CC BY
45
Особенности продукции цитокинов при хронизации иксодового клещевого боррелиоза
Бараулина А.С., Кологривова Е.Н., Жукова О.Б., Чечина О.Е.
Characteristics of production cytokines in patients with development of chronic tick-borne borreliosis
Baraulina A.S., Kologrivova Ye.NZhukova O.B., Chechina O.Ye.
Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск
© Бараулина А.С., Кологривова Е.Н., Жукова О.Б., Чечина О.Е.
С целью выявления особенностей цитокинопродукции у пациентов с хронизацией иксодового клещевого боррелиоза в супернатантах трехсуточных культур цельной крови проведена оценка спонтанной, стимулированной фитогемагглютини-ном и антигеном боррелий продукции интерлейкина-4, интерферона-у и трансформирующего ростового фактора-pi. Высокий риск хронизации иксодового клещевого боррелиоза сопряжен с интенсивной спонтанной и антигенстимулированной продукцией интерферона-у и трансформирующего ростового фактора-pi в остром периоде заболевания.
Ключевые слова: иксодовый клещевой боррелиоз, интерлейкин-4, интерферон-у, трансформирующий ростовой фактор-
Р1.
For detection of cytokine production features in patients with development of chronic tick-borne borreliosis the evaluation of spontaneous, fitohaemagglutinin-stimulated and stimulated with antigen of borrelia cytokine production was conducted in superna-tants of three-day blood cells cultures. High risk of development of chronic tick-borne borreliosis associated with intensive spontaneous and antigen-stimulated production of interferon-у and transforming growing factor-P1 in acute disease.
Key words: tick-borne borreliosis, interleukin-4, interferon-у, transforming growing factor-P1.
УДК 578.245:616.98-002.2:579.834.114:595.421
Введение
Иксодовые клещевые боррелиозы (ИКБ) — группа инфекционных трансмиссивных заболеваний, вызываемых бактериями рода Borrelia и передающихся иксодовыми клещами [1, 7]. Заболевание отличается повсеместной распространенностью, полиморфизмом клинических проявлений, высокой частотой (до 60%) формирования хронического течения с поражением различных органов и систем и последующей инвали-дизацией. Одним из характерных симптомов острого ИКБ является мигрирующая эритема, которая отражает активацию неспецифического звена иммунитета [2, 5, 7, 9]. В последние годы возросло количество пациентов с безэритемной (труднодиагностируемой) формой заболевания. Хроническое течение боррелиоза при безэритемной форме формируется значительно чаще, чем при эритемной [7, 9].
Известно, что иммунная система принимает непосредственное участие не только в элиминации патогена, но и в развитии осложнений основного заболевания. Хроническое течение ИКБ сопровождается системными аутоиммунными расстройствами с развитием Лайм-артрита, хронического атрофического акродерматита, менингоэнцефалита [1, 7, 9]. Отмена аутотолерантности так же, как и отсутствие адекватного иммунного ответа на патоген, возможна вследствие нарушения механизмов цитокиновой регуляции [10].
Интерлейкину-4 (ИЛ-4), основными продуцентами которого являются Т-хелперы типа 2 (Тh2), принадлежит ключевая роль в формировании гуморального иммунного ответа. В развитии клеточно-опосредованных иммунных реакций основная регуля-торная функция отводится интерферону-у (ИФН-у) [4, 10].
В настоящее время показано, что формирование иммунного ответа по смешанному Th1—Th2 типу или с преобладанием Т-хелперов типа 1 (Th1) характерно для более легкого течения ИКБ [8, 10]. Однако активация преимущественно ТЫ-пути не является гарантией благоприятного исхода заболевания. Нарушения клеточного звена иммунитета играют существенную роль в развитии Лайм-артрита, неврологических и кожных осложнений. У пациентов с хроническим течением ИКБ выявлена сенсибилизация Т-лимфоцитов к антигенам нервных тканей, синовиальной оболочки, кардиолипину [12, 14, 17, 20]. Поддержание аутотоле-рантности осуществляется СD4+СD25+-клетками (Treg), основными продуцентами иммуносупрессорных цито-кинов, в частности трансформирующего ростового фактора-ßl (ТРФ-ßl) [12, 18].
С учетом широкого распространения ИКБ, частого развития хронической формы и высокого риска формирования аутоиммунных осложнений возникает необходимость исследования механизмов иммунологических нарушений при данной инфекционной патологии.
Целью исследования явилась оценка роли изменения продукции цитокинов (ИЛ-4, ИФН-у, ТРФ-ß!) в хронизации ИКБ.
