CC BY
10
DOI: 10.23868/202107006
ОСОБЕННОСТИ ПРОДУКЦИИ ЦИТОКИНОВ В ОПУХОЛИ, СВЯЗАННЫХ С МЕТАСТАЗИРОВАНИЕМ И НАЛИЧИЕМ БАЗАЛЬНОКЛЕТОЧНОЙ ГИПЕРПЛАЗИИ БРОНХИАЛЬНОГО ЭПИТЕЛИЯ, ПРИ НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНОМ РАКЕ ЛЕГКОГО
Поступила: 05022021 Принята к печати: 07.06.2021 Опубликована on-line: 10.06.2021
Д.С. Письменный1, 2, А.А. Дурова2, Н.В. Крахмаль2, И.В. Степанов1, 2, Е.О. Родионов1, В.А. Ерёмин2, Е.С. Андрюхова1, О.Е. Савельева1, М.В. Завьялова1, 2, О.В. Панкова1, Л.А. Таширева1, С.В. Вторушин1, 2,
C.В. Миллер1, С.А. Тузиков1, 2, В.М. Перельмутер1
1 Научно-исследовательский институт онкологии Томского национального медицинского исследовательского центра РАН, Томск, Россия
2 Сибирский государственный медицинский университет, Томск, Россия
FEATURES OF CYTOKINE PRODUCTION IN TUMOR ASSOCIATED WITH METASTASIS AND BASAL CELL HYPERPLASIA OF BRONCHIAL EPITHELIUM IN NON-SMALL CELL LUNG CANCER
D.S Pismenny1, 2, A.A. Durova2, N.V. Krahmal'2, I.V. Stepanov1, 2, E.O. Rodionov1, V.A. Eryomin2, E.S. Andryuhova1, O.E. Savelieva1, M.V. Zavyalova1, 2, O.V. Pankova1, L.A. Tashireva1, S.V. Vtorushin1, 2, S.V. Miller1, S.A. Tuzikov1, V.M. Perelmuter1
1 Cancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center of the RAS, Tomsk, Russia
2 Siberian State Medical University, Tomsk, Russia
e-mail: [email protected]
Возникновение и прогрессия опухоли (рецидивирование, ме-тастазирование), во многом, связаны с наличием и характером воспалительных процессов. Перспективным является уточнение патогенетической роли и прогностической ценности продукции ци-токинов, участвующих в воспалении. Развитие базальноклеточной гиперплазии эпителия в смежных с опухолью бронхах может быть ассоциировано с воспалением в микроокружении опухоли.
Цель исследования: изучить продукцию цитокинов в опухоли при немелкоклеточном раке легкого, ассоциированных с воспалением и гематогенным метастазированием, с учетом морфологических изменений эпителия в бронхах, смежных с опухолью.
Группу исследования составили 35 пациентов с немелко-клеточным раком легкого (T1-3N0-2M0). В 17 случаях проводили неоадъювантную химиотерапию. Для изучения продукции цитокинов TGF-p, TNF-a, SDF-1, VEGFA в клетках опухоли и альвеолярных макрофагах применяли иммуногистохимический метод анализа. Базальноклеточная гиперплазия морфологически была диагностирована в мелких бронхах, расположенных на удалении 3-4 см от первичной опухоли.
Отсутствие синтеза SDF-1 в ядрах опухолевых клеток было ассоциировано с развитием гематогенных метастазов при наличии базальноклеточной гиперплазии в смежных с опухолью бронхах. Развитие базальноклеточной гиперплазии коррелировало с увеличением случаев обнаружения продукции TGF-p альвеолярными макрофагами и уменьшением случаев выявления SDF-1 в цитоплазме клеток опухоли. У пациентов с гематогенными метастазами, получавших неоадъювантную химиотерапию, была снижена частота случаев обнаружения TNF-a в альвеолярных макрофагах.
На основании полученных данных можно заключить, что при возникновении базальноклеточной гиперплазии продукция цитокинов клетками опухоли и лейкоцитами была ассоциирована с появлением гематогенных метастазов. Базальноклеточная гиперплазия была также связана с наличием или отсутствием провоспалительных цитокинов в опухоли. Эффекты неоадъю-вантной химиотерапии проявлялись у пациентов с гематогенными метастазами с меньшей частотой случаев выявления TNF-a в альвеолярных макрофагах.
Ключевые слова: немелкоклеточный рак легкого, гематогенное метастазирование, базальноклеточная гиперплазия, цитокины.
The emergence and progression of a tumor (relapses, metastasis) is largely due to the presence and nature of inflammatory processes. It is promising to clarify the pathogenetic role and prognostic value of cytokines involved in the inflammation. The basal cell hyperplasia in the bronchial epithelium adjacent to the tumor may be associated with inflammation in the tumor microenvironment.
Objective: to study the production of inflammatory cytokines in the tumor, taking into account basal cell hyperplasia in the bronchial epithelium adjacent to the tumor in the patients with non-small cell lung cancer.
35 patients with non-small cell lung cancer (T1-3N0-2M0) were included in the study. Neoadjuvant chemotherapy was administered in 17 cases. The production of TGF-p, TNF-a, SDF-1, VEGFA was determined by immunohistochemistry in tumor cells and alveolar macrophages. Basal cell hyperplasia in the bronchi adjacent to the tumor was morphologically diagnosed.
