CC BY
28
УДК612.014:576.3
ОСОБЕННОСТИ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК В ЗАВИСИМОСТИ ОТ РАЙОНА ПРОЖИВАНИЯ ЧЕЛОВЕКА
© 2010 г. В. П. Патракеева
Институт физиологии природных адаптаций УрО РАН, г. Архангельск
Комплекс природных условий, влияющих на организм человека на Севере, играет значительную роль в процессах пролиферации клеток. Одним из факторов, влияющих на активность деления клеток, является ионизирующее излучение [1, 5]. Однако известно, что в малых дозах радиация может увеличивать продолжительность жизни и плодовитость животных, стимулируя пролиферативную активность различных типов клеток in vitro. Частые магнитные возмущения, как и общее охлаждение, резко снижают уровень митотической активности и тормозят процессы пролиферации Т-лимфоцитов. Резко выраженная фотопериодичность, характерная для данного региона, вносит значительный вклад в активизацию пролиферативных процессов. Так, в период полярной ночи и полярных сумерек снижается содержание молодых форм лимфоцитов (CD10+), активированных клеток (CD25+, CD71 + , HLADR+), в то время как в период полярного дня отмечается активизация пролиферации в системе моноцитов с увеличением содержания IL-1 и промоноцитов, следствием чего является повышение секреции IL-2, клеток с рецептором к IL-2 и пролиферативных процессов. У практически здорового населения Архангельской области наблюдается высокое содержание маркеров лимфопролиферации CD10+, CD71+ [2]. Установлено, что скорость пролиферации Т-клеток регулируется комплексом IL-2 и IL-15, где IL-15 играет большую роль и применяется для наивных T-клеток, включая те, которые не подвергаются IL-7-управляемой гомеостатической пролиферации [15]. Скорость пролиферации наивных T-клеток зависит от концентрации вовлечённых цитокинов. При аутоиммунных заболеваниях основой для активации Т-клеток является про-теинкиназа С; в in vitro-экспериментах доказано, что только добавление IL-2 индуцирует пролиферацию [16]. В исследовании показано [19], что длинная изоформа клеточного FLIP (эндогенный ингибитор каспаз c-FLIPL) Т-клеток подавляет нормальную NF-кВ-активность, стимулированную TCR, что свидетельствует о важнейшей его роли в пролиферации T-лимфоцитов через NF-кВ-зависимый путь.
Представляет интерес изучение содержания в крови альфа-фетопротеина (АФП). Его роль в организме разнообразна. В организме взрослых людей, не имеющих онкологических заболеваний, фоновые значения АФП отражают репаративные процессы [3]. Считается, что основной функцией АФП является иммуносупрессия [4]. Кроме того, АФП, играя в организме роль транспортного белка, способен образовывать нековалентные комплексы с полиненасыщенными жирными кислотами, билирубином, лектинами, стероидными гормонами и лекарственными препаратами, обеспечивая их транспорт через мембраны [3, 9]. Предполагается взаимодействие АФП с факторами роста, в результате чего происходит пролиферация или дифференцировка клеток.
В работе проведено исследование иммунного статуса и пролиферативной активности клеток у жителей Ненецкого автономного округа и г. Архангельска. Установлено, что жителям заполярного региона характерны более высокие уровни пролиферативной активности по уровню содержания маркера CD10+. Особенностью иммунного статуса их является дефицит функционально активных Т-клеток, Т-хелперов на фоне повышенных уровней провос-палительного цитокина К-6, ^N-7 и альфа-фетопротеина.
Ключевые слова: пролиферация, альфа-фетопротеин, лимфоцит, моноцит, нейтрофильный гранулоцит, цитокины.