Материал и методы
В программу исследования был включен 41 пациент (23 женщины, 18 мужчин) в возрасте от 18 до 50 лет с различной продолжительностью течения ИКБ: 23 — с хроническим и 18 — с острым течением.
Диагноз «острый ИКБ» устанавливали на основании положительного эпидемиологического анамнеза (пребывание в лесу, на дачном участке, присасывание клеща), наличия типичной клинической картины (головные боли, боли в крупных и мелких суставах, повышение температуры, астенический синдром), а также выявления специфических антител к боррелиям (иммуноглобулин М (IgM)) методом иммунофермент-ного анализа (ИФА). У всех пациентов с острым ИКБ была зарегистрирована безэритемная форма заболевания. Диагноз хронического ИКБ верифицировали на основании продолжительности вышеуказанных клинических проявлений в течение 6 мес и более, а также факта обнаружения противоборрелиозных антител (IgM, IgG) в ИФА.
Обследование проводили однократно на 1-й нед госпитализации до начала этиопатогенетической и иммунотропной терапии. Пациенты с острым ИГО в дальнейшем наблюдались амбулаторно в течение б мес и по результатам наблюдения были разделены на две подгруппы: с выздоровлением после курса проведенной терапии (10 человек) и с хронизацией острого ИГО (8 человек). ^п^ольную группу составили 25 условно здоровых добровольцев с соответствующими характеристиками по полу и возрасту, отрицавших факт присасывания клеща в течение жизни. ^к у здоровых доноров, так и у пациентов с ИГО на момент обследования были исключены острые воспалительные заболевания, обострения хронических заболеваний, применение иммунотропной терапии, вакцинация в течение предшествующего обследованию месяца.
В качестве материала исследования использовали периферическую кровь, которую забирали утром натощак из локтевой вены. ^етки крови культивировали в течение 3 сут в среде RPMI-1640 («Вектор-Бест», г. Новосибирск), содержащей 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ICN Biomedical, США), 100 мкг/мл гентамицина, 0,3 мг/мл L-глута-мина, 2 ммоль/мл HEPES (Flow, Великобритания). Проводили культивирование клеток в отсутствие ми-тогенов, а также на фоне стимуляции фитогемаг-глютинином (ФГА) (Sigma, США) в концентрации 10 мкг/мл и боррелиозным антигеном — ультразвуковым лизатом Borrelia garinii в дозе 1,25 • 106 микробных клеток в 1 мл (антиген предоставлен ФГУП «НПО „Микроген"» МЗ РФ НПО «Вирион»). ^льту-ра Borrelia garinii выделена из клещей, собранных на территории Томской области.
Методом ИФА в супернатанте культуры клеток цельной крови определяли концентрации ИЛ-4, ИФН-у (Pro Con, г. Санкт-Петербург) и ТРФ-ß 1 (Biosource, США). Анализ проводили на микропланшетном фотометре Multiscan EX (Labsystems, Финляндия). Расчет концентрации цитокинов осуществляли по калибровочной кривой. Статистическую обработку результатов исследования выполняли с помощью пакета программ Statistica 6.0. Результаты представлены в виде медианы Me, значений 25-го и 75-го перцентилей (Qi и Q3 соответственно). Для оценки значимости статистических различий использовали непараметрические критерии Вилкоксона для зависимых показателей
и Манна—Уитни для независимых выборок. Различия считались достоверными при р < 0,05.
Результаты и обсуждение
Известно, что ИФН-у продуцируется активированными ТЫ-лимфоцитами и является одним из ключевых цитокинов клеточного ответа [10]. С учетом способности боррелий к внутриклеточному паразити-рованию и формированию иммунного ответа по Т-клеточному пути ИФН-у был выбран в качестве маркера активации ТЫ-субпопуляции лимфоцитов. Уровень спонтанной продукции ИФН-у у всех пациентов с ИКБ превышал аналогичный показатель здоровых доноров, при этом ответ на ФГА регистрировался на достоверно низком уровне по сравнению с контрольной группой (таблица). Имеются данные о том, что воздействие антигенов боррелий на Т-лимфоциты приводит к повышению продукции ими ИФН-у [10, 11]. Эти сведения согласуются с полученными результатами исследования спонтанной продукции ИФН-у, отражающей цитокинпродуцирующую способность клеток, находящихся в активированном состоянии в момент взятия крови.