The absence of SDF-1 in the nuclei of tumor cells was associated with the hematogenous metastases in patients with BCH of the bronchi adjacent to the tumor. Basal cell hyperplasia is correlated with an increased TGF-p production in alveolar macrophages and a decreased of SDF-1 in the cytoplasm of tumor cells. The frequency of case TNF-a in alveolar macrophages is reduced in patients with hematogenous metastases who received neoadjuvant chemotherapy.
Cytokine production in the tumor cells and leukocytes was associated with the hematogenous metastases, taking into account the basal cell hyperplasia, which is associated with the pro-inflammatory cytokines in the tumor. The effects of neoadjuvant chemotherapy differ depending hematogenous metastasis.
Keywords: non-small cell lung cancer, hematogenous metastasis, basal cell hyperplasia, cytokines.
Введение
Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) устойчиво занимает одну из ведущих позиций в структуре онкологической заболеваемости в Российской Федерации. По статистическим данным, опубликованным в 2018 г.,
у мужчин рак легкого — это наиболее часто встречающаяся злокачественная опухоль, у женщин рак легкого занимает 10 место среди онкологической патологии [1]. В клинической практике чаще обнаруживается НМРЛ, включающий плоскоклеточный рак, аденокарциному
и крупноклеточную карциному [2]. Смертность от рака легкого нередко связана с развитием гематогенной диссеминации опухолевого процесса. В связи с этим актуальным является поиск маркеров биомолекул, вовлеченных в механизмы гематогенного метастазиро-вания при НМРЛ. Анализ литературных данных позволил определить, что в качестве потенциально значимых маркеров в настоящее время могут быть рассмотрены трансформирующий фактор роста р (ТОР-р), фактор некроза опухоли альфа (ТЫР-а), стромальный фактор роста-1 (БОР-1) и сосудистый эндотелиальный фактор роста (УБОР-Д), ассоциированные с хроническим воспалительным процессом [3].
Продукция ТОР-р, который является важным триггером эпителиально-мезенхимального перехода, обнаруживается в клетках опухоли и опухолевого микроокружения при НМРЛ. В литературе представлены данные о взаимосвязи между продукцией ТОР-р, процессами прогрессирования опухоли и развитием резистентности к цитостатической и таргетной терапии [4, 5].
Роль ТЫР-а, регулируемого активированным сигнальным путем ЫР-кВ, двояка. С одной стороны, он представляет собой провоспалительный цитокин, вовлеченный в процессы противоопухолевого иммунного ответа и индукцию апоптоза опухолевых клеток [6, 7]. С другой стороны, ТЫР-а задействован в механизмах прогрессирования и увеличения размеров новообразования. Один из механизмов прогрессирования связан с блокировкой рецептора фактора некроза опухоли альфа 1 типа (ТЫРП1), который рассматривают как потенциальный механизм, используемый опухолевыми клетками при немелкоклеточном раке для предотвращения инициируемого ТЫР-а апоптоза [8].
БОР-1 — хемокин, который в комплексе со своим специфическим хемокиновым рецептором 4 (СХСП4) играет значимую роль в процессах передачи клеточных сигналов, а также механизмах миграции опухолевых и воспалительных клеток, активации эффекторного звена иммунного ответа и стимуляции неоангиогенеза [9]. Показана тесная взаимосвязь СХСИ2/СХСП4 сигнальной оси с процессами метастазирования при НМРЛ [10].
УБОР-Д регулирует ангиогенез — ключевой процесс развития и функционирования тканей, как в нормальных, так и в патологических условиях [11, 12]. Передача сигналов через рецепторы УБОР в клетках опухоли способствует прогрессированию, рецидивированию и метастазированию опухоли [3, 13].
Длительное развитие хронического воспаления в бронхах индуцирует пролиферацию клеток бронхиального эпителия, приводящую к базальноклеточной гиперплазии (БКГ) [14]. БКГ чаще всего наблюдается в бронхах крупного и среднего калибра [15-17], характеризуется увеличением числа рядов базальных клеток (от трех и более) со скудной цитоплазмой и мелкими, преимущественно, округлыми ядрами. Клетки реснитчатого эпителия обычно сохраняются. Как правило, БКГ — процесс обратимый [18]. Однако на ее фоне может развиться плоскоклеточная метаплазия (ПМ) и дисплазия [19]. БКГ и ПМ — более ранние изменения бронхиального эпителия, возникающие еще до развития дисплазии. Уже при этих начальных морфологических изменениях бронхиального эпителия возникают различные генетические нарушения, выраженность которых возрастает по мере нарастания степени тяжести морфологических изменений [2]. В исследовании О.В. Панковой с соавт. (2016) было обнаружено, что различные варианты морфологических изменений в мелких бронхах, смежных с опухолью, сопряжены с разными формами прогрессии НМРЛ [20]. Авторы высказали предположение, что этот феномен
обусловлен ассоциацией эпителиально-стромальных отношений в мелких бронхах в условиях длительно существующего хронического воспаления с паренхиматозно-стромальными изменениями в ткани первичной опухоли, от которых существенным образом зависит вероятность метастазирования. Сочетание БКГ и ПМ сопряжено с риском развития рецидивов НМЛР [20]. Наличие изолированной БКГ в мелких бронхах, смежных с опухолью, независимо от гистологического типа НМРЛ и проведения неоадъювантной химиотерапии (НАХТ), является предиктором развития гематогенных метастазов [21].