Методы
Обследованы 30 практически здоровых жителей г. Архангельска и 100 жителей Ненецкого автономного округа (НАО). Иммунологические методы исследования включали определение содержания в периферической крови лимфоцитов фенотипов CD3+, CD4+, CD5+, CD8+, CD10+, CD16+, CD25+, CD71+, CD95+, HLADR+ с помощью непрямой иммунопероксидазной реакции с использованием препаратов лимфоцитов типа «высушенной капли» (реактивы НПЦ «Мед-БиоСпектр», г. Москва). Определяли нейтрограмму, моноцитограмму (по методу О. Н. Григоровой, 1958), лимфоцитограмму (по методу И. А. Кассирского, Г. А. Алексеева, 1970). Содержание цитокинов (IL-6, IFN-y, IL-10) определяли на иммуноферментном анализаторе «Evolis» фирмы «Bio-RAD» тест-наборами «Вектор БЕСТ» (Россия). Содержание IgE определяли тест-набором «Biosource» (Германия), альфа-фетопротеин — тест-набором «CanAg Diagnostics» методом иммуноферментного анализа. Учет результатов проводили на спектрофотометре серии Multiscan MS (Финляндия). Пролиферация оценивалась по содержанию лимфоцитов фенотипов CD10+, больших лимфоцитов (лимфобластов) в составе лимфоцито-граммы, промоноцитов в структуре моноцитограммы. Результаты исследования обработаны с использованием пакета прикладных программ SPSS 11.5 (США). Тип исследования ретроспективный, выборки случайные, одномоментные. Проведено определение границ нормального распределения количественных показателей при помощи критерия Шапиро — Уилка. Достоверность различий между группами оценивали с помощью параметрического t-критерия Стьюдента для независимых выборок и непараметрического критерия Уилкоксона. Корреляционный анализ параметров проведен с учетом ранговой корреляции Спирмена с определением коэффициента корреляции (r) и оценки его достоверности. Статистическая достоверность присваивалась при значении p < 0,05 [5].
Результаты
У жителей Заполярья выше среднее содержание альфа-фетопротеина (4,01 ± 0,34) МЕ/мл по сравнению с таковым у жителей Приморского района Архангельской области (3,64 ± 0,89) МЕ/мл, p < 0,05. Аномально высокие концентрации фетального антигена выявлены в 27 % случаев у жителей Заполярья и в 10 % — среди проживающих в Приморском районе. Пролиферативная активность клеток крови у жителей Заполярья отличается более высоким уровнем содержания палочкоядерных нейтрофильных лейкоцитов (0,43 ± 0,03) и (0,21 ± 0,03)х109 кл/л на фоне менее значимых концентраций сегментоядерных нейтрофилов, соответственно (2,95 ± 0,12) и (3,67 ± 0,26)х 109 кл/л. В структуре нейтрограммы (рис. 1) статистически значимые различия выявлены относительно содержания 4- и 5-сегментоядерных клеток. Отсутствие различий в уровне содержания 2-и 3-сегментоядерных клеток свидетельствует, на наш
взгляд, об отсутствии различий в уровне созревания (дифференцировки) нейтрофилов.
Содержание клеток,
х109кл/л 1 8 -|----------------------------------------
2 сегмента 3 сегмента 4 сегмента 5 и более
сегментов
Рис. 1. Структура нейтрограммы у жителей НАО и г. Архангельска.
Примечания: Ш — жители г. Архангельска; □ — жители НАО; ** - р < 0,01.
Второй особенностью пролиферативных процессов клеток крови у жителей Заполярья является более значительное содержание моноцитов. Среднее содержание моноцитов в периферической крови у проживающих в условиях Крайнего Севера составляет (0,55 ± 0,14), у жителей Приморского района Архангельской области — (0,21 ± 0,03)х 109 кл/л. Моноцитоз регистрировали у 33,24 % жителей Заполярья и 3,34 % лиц, проживающих в дискомфортной зоне. Различия в структуре моноцитограммы свидетельствуют о более выраженной активизации процессов пролиферации моноцитов, а также их диффе-ренцировки и апоптоза (рис. 2).
Содержание клеток,
Промоноциты Моноциты Полиморфноядерные
моноциты
Рис. 2. Структура моноцитограммы у жителей НАО и г. Архангельска
Примечания: □ — жители г. Архангельска; □ — жители НАО; * - р < 0,05, *** - р < 0,01.