Продукция цитокинов у пациентов с различной продолжительностью течения иксодового клещевого бореллиоза (Ме Qз))
Уровень цитокинов в супернатантах культуры клеток крови, пг/мл Характеристика обследованных
Здоровые доноры Пациенты с хроническим ИКБ Пациенты с острым ИКБ с последующим выздоровлением Пациенты с острым ИКБ с последующей хронизацией
ИФН-у спонтанный 0 (0,00; 0,00) 87,65 (75,37; 124,30) рг < 0,01 38,17 (38,17; 50,00) р2 = 0,040 ръ < 0,01 87,83 (87,83; 150,50) р2 = 0,040 р4 = 0,035
ФГА-стимулированный 412,40 (265,00; 47,92) р1 = 0,023 68,99 (50,00; 99,84) р2 < 0,01 50,00 (27,35; 75,30) р2 = 0,048 56,15 (50,00; 62,30) р2 = 0,030
антигенстимулированный 217,10 (100,20; 239,90) р1 = 0,023 87,65 (50,00; 112,00) р2 = 0,035 100,00 (50,00; 112,00) 300,50 (112,00; 489,00) р3 = 0,034
ИЛ-4 спонтанный 12,96 (10,89; 12,96) 29,42 (28,32; 35,00) рг < 0,01 9,11 (7,60 ; 10,90) ръ < 0,01 15,37 (9,11; 40,00)
ФГА-стимулированный 21,39 (18,16; 21,39) 33,89 (15,37; 69,28) 12,96 (10,89; 18,16) р3 = 0,015 18,16 (12,96; 25,12)
антигенстимулированный 10,46 (7,96; 14,18) 21,39 (10,89; 34,35) 15,37 (15,37; 21,39) рг < 0,01 15,37 (7,60; 21,39) рг = 0,017
ТРФ-Р1 спонтанный 62,50 (31,23; 62,50) 62,30 (31,20; 62,50) 21,78 (21,78; 62,50) 86,26 (31,20; 125,00)
ФГА-стимулированный 105,60 (62,50; 125,00) 62,50 (31,20; 125,00) 73,39 (21,78; 125,00) 31,20 (21,78; 62,50)
антигенстимулированный 44,55 125,00 31,20 86,26
Отсутствие реакции клеток крови на ФГА у всех пациентов с ИКБ может быть обусловлено циркулированием в крови большого количества преактивиро-ванных антиген-специфических ТЫ-лимфоцитов, для которых наиболее сильным стимулятором продукции ИФН-у является боррелиозный антиген [11]. Анти-генстимулированная продукция ИФН-у у пациентов с хроническим ИКБ оказалась ниже аналогичного показателя в контроле, что свидетельствует об ослаблении влияния ТЫ-пути на фоне хронического течения инфекционного процесса. При хронизации острого ИКБ отмечен максимальный уровень антиген-специфической продукции ИФН-у. У больных острым ИКБ с последующим выздоровлением исследуемый показатель регистрировался на уровне значений, выявленных у пациентов с хроническим течением ИКБ (таблица). Таким образом, интенсивная продукция ИФН-у в ответ на антиген боррелий в острый период ИКБ, связанная, вероятно, с усиленной антиген-специфической активацией Т-клеточного звена иммунитета, не приводит к эффективной элиминации патогена.
(38,02; 125,00) (86,26; 125,00) (31,00; 31,20) (15,20; 86,26)
pi = 0,047
Примечание. Уровень р указан для выборок, имеющих достоверные различия; р1 — уровень статистической значимости различий по сравнению со спонтанным уровнем цитокинопродукции; р2 — уровень статистической значимости различий по сравнению с аналогичными показателями у здоровых доноров; р3 — уровень статистической значимости различий по сравнению с аналогичными показателями у пациентов с хроническим ИКБ; р4 — уровень статистической значимости различий по сравнению с аналогичными показателями у пациентов с острым ИКБ с последующим выздоровлением.
держание ТРФ-pi в супернатантах культур клеток крови, полученных у пациентов с хроническим течением ИКБ, достоверно превышало уровень его спонтанной продукции. Существуют данные о повышении индуцированной боррелиями экспрессии FoxP3 мРНК (специфического маркера Treg) СБ4+-лимфоцитами у больных с хроническим ИКБ, в то время как экспрессия, индуцированная другими митогенами, остается одинаковой как у пациентов с ИКБ, так и у здоровых доноров [15, 16, 18]. С этим согласуются собственные результаты, полученные у пациентов с хроническим инфекционным процессом. Повышенная антигенсти-мулированная продукция ТРФ-pi клетками крови пациентов с хроническим ИКБ, выявленная in vitro, косвенно свидетельствует об активации антиген-специфических клонов Treg, что, вероятно, способствует угнетению иммунного ответа на патоген и создает возможность для длительной персистенции боррелий. У пациентов с последующей хронизацией ИКБ цито-киновый ответ на боррелиозный антиген сохранялся на уровне спонтанной продукции ТРФ-pi (см. таблицу), что позволяет предположить вовлечение в активацию антиген-специфических клонов Treg еще на стадии острого инфекционного процесса. Кроме того, можно предположить, что отсутствие изменения продукции ТРФ-p 1 в ответ на ФГА у всех пациентов с ИКБ свидетельствует о низкой функциональной активности Treg в отношении неспецифических активаторов иммунного ответа, что создает угрозу формирования аутоиммунных расстройств.