Однако в доступной литературе практически нет сведений о связи продукции цитокинов клетками НМРЛ, имеющих отношение к воспалению и ассоциированных с риском гематогенного метастазирования, с реактивными изменениями респираторного эпителия в мелких бронхах у пациентов, страдающих раком легкого. Недостаточно изучены и эффекты НАХТ на продукцию цитокинов.
Таким образом, исследование продукции цитокинов, связанных с воспалением, клетками опухоли, а также клетками воспалительного инфильтрата как компонента опухолевого микроокружения, позволит выяснить, с одной стороны, наличие связи характеристик опухолевого микроокружения с развитием БКГ в мелких бронхах, смежных с опухолью, а с другой — может способствовать формированию диагностического алгоритма для оценки риска развития гематогенного метастазирования у больных НМРЛ.
Цель исследования: изучить при НМРЛ особенности продукции в ткани опухоли цитокинов, ассоциированных с воспалительным процессом, с гематогенным мета-стазированием с учетом морфологических изменений эпителия в бронхах, смежных с опухолью.
Материал и методы
Дизайн исследования
В исследование были включены 35 пациентов с НМРЛ: мужчины — 31 (89%), женщины — 4 (11%), средний возраст пациентов — 67,8 ± 7,3 лет (от 53 до 87 лет), которым проводили оперативное лечение на базе торакоабдо-минального отделения НИИ онкологии Томского НИМЦ РАН в 2008-2017 гг. Оперативное вмешательство выполнялось в объеме лобэктомии или пульмонэктомии. Стадия заболевания на момент постановки диагноза определялась согласно международной классификации по системе ТЫМ и соответствовала Т1-31\10-2М0. В 18 случаях (51%) НАХТ пациентам не проводили. В 17 случаях (49%) в предоперационном периоде было проведено 2-3 курса химиотерапии по схеме: паклитаксел 175 мг/ м2 в/в + карбоплатин ДЫС 6 в/в на каждый курс. Интервал между курсами химиотерапии составлял 3 недели.
Исследование было выполнено ретроспективно. Морфологический анализ ткани первичной опухоли легкого и стенки мелких бронхов, располагающихся на расстоянии 3-4 см от первичного опухолевого узла, проводили для установления гистологического типа опухоли согласно рекомендациям «Гистологической классификации опухолей легкого» ВОЗ (2015). В исследование были включены только случаи с аденокарциномой и плоскоклеточным раком. Гистотип опухоли в 29 случаях (83%) соответствовал плоскоклеточному раку, в 6 случаях (17%) — аденокарциноме. При распределении случаев в соответствие с критерием Т были получены следующие данные. У 1 больного (3%) опухоль соответствовала критерию Т1, у 3 больных (9%) — критерию Т2, у 15 больных (43%) — критерию Т3, у 1 6 больных (45%) — критерию Т4. У 1 9 пациентов (54%) лимфогенных метастазов
НМРЛ (n=35)
ГМ-БКГ-(n=4)
НАХТ-(n=18)
ГМ-БКГ+ (n=7)
ГМ+ БКГ+ (n=7)
ГМ-БКГ-(n=3)
НАХТ+ (n=17)
ГМ-БКГ+ (n=7)
ГМ+ БКГ+ (n=7)
Рис. 1. Дизайн исследования: НМРЛ — немелкоклеточный рак легких, НАХТ — неоадьювантная химиотерапия, ГМ — гематогенные метастазы, БКГ — базальноклеточная гиперплазия
не было, у 16 (46%) больных диагностировалось метастатическое поражение региональных лимфатических узлов. За период наблюдения гематогенные метастазы были выявлены у 14 пациентов (40%). У 21 больного (60%) гематогенной диссеминации не было.
Диагностику базальноклеточной гиперплазии осуществляли по стандартным критериям [1 9]. Анализировали первичные медицинские документы (амбулаторная карта, медицинская карта стационарного больного). В медицинской документации оценивали информацию по наличию, сроку и локализации гематогенных метастазов. Пациенты были разделены на 6 групп в зависимости от проведения НАХТ, наличия гематогенных метастазов и признаков БКГ в бронхиальном эпителии: группа НАХТ-ГМ-БКГ- — пациенты, которым не проводили НАХТ, у которых не было гематогенных метастазов и БКГ; группа НАХТ-ГМ-БКГ+ — пациенты, которым не проводили НАХТ, у которых не было гематогенных метастазов, но была БКГ; группа НАХТ-ГМ+БКГ+ — пациенты, которым не проводили НАХТ, но у них были гематогенные метастазы и БКГ; группа НАХТ+ГМ-БКГ- — пациенты, которым проводили НАХТ, но у них не было гематогенных метастазов и БКГ; группа НАХТ+ГМ-БКГ+ — пациенты, которым проводили НАХТ, у них не было гематогенных метастазов, но была БКГ; группа НАХТ+ГМ+БКГ+ — пациенты, которым проводили НАХТ, у них были гематогенные метастазы и БКГ (рис. 1).