Содержание лимфоцитов периферической крови в обеих обследованных группах одинаковое и составило для жителей г. Архангельска (2,58 ± 0,16), для жителей НАО — (2,33 ± 0,08)х 109 кл/л. В структуре лим-фоцитограммы городских жителей отмечается более высокое содержание больших (0,54 ± 0,05)х 109кл/л и малых (1,08 ± 0,11)х109кл/л лимфоцитов.
Особенностями иммунной защиты жителей НАО является низкое содержание функционально активных Т-клеток CD3+ и Т-хелперов CD4+. Не установлено статистически значимых различий в содержании активированных (CD25+, CD71+, HLADR+), цитотоксиче-ских (CD8+) клеток и натуральных киллеров. Иммунный статус жителей г. Архангельска характеризуется более высоким уровнем клеток с маркером пролиферации (CD10+). Практически пропорционально росту количества клеток CD10+ возрастает уровень клеток, меченных к апоптозу (CD95+) (рис. 3).
Содержание фенотипов лимфоцитов, х 10 кл/л
Рис. 3. Содержание фенотипов лимфоцитов в периферической крови у жителей НАО и г. Архангельска
Примечания: Ш — жители г. Архангельска; □ — жители НАО; * - р < 0,05, ** - р < 0,01; *** - р < 0,001.
При изучении цитокинового профиля обращает на себя внимание более высокое содержание провос-палительных цитокинов 1Ь-6 и №N-7 в группе обследованных жителей НАО; концентрации противовоспалительного цитокина 1Ь-10 в обеих группах были практически одинаковыми (рис. 4).
Содержание цитокинов, пг/мл
18 1--------------------------------------------------
14
6 4 2 0
1Ь-6 1Ь-10 Ш^атта
Рис. 4. Содержание цитокинов в периферической крови у жителей НАО и г. Архангельска
Примечания: Ш — жители г. Архангельска; □ — жители НАО; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001.
Обсуждение результатов
У жителей дискомфортной и абсолютно дискомфортной зон Европейского Севера Российской Федерации регистрируются повышенные уровни содержания в крови АФП (соответственно 10 и 27 %); в средних результатах концентрации данного белка у жителей абсолютно дискомфортной зоны проживания статистически значимо выше.
Альфа-фетопротеин является гликопротеином с молекулярной массой около 70 кЭ. Его молекула состоит преимущественно из белка и содержит 4,5 % углеводных остатков. Альфа-фетопротеин относится к группе фетальных антигенов и является структурным аналогом альбумина. Биологический период полужизни — до 6 дней. Вырабатывается желточным мешком и печенью плода. Его концентрация в фетальной плазме очень велика в первом триместре
— достигает 3 г/л, а затем постепенно снижается по мере приближения к родам до 80 мг/л. Снижение уровня АФП продолжается и после рождения ребен-
ка и к его двухлетнему возрасту достигает концентрации 10 мкг/л, или 5 МЕ/мл, типичной для здоровых взрослых людей. В материнской сыворотке уровень АФП, напротив, повышается в течение беременности и достигает максимума за 1—2 месяца до родов
— 400 мкг/л. На ранних стадиях развития плода АФП выполняет транспортные функции и является митоге-ном. У взрослых людей функция его неизвестна. Как и все фетальные антигены, АТФ появляется на поверхности дифференцирующихся клеток, являясь по сути дифференцировочным антигеном. Поэтому можно бы было считать, что повышение его содержания отражает активизацию клеточно-пролиферативной активности. Ассоциированная с АФП пролиферация касается нейтрофильных гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов. Пролиферация нейтрофилов, выявляющаяся повышением содержания в периферической крови палочкоядерных нейтрофилов, не касается диффе-ренцировки и апоптоза нейтрофильных лейкоцитов. Стимуляция пролиферативной активности моноцитов более выражена и касается этапов дифференци-ровки. Регуляторные механизмы уравновешивания пролиферации и апоптоза при этом не нарушены. Пролиферативная реакция лимфоцитов у жителей Заполярья ограничена повышением циркулирующих в крови CD10+ без увеличения концентраций активированных и дифференцированных форм фенотипов лимфоцитов за исключением CD23+ с рецептором для Fc ^Е. Напротив, регистрируется заметное снижение общего содержания зрелых Т-лимфоцитов (CD3+) и Т-хелперов (CD4+).