Заключение
Таким образом, проведенное исследование выявило, что для пациентов с последующей хронизацией ИКБ характерен высокий уровень спонтанной продукции ИФН-у в острый период заболевания, ассоциированный со снижением ФГА-стимулированной цитокинопродукции, что может указывать на формирование антиген-специфического иммунного ответа преимущественно по Thl-пути. Адаптивные возможности ТЬ2-пути иммунного ответа у данных лиц сни-
При исследовании спонтанной продукции ИЛ-4, ключевого цитокина ТЬ2-пути, выявлено, что наиболее высокие значения данного показателя были у пациентов с хроническим течением ИКБ (см. таблицу). При этом у больных с последующей хронизацией инфекционного процесса не отмечено значимых различий при сравнении уровня спонтанной продукции ИЛ-4 со значениями, полученными у пациентов с хронической формой заболевания, что может выступать отражением высокой активации антиген-неспецифических ТЬ2-клеток. Цитокиновый ответ на ФГА отсутствовал у всех обследованных лиц с ИКБ (см. таблицу).
Антигенстимулированная продукция ИЛ-4 у всех пациентов с острым ИКБ была достоверно выше контрольных значений данного показателя, что, вероятно, является отражением активного вовлечения Th2-пути в противоборрелиозный иммунный ответ в остром периоде болезни (см. таблицу). У пациентов с последующей хронизацией инфекционного процесса продукция ИЛ-4 в ответ на антиген боррелий находилась на одном уровне со спонтанной. Указанные особенности, с одной стороны, позволяют предположить, что спонтанная продукция ИЛ-4 у пациентов с высоким риском хронизации ИКБ осуществляется преимущественно активированными антиген-специфическими ТЬ2-лимфоцитами, а с другой — свидетельствуют о снижении функциональных возможностей антиген-специфического гуморального иммунного ответа на фоне интенсивной неспецифической активации Th2-лимфоцитов.
В качестве показателя активности Treg была исследована способность клеток крови продуцировать ТРФ-Р1, являющийся одним из важнейших супрес-сорных цитокинов [3]. Спонтанная продукция ТРФ-Р1 у пациентов с хроническим течением ИКБ регистрировалась на одном уровне с аналогичным показателем у здоровых доноров (см. таблицу). При этом достоверных различий с уровнем продукции этого цитокина у пациентов с острым течением ИКБ не выявлено. Цито-киновый ответ на ФГА отсутствовал у всех обследованных. В присутствии боррелиозного антигена со-
жены, что подтверждается отсутствием стимулирующего влияния боррелиозного антигена на продукцию ИЛ-4. Подобные изменения, вероятно, обусловлены антагонистическими влияниями ключевых цитокинов Th1- и ТЬ2-путей иммунного ответа. Выявленное усиление антигенстимулированной продукции ТРФ-pi у пациентов с хроническим течением ИКБ косвенно свидетельствует о высокой активности антиген-специфических клонов Treg, что может быть одной из причин неэффективного противоборрелиозного ответа. Следствием указанных особенностей функционирования регуляторных субпопуляций лимфоцитов может выступать отсутствие эффективного противо-боррелиозного ответа, поддержание длительной пер-систенции возбудителя и хронизация заболевания, а также повышение риска формирования аутоиммунных осложнений хронического ИКБ.
Литература
1. Ананьева Л.П. Иксодовые клещевые боррелиозы (лайм-ская болезнь). Экология, клиническая картина и этиология // Терапевтич. архив. 2000. № 5. С. 72—78.
2. Бабкин А.В. Клинико-иммунологическая характеристика поздних кожных проявлений иксодового клещевого боррелиоза в северо-западном регионе России: автореф. дис. ... канд. мед. наук. СПб., 1998. 22 с.