Критерии включения
Критерии включения пациентов в исследование: аденокарцинома или плоскоклеточный рак легкого; наличие в операционном материале мелких бронхов, расположенных на расстоянии 3-4 см от первичного опухолевого узла; согласие пациента на включение в исследование. Критерии исключения пациентов из исследования: другие гистологические типы рака легкого, наличие гематогенных метастазов на момент включения в исследование, острые или хронические воспалительные процессы.
Этическая экспертиза
Все пациенты подписывали информированное согласие на участие в исследовании. Работа была проведена
согласно принципам добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента РФ от 24.12.1993 № 2288) на основании разрешения локального этического комитета ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России (протокол № 5600 от 23.10.2017).
Иммуногистохимическое исследование
Для морфологического исследования операционного материала (как самой опухоли, так и перитуморальной ткани легкого) ткань фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение 18-24 ч., заливали в парафин и делали срезы по стандартной методике [22]. Иммуногистохимическое исследование осуществляли по стандартной методике [22]: на стекла со срезами наносили первые антитела к TGFp (Clone MCA797T, разведение 1:500, Dako, Дания), TNFa (Clone 52B83, разведение 1:300, Abcam, Великобритания), SDF-1 (Clone EPR1216, разведение 1:200, Abcam, Великобритания), VEGFA (Clone H121, разведение 1:25, Abcam, Великобритания), инкубировали в течение 30 мин., промывали 2 раза в фосфатно-солевом буфере (по 5 мин.), наносили вторые антитела (envision flex/hrp sm802, Dako, Дания), инкубировали в течение 40 мин., промывали в фосфатно-солевом буфере (5 мин.) и наносили на срезы раствор DAB (Diaminobenzidine, Dako, Дания) на 3 мин.. Далее срезы окрашивали гематоксилином и эозином, заключали в витрогель (БиоВитрум, Россия) и оценивали продукцию TGFp, TNFa, SDF-1, VEGFA в ядрах и цитоплазме опухолевых клеток, а также в альвеолярных макрофагах на границе с опухолью на световом микроскопе CarlZeissAxioLab.A1 (Carl zeiss, Германия).
Статистический анализ
Статистический анализ проводили с использованием пакета прикладных программ «StatSoft Statistica 8.0». Проверку нормальности распределения показателей осуществляли с помощью критерия Шапиро-Вилка. Применяли методы описательной статистики. Для оценки различий между группами по частоте встречаемости признака использовали критерий %2 с поправкой Йетса (случаи, в которых ожидаемые частоты были менее 10) и точный критерий Фишера (случаи, в которых
Рис. 2. Опухолевые клетки при плоскоклеточном раке легкого. Иммуногистохимическая реакция с антителами к БйР1 (коричневый цвет, в цитоплазме и ядрах клеток). Докраска гематоксилином и эозином. Ув. х400
Рис. 3. Альвеолярные макрофаги при плоскоклеточном раке легкого. Иммуногистохимическая реакция с антителами к Т1\1Р-а (коричневый цвет). Докраска гематоксилином и эозином. Ув. х400
ожидаемые частоты были менее 5). Обсуждались результаты с достоверностью различий при р<0,05.
Результаты
На первом этапе оценивали связь между продукцией воспалительных цитокинов в опухоли и гематогенным метастазированием в группах пациентов, которым проводили или не проводили НАХТ, без учета наличия или отсутствия БКГ. В группах пациентов, которым не проводили НАХТ, частота случаев выявления в опухолевой ткани SDF-1, TGF-p, TNF-a, VEGFA достоверно не различалась в зависимости от наличия или отсутствия гематогенных метастазов. У больных, получавших НАХТ, в случаях с гематогенной диссеминацией реже обнаруживали продукцию в ядре SDF-1 в ткани новообразования (17%) по сравнению со случаями, когда отдаленных метастазов не было (87%; р=0,01; х2=7,02; рис. 2).
Частота случаев обнаружения TGF-p, TNF-a, VEGFA в опухолевой ткани не различалась во всех исследуемых группах. У больных с гематогенными метастазами продукция TNF-a в альвеолярных макрофагах, располагающихся вблизи опухоли, выявлялась реже у пациентов, которым проводили НАХТ (20%), по сравнению с пациентами, которым НАХТ не проводили (71%; р=0,05; Х2=3,9; рис. 3).
На втором этапе исследования связь продукции в опухоли цитокинов, регулирующих воспалительный процесс, с гематогенным метастазированием и эффектами НАХТ изучали с учетом наличия или отсутствия БКГ. В группе пациентов, не получавших НАХТ, и с отсутствием гематогенных метастазов, было установлено, что продукция SDF-1 в цитоплазме опухолевых клеток при наличии БКГ обнаруживалась реже (14%) по сравнению с пациентами, у которых БКГ отсутствовала (75%; p=0,04; х2=4,1).
