЗ 0,1 мг/л, сорт Редгонтлит, 1986 г.)
Содержание общего азота, мМ Количество листьев, шт. Количество боковых побегов, шт. Развитие конгломерата
соотношение NN4 ЫОз, мМ
1 0 Очень слабое, стекловидность,
5 0 0 красного цвета
10 0 0
20 0 0
0 1 Превалирует развитие листьев,
5 39 2,4 боковые побеги малого размера
10 20 5
20 13 0
1 1 Листья красного цвета, с увеличением дозы
5 5 0 азота рост побегов увеличивается
10 3 4
20 8 20
2 1 Листья красного цвета,
5 0 0 новые не образуются
10 4 1
20 6 0
10 3 1 1 Окончания листьев красного цвета, с увели-
5 чением дозы азота их рост улучшается
10 16 1
20 23 2
1 2 С увеличением дозы азота длина боковых
5 17 7 побегов равна длине центрального побега
10 9 13
20 35 38
1 3 Сильное развитие центрального побега
5 23 2
10 29 0
20 17 3
Таблица 3 Влияние солевого состава среды на развитие боковых побегов у розы (среда М.С., 6 БАП 2 мг/л, НУК 0,004 мг/л, 1987 г.)
Сорт
Среда Эдель- Мер- Треве-
вейс седес люнде
количество боковых побегов,
шт.
1 Са 9,6 2,6 9
2 Са 12,0 3,6 9
N 6,7мМ+1 Са 10,3 3,0 5,3
N 6,7мМ+2 Са 8 9
1\110,ЗмМ+1 Са 12 8,6 9,3
N 10,ЗмМ+2 Са 12 11 9,3
N 13,7мМ+1 Са 15 7,3 11
Ы13,7мМ+ 2 Са 8,6 14,3
НСР05 2,6 1,5 1,1
Таблица 4 Влияние соотношения NH4:N03 на рост и развитие эксплантов роз (среда модифицированная для роз, в среднем по сортам Литл Бакара, Нью Даун, Соня, Фламинго, Эйфелева башня, 2001-2004 гг.)
ЫН4:Ы03
Приживаемость, %
Количество
боковых побегов, шт.
Длина побегов, см
1:1 2:1 3:1 1:2
1:3
46 30 98 100
2,8
3.0
3.1 3,1 3,1
2,14
1,46
1,68
2,5
2,32
нательной способности (табл. 5). Если принять во внимание, что на 2-м пассаже использовали отдельные побеги, то можно предположить, что даже не-
Таблица 5
Влияние концентрации 6 БАП и гормонального состава предыдущего пассажа на побегообразовательную способность земляники (среда модифицированная М.С. элитные сеянцы НИЗИСНП, количество боковых побегов шт., 1983 г.)
Концентрация 6 БАП, мг/л Гормональный состав предыдущего пассажа, мг/л
без регуляторов роста 6 БАП 0,06 без регуляторов роста 6 БАП 0,06 без регуляторов роста 6 БАП 0,06
гибриды
118/1620 172/1450 37/2920
0,2 1,0 2,5
11 22 29
19 27 35
10 26 35
13 28 43
20 20
13 26 28
большие концентрации 6 БАП 1-го пассажа могут создать предпосылки для развития адвентивных побегов.
Побегообразовательная способность эксплантов земляники была в 2 раза выше, если в среде 1-го пассажа применяли нуклеопептиды.
Начало пролиферации боковых побегов яблони зависело от гибридной формы. Спуровые формы яблони, отличающиеся хорошей регенерацией на 1-м пассаже, достигали максимального коэффициента размножения к 25-му, плохо вводимые в культуру — к 7-му пассажу. Способность к длитель-
ному размножению также зависела от гибридной семьи. Спуровая форма 269 продуцировала боковые побеги в течение 14 пассажей, остальные — в течение 10-13, после чего наступала гибель культур (табл. 6).
Если после 9-10-го пассажа проли-ферирующие культуры подвергали воздействию низкими положительными температурами (2~4°С) в течение 4~
5 недель и уменьшали концентрацию
6 БАП до 0,01-0,1 мг/л, то число продуктивных пассажей увеличивалось.
Известно, что укоренение боковых побегов in vitro зависит от культуры,
Таблица 6
Интенсивность развития боковых побегов различными спуровыми формами яблони in vitro (среда М.С. 6 БАП 2 мг/л, 1988-1989 гг.)
Количество боковых побегов, шт.