3.Быковская Н.С., Насонов Е.Л. Роли дефектов иммуносу-прессии в развитии аутоиммунных заболеваний // Науч.-практ. ревматология. 2005. № 4. С. 81—84.
4. Васильева Ю.П. Клинико-иммунологические критерии хронизации иксодового клещевого боррелиоза у детей: автореф. дис. ... канд. мед. наук. СПб., 2003. 16 с.
5. Деконенко Е.П. Клинико-эпидемиологические особенности Лайм-боррелиоза // Врач. 2004. № 2. С. 10—18.
6. Козлов С.С. Лайм-боррелиоз в Северо-Западном регионе России: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. СПб., 1999. 25 с.
7. Лобзин Ю.В., Усков А.В., Козлов С.С. Лайм-боррелиоз (иксодовые клещевые боррелиозы). СПб.: Фолиант, 2000. 160 с.
8. Лукашова Л.В. Микст-инфекция — иксодовый клещевой боррелиоз (аспекты патогенеза, клиники, лечения): авто-
реф. дис. ... д-ра мед. наук. Новосибирск, 2006. 46 с.
9. Ревматические болезни: руководство по внутренним болезням / под ред. Е.И. Чазова и др. М.: Медицина, 1997. 520 с.
10. Симакова А.И., Мандракова Н.В., Маркелова Е.В., Ива-нис В.А. Цитокиновый профиль у больных с иксодовым клещевым боррелиозом // Цитокины и воспаление. 2004. Т. 3, № 4. С. 21—23.
11. Федоров Е.С., Барскова В.Г., Ананьева Л.П. и др. Механизмы регуляции воспаления и иммунитета в патогенезе болезни Лайма // Клинич. медицина. 1999. № 6. С. 14— 18.
12. Bolz D.D., Weis J.J. Molecular mimicry to Borrelia burgdorferi: pathway to autoimmunity? // Autoimmunity. 2004. V. 37, № 5. Р. 387—392.
13. Ghosh S., SewardR., Costello C.E. еt al. Autoantibodies from synovial lesions in chronic, antibiotic treatment-resistant Lyme arthritis bind cytokeratin-10 // Immunol. 2006. V. 177, № 4. Р. 2486—2494.
14. Guerau-de-ArellanoM., HuberВ.Т. Development of autoimmunity in Lyme arthritis // Curr. Opin. Rheumatol. 2002. V. 14, № 4. Р. 388—393.
15. Jarefors S. The role of T helper 1-like immunity and aspects of I co-exposure in relation to disease. Linkoping, 2006. 91 р.
16. Jarefors S., Janefjord C.K., Forsberg P. еt al. Decreased up-regulation of the interleukin-12Rß2-chain and interferon-у secretion and increased number of forkhead box P3-expressing cells in patients with a history of chronic Lyme borreliosis compared with asymptomatic Borrelia-exposed individuals // Clinical & Experimental Immunology. 2007. V. 147, № 1. P. 18—27.
17. Kamradt T., Volkmer-Engert T. Cross-reactivity of T lymphocytes in infection and autoimmunity // Mol. Divers. 2004. V. 8, № 3. Р. 271—280.
18. Nardelli D.T., Cloute J.P., bukK.H. еt al. CD4+CD25+-T сells prevent arthritis associated with Borrelia vaccination and infection // Clinical and diagnostic laboratory immunology. 2005. V. 12, № 6. P. 786—792.
19. Raveche E.S., Schutzer S.E., Fernandes H. еt al. Evidence of borrelia autoimmunity-induced component of Lyme carditis and arthritis // J. of Clinical Microbiology. 2005. V. 43, № 2. Р. 850—856.
20. Steere A.C., GrossD., MeyerA.L., HuberB.T. Autoimmune mechanisms in antibiotic treatment-resistant lyme arthritis // J. Autoimmun. 2001. V. 16, № 3. Р. 263—268.
Поступила в редакцию 01.07.2009 г.
Утверждена к печати 22.12.2009 г.
Сведения об авторах
А. С. Бараулина — соискатель кафедры иммунологии и аллергологии СибГМУ (г. Томск).
Е.Н. Кологривова — д-р мед. наук, профессор кафедры иммунологии и аллергологии СибГМУ (г. Томск).
О.Б. Жукова — д-р мед. наук, доцент кафедры фундаментальных основ клинической медицины СибГМУ (г. Томск).
О.Е. Чечина — канд. мед. наук, докторант кафедры патофизиологии СибГМУ (г. Томск).
Для корреспонденции
Чечина Ольга Евгеньевна, тел. 8-905-089-2137, e-mail: [email protected]