Исследование продукции хемокина SDF-1 в ядрах опухолевых клеток показало, что в группе больных,
не получавших НАХТ, с БКГ и наличием гематогенных метастазов (НАХТ-ГМ+БКГ+) частота случав выявления в ядре данного маркера встречалась реже (14%) по сравнению с пациентами, у которых БКГ и гематогенных метастазов не было (НАХТ-ГМ-БКГ-) (100%; p=0,01; х2=7,54).
На третьем этапе исследования изучали особенности продукции цитокинов в группах, различающихся не только наличием или отсутствием гематогенных метастазов, но и БКГ, чтобы узнать, связана ли эта продукция с метастазированием или с БКГ. При сравнении продукции цитокинов в группах пациентов, не получавших НАХТ, но с БКГ, различающихся только наличием или отсутствием гематогенных метастазов, было показано, что частота случаев выявления SDF-1 в ядрах опухолевых клеток встречается реже у больных с гематогенной диссеминацией (14%) по сравнению с пациентами, у которых отдаленных метастазов не было (71%; p=0,03; х2=4,66).
При изучении продукции SDF-1 в ядрах опухолевых клеток в группе пациентов, получавших НАХТ, было установлено, что у больных с наличием гематогенных метастазов и БКГ (НАХТ+ГМ+БКГ+) продукция SDF-1 определялась реже (1 4%) по сравнению с пациентами с отсутствием гематогенных метастазов и БКГ (НАХТ+ГМ-БКГ-) (100%; p=0,03; х2=6,43).
При сравнении частоты случаев обнаружения SDF-1 в группах пациентов c НАХТ, различающихся по наличию или отсутствию гематогенных метастазов, но сходных по наличию БКГ, было показано, что у пациентов с гематогенной диссеминацией (БКГ+ГМ+НАХТ+) продукцию SDF-1 в цитоплазме опухолевых клеток выявляли чаще (86%), чем у пациентов без отдаленных метастазов (29%; p=0,05; х2=4,67). Хемокин SDF-1 в ядрах клеток опухоли, наоборот, выявляли реже у больных с гематогенной диссеминацией (1 4%), по сравнению с больными без отдаленных метастазов (71%; p=0,05; х2=4,67) (табл. 1).
Таблица 1. Особенности продукции 813Р-1 в клетках опухоли в исследуемых группах больных при немелкоклеточном раке легкого
Группы больных (количество больных: абс. число и %)
Локализация цитокина Продукция НАХТ-ГМ-БКГ-(п=4) НАХТ-ГМ-БКГ+ (п=7) НАХТ-ГМ+ БКГ+ (п=7) НАХТ+ ГМ-БКГ-(п=3) НАХТ+ ГМ-БКГ+ (п=7) НАХТ+ ГМ+ БКГ+ (п=7)
Цитоплазма есть 3/4 (75%) 1/7 (14%) р1 2=0,04 Х2=4,1 3/7 (43%) р1_з>0,05 р2_3>0,05 2/3 (67%) р4-5>0,05 2/7 (29%) 6/7 (86%) р5-6=0,05 Х2=4,67; р4-6>0,05
нет 1/4 (25%) 6/7 (86%) 4/7 (67%) 1/3 (33%) 5/7 (71%) 1/7 (14%)
Ядро есть 4/4 (100%) р1-2>0,05 5/7 (71%) 1/7 (14%) р1-3=0,01 Х2=7,54; р2_3=0,03 Х2=4,66 3/3 (100%) р4-5>0,05 5/7 (71%) 1/7 (14%) р5-6=0,05 Х2=4,67; р4-6=0,03 Х-=6,43
нет 0/4 (0%) 2/7 (29%) 6/7 (86%) 0/3 (0%) 2/7 (29%) 6/7 (86%)
Примечание: НАХТ — неоадьювантная химиотерапия, ГМ — гематогенное метастазирование, БКГ — базальноклеточная гиперплазия
Таблица 2. Особенности цитоплазматической продукции ТОР-р, ТЫР-а и УЕОР-Д в ткани опухоли в исследуемых группах больных при немелкоклеточном раке легкого
Группы больных (количество больных: абс. число и %)
Маркер Продукция НАХТ- НАХТ- НАХТ- НАХТ+ НАХТ+ НАХТ+
ГМ- ГМ- ГМ+ ГМ- ГМ- ГМ+
БКГ- БКГ+ БКГ+ БКГ- БКГ+ БКГ+
(п=4) (п=7) (п=7) (п=3) (п=7) (п=7)
ТОР-р есть 3/4 (75%) 4/7 (57%) 4/7 (57%) 2/3 (67%) 3/7 (43%) 6/7 (86%)
нет 1/4 (25%) 3/7 (43%) 3/7 (43%) 1/3 (33%) 4/7 (57%) 1/7 (14%)
ТЫР-а есть 2/4 (50%) 5/7 (71%) 3/7 (%) 3/3 (100%) 2/7 (29%) 2/7 (29%)
(43%)
нет 2/4 (50%) 2/7 (29%) 4/7 (57%) 0/3 5/7 (71%) 5/7 (71%)
(0%)
VEGFA есть 4/4 (100%) 6/7 (86%) 7/7 (100%) 3/3 (100%) 7/7 (100%) 7/7 (100%)
нет 0/4 1/7 0/7 0/3 0/7 0/7
(0%) (14%) (0%) (0%) (0%) (0%)
Примечание: НАХТ — неоадьювантная химиотерапия, ГМ — гематогенное метастазирование, БКГ — базальноклеточная гиперплазия
При сравнении продукции ТОР-р, ТЫР-а и УЕОР-Д в цитоплазме опухолевых клеток у пациентов, не получавших НАХТ, в случаях с гематогенными метастазами и БКГ в эпителии бронхов (НАХТ-ГМ+БКГ+) также, как и в случаях без гематогенных метастазов и БКГ (НАХТ- ГМ-БКГ-), статистически значимых различий обнаружено не было (р>0,05). Независимо от наличия гематогенных метастазов во всех сравниваемых группах отмечался синтез УЕОР-Д (табл. 2).