Действительно, во взаимодействии АФП с имму-нокомпетентными клетками более известны его супрессивные свойства. Альфа-фетопротеин подавляет экспрессию молекул Главного комплекса гистосовместимости класса II на макрофагах, препятствуя, таким образом, презентации антигенов и снижая активность иммунного ответа [11]. В зависимости от условий эксперимента АФП может повышать или снижать продукцию простагладинов Е2 в макрофагах [6]. Следствием стимулирующего влияния АФП на продукцию моноцитами простагландинов является то, что он значительно супрессирует синтез TNF-a (на 58 %) и 1Ь-1р (на 67 %) активированными моноцитами [18]. Альфа-фетопротеин подавляет пролиферативный ответ лимфоцитов на митоген [8]. В высоких дозах, сопоставимых с концентрациями в фетальной крови, он подавляет пролиферацию лимфоцитов в культурах, стимулированных конканавалином А и фитогемаг-глютинином [10].
Иммуносупрессивное влияние данного белка подтверждается его способностью повышать содержание специфических Т-супрессоров [12, 17], подавлять выработку антител, созревание цитотоксических лимфоцитов, активность естественных киллеров, фагоцитарную способность макрофагов [7, 13]. Создается такое впечатление, что альфа-фетопротеин, способствуя пролиферации и дифференцировке клеток, сни-
жает чувствительность и агрессивность иммуноком-петентных клеток к дифференцировочным антигенам, которые экспрессируются на клеточной мембране. Такой своеобразный механизм толерантности, вероятно, необходим в периоды активной пролиферации и дифференцировки. Правомочность этого мнения подтверждается ещё и тем, что альфа-фетопротеин не подавляет активность зрелых Т- и В-лимфоцитов, в том числе и зрелых Т-хелперов [14].
Список литературы
1. Гжегоцкий М. Р. Влияние малых доз радиации на параметры системы кислородного метаболизма у экспериментальных животных / М. Р. Гжегоцкий, У. В. Конных, Л. П. Козак // Механизмы функционирования висцеральных систем. — 2001. — С. 78.
2. Добродеева Л. К. Иммунологическая реактивность, состояние здоровья населения Архангельской области / Л. К. Добродеева, Л. П. Жилина. — Екатеринбург : УрО РАН, 2004. - 229 с.
3. Черешнев В. А. Альфа-фетопротеин / В. А. Череш-нев, С. Ю. Родионов, В. А. Черкасов и др. — Екатеринбург : УрО РАН, 2004. — 376 с.
4. Шмагель К. В. Альфа-фетопротеин: строение, функции и роль в эмбриогенезе / К. В. Шмагель, В. А. Черешнев // Акушерство и гинекология. — 2002. — № 5. — С. 6—8.
5. Шубик В. М. Ядерные взрывы на Новой Земле / В. М. Шубик. — СПб., 1998. — 138 с.
6. Aussel C. Effect of alpha-fetoprotein and indomethacin on arachidonic acid metabolism in P388D1 macrophages: role of leukotrienes / C. Aussel, M. Fehlmann // Prostaglandins Leukot Med. — 1987. — Vol. 28, N 3. — P. 325—336.
7. Cardoso E. Effect of human AFP on native and in vitro stimulated NK-activity / E. Cardoso, G. Valdez, E. Comini // J. Clin. Lab. Immunol. — 1991. — Vol. 34, N 4. — P 183—188.
8. Czokalo M. Culture conditions modify the effects exerted by human fetal AFP on some lymphocyte functions in vitro / M. Czokalo, L. Wishnewski // Exp. Pathol. — 1981. — Vol. 20, N 4. — P. 233—238.
9. Filella X. Influence of AFP, CEA and PSA on the in vitro production of cytokines / X. Filella, R. Molina, J. Alcover // Tumour Biol. — 2001. — Vol. 22, N 2. — P. 67—71.