Номер пассажа гибридная семья
267/29 267/30 267/26 | 268 273 269 275
1 2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12
13
14
15
В среднем HCPos
4,0 9,8
5.2 5,5 4,7
11.4 13,0
12.5
12.6
6.3 4,7
8,6 2,3
1
6,0 11,4 18,1 24,1 16,3
16.3 23,23 15,1
11.4
15,8 3,7
4 15,4 11,2 11,0 14,0 8,6 7,8
9.7
9.8
9,5 3,8
1
4.0
3.5 4,9
6.1 9,8 5,4
3.2
9.6
5.3 7,8
6,0 1,5
1
3,0 4,0 2,2
2.3 3,0
6.5
5.8
7.4
5.6 9,6
6.9 6,6
5,4 1,3
3 21,3
7.6
7.7
8.8 11,6 14,5 10,9 7,7 11,5
7.1
9.2 6,9 5,9
10,1 1,6
1
3,0 6,0 6,0
5.3 8,6 8,7
8.4 7,4 7,2
6,4
1,3
сорта, состава питательной среды, особенно от числа пассажей и длины боковых побегов. Боковые побеги хорошо укореняются, если их длина более 1,5 см. Выход больших побегов зависел от способности спуровых форм яблони к пролиферации. Доля длинных побегов существенно уменьшилась на 10 м пассаже у форм с большим коэффициентом размножения. Слабо про-лиферирующие спуры образовывали большие побеги стабильно на протяжении всего периода культивирования. У подвоя 62-396 развитие больших побегов продолжалось в течение 14 пассажей (табл. 7). Следует отметить положительную корреляцию между общим числом боковых побегов и развитием длинных побегов у спуро-вых форм 269,273 (коэффициент корреляции 0,93; 0,74). Для остальных форм такая корреляция отсутствовала. С увеличением количества пассажей уменьшался коэффициент размножения, увеличивалась доля небольших побегов, наступала гибель пролифери-рующих культур.
Количество длинных побегов у яблони й груши увеличивалось в условиях электростатического поля.
Использование питательной среды, содержащей 1 мг/л ГКЗ и 0,1 мг/л ССС
Таблица 7 Влияние продолжительности культивирования на выход побегов яблони, пригодных для укоренения _(1988-1989 гг.)
Количество побегов > 1,5 см, %
Номер пассажа спуровая форма 273 спуровая форма 269 подвой 62-396
3 100 41 49,7
4 100 45,3 47,6
5 100 47,3 45,0
6 100 53,4 37,1
7 44,4 49,2 30,3
8 52,1 45,8 38,9
9 45,6 42,9 47,3
10 43,7 36,0 42,4
11 48,8 39,3 39,0
12 49,0 39,9 40,1
13 46,9 46,6 36,0
14 34,7
перед укоренением побегов земляники, стимулировало рост растяжением более 80% побегов и они достигали длины 1 — 1,5 см. Если конгломерат помещали на среду, содержащую 0,5 — 1 мг/л культара, то через месяц боковые побеги разделялись простым нажатием иглой. Оба способа облегчают и ускоряют этап пересадки побегов на укоренение.
Побегообразовательная способность вишни сорта Любская и подвоя ПЗ превосходила яблоню и особенно грушу. Уже на 3-4-м пассаже коэффициент размножения вишни достигал 1:30, а подвоя ПЗ — 1:70. Данная особенность косточковых культур объясняется их способностью развивать in vivo несколько генераций пазушных меристем за вегетацию.
В процессе микроклонального размножения может возникнуть физиологическое расстройство — стекловид-ность эксплантов. У одних растений (черешня, облепиха, лещина) в наших опытах она проявлялась уже на 1-м пассаже, у других (робиния, подвой ПЗ) — крайне редко. Коэффициент размножения стекловидных культур был существенно меньше. Ненормальная структура листьев и побегов может быть следствием потери транспортной полярности ауксина, что, в свою очередь, может быть обусловлено интенсивным синтезом эксплантами этилена. Стекловидные культуры груши выделяли в 6 раз больше этилена, чем нормальные (0,9 нл/ч).
Большинство авторов ставили перед собой задачу получить максимальный коэффициент размножения на каждом пассаже. Это было оправдано, когда в качестве сосудов для размножения использовали пробирки. В настоящее время более удобными для работы следует признать колбы и банки объемом 100-200 мл.
Эффективность размножения при этом определяется не коэффициентом размножения единичного экспланта, а количеством боковых побегов, образо-
вавшихся в сосуде. Общий выход боковых побегов у земляники не зависел от количества эксплантов в сосуде.
Однако качество побегов было лучше на средах с небольшим содержанием 6 БАП (табл. 8).
Таблица 8
Влияние плотности посадки конгломератов и концентрации 6 БАП на пролиферацию побегов и их качество (среда М.С., сорт Редгонтлит, 2001 г.)
Концентрация 6 БАП, мг/л Количество Количество боковых побегов шт. Стекловид-ность, %
конгломератов в сосуде, шт. всего побегов >0,5 см побегов <0,5 см конгломератов с корнями, %
1,0 0,3
2 120 44 76
4 112 84 28
Fc|}<Ft FC£>FT F($»FT
5,6 5,3
F4»Ft
25
0,3
Заключение
Эффективность 2-го этапа микрокло-нального размножения садовых растений зависит от условий, обеспечивающих получение конгломератов, развивших 10-15 побегов перед укоренением. Побеги длиной более 2,5 см необходимо использовать для дальнейшего размножения, длиной меньше 1,5 см — пересаживать на среду с пониженным содержанием 6 БАП, а побеги 1,5-2,5 см — использовать для укоренения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Gordon J. // Intergration of activity in the higher plant, 1977. P. 251-273. — 2. Dijck R. // Plant Physiology, 1988. V. 86. № 3. P. 836-840. — 3. Marino G. II Acta Horticult, 1986. V. 179. P. 871 — 872. — 4. Schuyler Suley. // Hort. Sci., 1990. V. 25. № 11. P. 1303-1365.
SUMMARY
The analysis of the second stage of microclonal propagation was carried out. The dependence between its effectiveness and nitrogen content and correlation between ammonium and nitrate forms was shown. The factors increasing the number of large shoots were revealed.
Ill