В группе больных без НАХТ и гематогенных метастазов частота обнаружения ТОР-р в альвеолярных макрофагах, расположенных на границе с первичной опухолью,
была выше у больных с БКГ в мелких бронхах (100%), чем у больных без БКГ (25%; р=0,02; х2=7,2).
Также у больных без НАХТ продукцию ТОР-р в альвеолярных макрофагах выявляли чаще (100%) у пациентов с гематогенными метастазами и БКГ (НАХТ-ГМ+БКГ+) по сравнению с пациентами без гематогенных метастазов и БКГ (НАХТ-ГМ-БКГ-) (25%; р=0,02; х2=7,2) (табл. 3, рис. 4).
Кроме того, было обнаружено, что независимо от наличия или отсутствия у пациентов гематогенных метастазов, в макрофагах отмечается стойкая продукция цитокинов ТОР-Р, ВйР-1 и УЕОРД.
Таблица 3. Особенности продукции 80Р-1, ТОР-р, ТЫР-а и VEGF-A в альвеолярных макрофагах, располагающихся близи опухоли, в исследуемых группах больных при немелкоклеточном раке легкого
Группы больных (количество больных: абс. число и %)
Маркер Продукция НАХТ- НАХТ- НАХТ- НАХТ+ НАХТ+ НАХТ+
ГМ- ГМ- ГМ+ ГМ- ГМ- ГМ+
БКГ- БКГ+ БКГ+ БКГ- БКГ+ БКГ+
(п=4) (п=7) (п=7) (п=3) (п=7) (п=7)
Э0Р-1 есть 2/4 (50%) 7/7 (100%) 7/7 (100%) 3/3 (100%) 7/7 (100%) 7/7 (100%)
нет 2/4 (50%) 0/7 0/7 0/3 0/7 0/7
(0%) (0%) (0%) (0%) (0%)
ТОР-Р есть 1/4 (25%) 7/7 (100%) 7/7 (100%) 2/3 (67%) 6/7 (86%) 7/7 (100%)
р1 а=0,02 р1-3=0,02
Х2=7,2 Х2=7,2
нет 3/4 (75%) 0/7 0/7 1/3 (33%) 1/7 (14%) 0/7
(0%) (0%) (0%)
ТЫР-а есть 1/4 (25%) 2/7 (29%) 3/7 (43%) 2/3 (67%) 6/7 (86%) 0/7
(0%)
нет 3/4 (75%) 5/7 (71%) 4/7 (57%) 1/3 (33%) 1/7 (14%) 7/7 (100%)
VEGFA есть 2/4 (50%) 7/7 (100%) 7/7 (100%) 2/3 (67%) 7/7 (100%) 7/7 (100%)
нет 2/4 (50%) 0/7 0/7 1/3 (33%) 0/7 0/7
(0%) (0%) (0%) (0%)
Примечание: НАХТ — неоадьювантная химиотерапия, ГМ — гематогенное метастазирование, БКГ — базальноклеточная гиперплазия
Рис. 4. Альвеолярные макрофаги при плоскоклеточном раке легкого. Иммуногистохимическая реакция с антителами к ТОР-р (коричневый цвет), докраска гематоксилином и эозином. Ув. х400
Обсуждение
Результаты исследования позволяют обсуждать связь продукции цитокинов, участвующих в регуляции воспаления, с развитием гематогенных метастазов при НМРЛ, а также с развитием БКГ в смежных с опухолью бронхах и с эффектами НАХТ. По уровню синтеза VEGFA не были выявлены какие-либо различия во всех группах.
Эффекты НАХТ оказались различными в группах пациентов в зависимости от развития в отдаленные сроки гематогенных метастазов НМРЛ. НАХТ не оказывала значимого влияния на продукцию цитокинов в опухолях без гематогенных метастазов. При высоком риске метастазирования под влиянием НАХТ реже, по сравнению со случаями без НАХТ, в альвеолярных макрофагах синтезировался ТЫР-а. Эти результаты свидетельствуют о разном типе реагирования опухолевых клеток на повреждающее воздействие НАХТ в сравниваемых группах. Если секреция провоспалитель-ного цитокина ТЫР-а в макрофагах, располагающихся в альвеолах пограничных с опухолью, играет существенную роль в развитии воспаления, то НАХТ могла приводить к уменьшению выраженности воспаления в зоне инвазив-ного фронта опухоли. Не исключено, что это обстоятельство могло способствовать гематогенному метастазированию.