10. Hooper D. C. Selective inhibition of murine T-cell proliferation and limphokine-activated natural killer cell function by AFP / D. C. Hooper, B. L. Cohen, D. Ducas // Biological activities of alpha-fetoprotein. — 1987. — Vol. 1. — P. 153—167.
11. Lu C. Y. Alpha-fetoprotein inhibits macrophage expression of Ia antigens / C. Y. Lu, P. S. Changelian, E. R. Unanue // Journal of immunology. — 1984. — Vol. 132, N 4. — P. 1722—1777.
12. Murgita R. A. Alpha-fetoprotein induces suppressor T-cells in vitro / R. A. Murgita, E. A. Goidl, S. Kontianen, H. Wigzell // Nature. — 1977. — Vol. 267, N 5608. — P. 257—259.
13. Olinescu A. The effect of alpha-fetoprotein on the immune response. III. Diminution of the phagocytic capacity of macrophages cultures in vitro in the presence of mouse amniotic fluid or alpha-fetorprotein / A. Olinescu, M. Laky,
D. E. Pofescu // Arch. Roum. Pathol. Exp. Microbiol. — 1977.
— Vol. 36, N 3—4. — P. 247—253.
14. Peck A. B. Cellular and genetic restrictions in the immunoregulatory activiti of AFP. II. AFP-induced suppression of cytotoxic T-lymphocyte development / A. B. Peck, R. A. Murgita, H. Wigzell // J. Exp. Med. — 1978. — Vol. 148, N 2. — P. 360—372.
15. Ramsey Ch. The Lymphopenic environment of CD132 (common -chain) - deficient hosts elicits rapid homeostatic proliferation of naive T cells via IL-15 / Ch. Ramsey, M. P. Rubinstein, D. M. Kim, et al. // The Journal of Immunology. — 2008. — N 180. — Р. 5320—5326.
16. Sakowicz-Burkiewicz M. Protein kinase C- critically regulates the proliferation and survival of pathogen-specific T cells in murine listeriosis / M. Sakowicz-Burkiewicz, G. Nishanth, U. Helmuth, et al. // The Journal of Immunology.
— 2008. — N 180. — Р. 5601—5612.
17. Toder V. Immunoregulatory mechanisms in pregnancy. 1 Evidence for the alpha-fetoprotein induced generation of suppressor cells in vitro / V Toder, M. Blank, L. Nebel // Transplantation. — 1982. — Vol. 33, N 1. — P. 41—44.
18. Wang W. Downregulation of forbol 12-myristate 13-acetate-induced TNFalpha and IL-1-beta production and gene expression in human monocytic cells by human alpha-fetoprotein / W Wang, E. Alpert // Hepatology. — 1995. — Vol. 22, N 3. — P. 921—928.
19. Zhang N. The long Isoform of cellular FLIP is essential for T-lymphocyte proliferation through an NF- B-independent pathway / N. Zhang, K. Hopkins, Y.-W He // The Journal of Immunology. — 2008. — N 180. — Р. 5506—551 1.
FEATURES OF CELL PROLIFERATIVE ACTIVITY DEPENDING ON HUMAN HABITATION REGIONS
V. P. Patrakeeva
Institute of Environmental Physiology, Ural Branch RAS, Arkhangelsk
In the article, a study of the immune status and cell proliferative activity in inhabitants of the Nenets autonomous area (NAA) and the City of Arkhangelsk has been described. It has been established that inhabitants of the Polar region were described by higher proliferative activity according to the content of CD10+ marker. The feature of the immune status was deficiency of functionally active Т-cells, Т-helpers against high levels of proinflammatory cytokine IL-6, IFN-y and alpha-fetoprotein.
Key words: proliferation, alpha-fetoprotein, lymphocyte, monocyte, neutrophilic granulocyte, cytokines.
Контактная информация:
Патракеева Вероника Павловна — старший научный сотрудник лаборатории регуляторных механизмов иммунитета Института физиологии природных адаптаций Уральского отделения РАН
Адрес: 163000, г. Архангельск, пр. Ломоносова, д. 249
Тел. (8182) 28-62-65
Статья поступила 24.05.2010 г.