Результаты исследования подтверждают гипотезу авторов, предположивших, что развитие при НМРЛ в мелких бронхах, смежных с опухолью, в условиях хронического воспаления, различных вариантов морфологических изменений бронхиального эпителия ассоциировано с особенностями паренхиматозно-стромальных отношений в опухоли [23].
Одним из вариантов такой ассоциации является обнаруженная в данном исследовании связь БКГ с продукцией цитокинов в опухоли. При развитии БКГ обнаруживается большая частота выявления индуктора эпителиально-мезенхимального перехода ТОР-р в альвеолярных макрофагах и уменьшение синтеза 80Р-1 в цитоплазме клеток опухоли. ТОР-р — цитокин, участвующий в развитии иммунно-воспалительной реакции ТИ2 типа, которая, как известно, способствует прогрессии опухоли [24].
Большая частота выявления ТОР-р в альвеолярных макрофагах ожидаемо должна сопровождаться секрецией цитокина в микроокружение и воздействием на клетки опухоли в качестве триггера эпителиально-мезенхималь-ного перехода. В результате этого клетки приобретают
способность к инвазии, интравазации и метастазирова-нию. Не исключено, что феномен большей частоты обнаружения TGF-p в перитуморальных альвеолярных макрофагах при развитии БКГ является одним из факторов, благодаря которому БКГ стал прогностическим признаком гематогенного метастазирования НМРЛ.
Наиболее значимым результатом исследования, является снижение частоты определения SDF-1 в ядрах опухолевых клеток в группах пациентов с развитием гематогенных метастазов и наличием БКГ, независимо от проведения НАХТ. Физиологическая функция SDF-1 и его рецептора CXCR4 хорошо изучена на моделях заселения костномозговой ниши костномозговыми стволовыми клетками. Секретируемый стромальными клетками хемокин SDF-1 связывается с рецептором CXCR4 на стволовых клетках и таким образом, как полагают, стволовые клетки опухоли заселяют преметастати-ческие ниши [25]. В экспериментальных работах было показано, что взаимодействие SDF-1-CXCR4 индуцирует полимеризацию актина в CD34+-клетках, которые приобретают способность к миграции in vitro [26]. Важным аспектом обсуждения функции SDF-1-CXCR4 является оценка внутриклеточной локализации этих белковых молекул. Чаще наблюдается мембранная и цитоплазма-тическая локализация [27]. Однако отмечается и ядерная локализация [28]. В работе N.M. Osman с соавт. (2016) в клетках НМРЛ была обнаружена как цитоплазматиче-ская, так и ядерная локализация SDF-1: ядерное окрашивание SDF-1 наблюдалось в 36 из 72 случаев (50%) [29]. Полагают, что SDF-1 — фактор, стимулирующий активность MMP-2 во время инвазии раковых клеток, с чем может быть связана агрессивность НМРЛ [29].
Несмотря на то, что относительно изучаемых цитоки-нов многое известно, интерпретация функционального
ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]:
1. Каприн А.Д., Старинский В.В., Петрова Г.В. Злокачественные новообразования в России в 2018 году (заболеваемость и смертность). Москва: МНИОИ им. П.А. Герцена -Travis W.D., Brambilla E., Burke A.P. et al. World Health Organization classification of tumors of the lung, pleura, thymus, and heart. 4th Edition, Volume 7. Lyon: WHO press; 2015.
2. Hicklin D.J., Ellis L.M. Role of the vascular endothelial growth factor pathway in tumor growth and angiogenesis. J. Clin. Onc. 2005; 23(5): 1011-27.
3. Eser P.O., Janne P.A. TGFp pathway inhibition in the treatment of non-small cell lung cancer. Pharmac. Ther. 2018; 184: 112-30.
4. Li J., Shen C., Wang X. et al. Prognostic value of TGF-p in lung cancer: systematic review and meta-analysis. BMC Cancer 2019; 19: 691.
5. Li J., Song Y., Yu B. et al. TNFAIP2 Promotes Non-Small Cell Lung Cancer Cells and Targeted by miR-145-5p. DNA and Cell Biology 2020; 39(7): 1256-63.
6. Zhu J., Xin Y., Liu X. et al. Nimotuzumab enhances the sensitivity of non-small cell lung cancer cells to tumor necrosis factor-a by inhibiting the nuclear factor-^ signaling pathway. Exp. Ther. Med. 2018; 15(4): 3345-51.
7. Zhu T., Bao X., Chen M. et al. Mechanisms and future of non-small cell lung cancer metastasis. Front. Oncol. 2020; 10: 585284.
8. Zeng Y., Wang X., Yin B. et al. Role of the stromal cell derived fac-tor-1/CXC chemokine receptor 4 axis in the invasion and metastasis of lung cancer and mechanism. J. Thor. Dis. 2017; 9(12): 4947-59.
9. Belperio J.A., Phillips R.J., Burdick M.D. et al. The SDF-1/CXCL 12/ CXCR4 biological axis in non-small cell lung cancer metastases. Chest 2004; 125(5): 156S.
10. Kowanetz M., Ferrara N. Vascular endothelial growth factor signaling pathways: therapeutic perspective. Clin. Cancer Res.2006; 12(17): 5018-22.
11. Karaman S., Leppanen V.M., Alitalo K. Vascular endothelial growth factor signaling in development and disease. Development 2018; 145(14): dev151019.
12. Seto T., Higashiyama M., Funai H. et al. Prognostic value of expression of vascular endothelial growth factor and its flt-1 and KDR receptors in stage I non-small-cell lung cancer. Lung Cancer 2006; 53(1): 91-6.
13. Lantuejoul S., Salameire D., Salon C. et al. Pulmonary preneoplasia— sequential molecular carcinogenetic events. Histopathology 2009; 54(1): 43-54.
14. Kadara H., Wistuba I.I. Molecular biology of lung preneoplasia. Lung Cancer 2014; 6: 110-28.
15. Kerr K.M. Pulmonary preinvasive neoplasia. J. Clin. Path. 2001; 54(4): 257-71.
значения их продукции в цитоплазме или в ядрах клеток представляет большие трудности. Особенно это касается локализации цитокинов в ядрах, где они выполняют, по-видимому, функцию транскрипционных факторов. В последующих исследованиях предстоит уточнить полученные результаты, особенно функциональное значение потери ядерной локализации в опухолевых клетках Б0Р-1.
Заключение
Резюмируя полученные результаты, можно выделить особенности синтеза воспалительных цитокинов в опухоли при НМРЛ, ассоциированные преимущественно либо с гематогенным метастазированием, либо с БКГ, либо с НАХТ. С развитием гематогенных метастазов при наличии БКГ в смежных с опухолью бронхах связано уменьшение частоты выявления Б0Р-1 в ядрах опухолевых клеток. Развитие БКГ коррелирует с синтезом ТЭР-р в альвеолярных макрофагах и уменьшением продукции Б0Р-1 в цитоплазме клеток опухоли. Эффекты НАХТ проявляются при наличии гематогенных метастазов меньшей частотой выявления ТЫР-а в альвеолярных макрофагах.
Благодарности
Исследование выполнено при финансовой поддержке Гранта Президента НШ-2701.2020.7 «Разработка новых подходов к прогнозированию течения карцином молочной железы и легких с учетом морфологической и молекулярно-генетической гетерогенности опухоли».
Конфликт интересов
Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов.
16. Wang G.F., Lai M.D., Yang R.R. et al. Histological types and significance of bronchial epithelial dysplasia. Modern Path. 2006; 19(3): 429-37.
17. Breuer R.H., Pasic A., Smit E.F. et al. The natural course of preneoplastic lesions in bronchial epithelium. Clin. Cancer Res. 2005; 11(2): 537-43.
18. Greenberg A.K., Yee H., Rom W.N. Preneoplastic lesions of the lung. Resp. Res. 2002; 3(1): 1-10.
19. Pankova O.V., Denisov E.V., Ponomaryova A.A. et al. Recurrence of squamous cell lung carcinoma is associated with the co-presence of reactive lesions in tumor-adjacent bronchial epithelium. Tumor Biology 2016; 37(3): 3599-607.
20. Denisov E.V., Schegoleva A.A., Gerashchenko T.S. et al. Gene expression profiling revealed 2 types of bronchial basal cell hyperplasia and squamous metaplasia with different progression potentials. Appl. Immunohist. Mol. Morph. 2020; 28(6): 477-83.
21. Petrov S.V., Raikhlin N.T. Manual on immunohistochemical diagnostics of human tumors. In: Petrov S.V., Raikhlin N.T., editors. Molecular genetic and immunohistochemical characteristics of lung cancer. 3th, completely revised edition. Kazan: Tatmedia; 2004. p. 456-61.
22. Pankova O.V., Rodionov E.O., Miller S.V. et al. Neoadjuvant chemotherapy combined with intraoperative radiotherapy is effective to prevent recurrence in high-risk non-small cell lung cancer (NSCLC) patients. Transl. Lung Cancer Res. 2020; 9(4): 988.
23. Tashireva L.A., Perelmuter V.M., Denisov E.V. et al. Types of immune-inflammatory responses as a reflection of cell-cell interactions under conditions of tissue regeneration and tumor growth. Biochemistry (Moscow) 2017; 82(5): 732-48.
24. Kaplan R.N., Psaila B., Lyden D. Niche-to-niche migration of bone-marrow-derived cells. Trends Mol. Med. 2007; 13(2): 72-81.
25. Voermans C., Anthony E.C., Mul E. et al. SDF-1-induced actin polymerization and migration in human hematopoietic progenitor cells. Exp. Hematol. 2001; 29(12): 1456-64.
26. Chen H.W., Du C.W., Wei X.L. et al. Cytoplasmic CXCR4 highexpression exhibits distinct poor clinicopathological characteristics and predicts poor prognosis in triple-negative breast cancer. Curr. Mol. Med. 2013; 13(3): 410-6.
27. Liu F., Lang R., Wei J. et al. Increased expression of SDF-1/ CXCR4 is associated with lymph node metastasis of invasive micropapillary carcinoma of the breast. Histopathol. 2009; 54(6): 741-50.
28. Osman N.M., Osman W.M. SDF-1 and MMP2 cross talk in cancer cells and tumor microenvironment in non-small cell lung cancer. Egypt. J. Chest Dis. and Tubercul.2016; 65(2): 517-25.
