CC BY
19Научная статья УДК 543.41
doi:10.37614/2949-1215.2022.13.1.033
ОСОБЕННОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЩЕГО СОДЕРЖАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ (ПОЛИФЕНОЛОВ И ФЛАВОНОИДОВ, ОБЩЕЙ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ) В ПРИСУТСТВИИ ГЛУБОКИХ ЭВТЕКТИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЕЙ
Елена Юрьевна Пасичник1, Никита Сергеевич Цветов2
1Апатитский филиал Мурманского государственного технического университета, Апатиты, Россия, wlondr@yandex.ru
2Институт химии и технологии редких элементов и минерального сырья имени И. В. Тананаева Кольского научного центра Российской академии наук, Апатиты, Россия, n.tsvetov@ksc.ru
Аннотация
Глубокие эвтектические растворители (deep eutectic solvents, DES) — это биологически безопасные растворители, содержащие доноры и акцепторы водородных связей. Они считаются перспективными альтернативными растворителями, применяемыми в экстракции биологически активных веществ из растений. Для характеризации экстрактов используются спектрофотометрические методы, основанные на различных реакциях комплексообразования, такие как количественное определение общего содержания флавоноидов, полифенолов, определение общей антиоксидантной активности. Однако в статьях указываются градуировочные характеристики по водным либо этанольным растворам стандартных веществ, а в среде DES градуировочных зависимостей найдено не было. Остается открытым вопрос о справедливости применения градуировочных характеристик с использованием этанольных растворов для DES. Поэтому целью работы являлась оценка влияния присутствия глубоких эвтектических растворителей на применимость методов определения полифенолов, флавоноидов и общей антиоксидантной активности. Получены градуировочные зависимости в среде глубоких эвтектических растворителей на основе хлорида холина и малоновой, яблочной, лимонной и винной кислот. Установлено, что природа растворителя сильно влияет на градуировочные коэффициенты, что говорит о необходимости использования отдельных градуировок для каждого типа растворителя. Ключевые слова:
глубокие эвтектические растворители, полифенолы, флавоноиды, антиоксидантная активность Благодарности:
работа выполнена в рамках темы научно-исследовательской работы FMEZ-2022-0018 при финансовой поддержке стипендии Президента Российской Федерации СП-1326.2022.4 и гранта «УМНИК» (договор 16176ГУ / 2020 от 24 декабря 2020 года).
Original article
FEATURES OF THE APPLICATION OF METHODS FOR DETERMINING THE TOTAL CONTENT OF BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES (POLYPHENOLS AND FLAVONOIDS, TOTAL ANTIOXIDANT AND ANTIRADICAL ACTIVITIES) IN THE PRESENCE OF DEEP EUTECTIC SOLVENTS
Elena Yu. Pasichnik1, Nikita S. Tsvetov2
1Apatity Branch of the Murmansk State Technical University, Apatity, Russia, wlondr@yandex.ru 2I. V. Tananaev Institute of Chemistry and Technology of Rare Elements and Mineral Raw Materials of the Kola Science Centre of the Russian Academy of Sciences, Apatity, Russia, n.tsvetov@ksc.ru
Abstract
Deep eutectic solvents (DES) are biologically safe solvents containing donors and acceptors of hydrogen bonds. They are considered promising alternative solvents used in the extraction of biologically active substances from plants. To characterize extracts, spectrophotometric methods based on various complexation reactions are used, such as quantitative determination of the total content of flavonoids, polyphenols, determination of the total antioxidant activity. However, the articles indicate calibration characteristics for aqueous or ethanol solutions of standard substances, and no calibration dependencies were found in the DES medium. The question of the validity of the application of calibration characteristics using ethanol solutions for DES remains open. Therefore, the aim of our work was to assess the effect of the presence of deep eutectic solvents on the applicability of methods for determining polyphenols, flavonoids and total antioxidant activity. In the course of the work, calibration dependences were obtained in the medium of deep eutectic solvents based on choline chloride and malonic, malic, citric and tartaric acids. It has been established that the nature of the solvent strongly influences the calibration coefficients, which indicates the need to use separate graduations for each type of solvent. Keywords:
deep eutectic solvents, polyphenols, flavonoids, antioxidant activity Acknowledgments:
the study was carried as part of research work FMEZ-2022-0018 and supported by President of Russia Scholarship СП-1326.2022.4 as well as by UMNIK grant (2020, December 24 contract 16176ГУ / 2020).
Глубокие эвтектические растворители (deep eutectic solvents, DES) — это биологически безопасные растворители, содержащие такие компоненты, как, например, глицерин, мочевина или яблочная, лимонная, малоновая, винная кислоты и хлорид холина. Их огромный потенциал в качестве альтернативных растворителей получил широкое признание. На данный момент признано, что количество возможных DES может соперничать с количеством ионных жидкостей и органическими растворителями. DES также являются биодеградируемыми, нелетучими, невоспламеняющимися и относительно дешевыми. Кроме того, они имеют широкий спектр применений в различных областях, включая синтез, катализ и химический анализ, а также в экстракции биологически активных веществ из растительных материалов и в аналитической химии [1-4].
Для характеризации экстрактов используются спектрофотометрические методы, основанные на реакциях комплексообразования, такие как количественное определение общего содержания полифенолов (total phenolic content, TPC), флавоноидов (total flavonoid content, TFC) и общей антиоксидантной активности (total antioxidant activity, TAC). В основе количественного определения полифенолов лежит реакция образования вольфраммолибденовой сини, механизм которой до конца не установлен, с помощью реагента Фолина — Чокальтеу, в состав которого входит смесь разнолигандных молибдовольфрамовых гетерополикомплексов структуры Доусона Na6P2MonWi8-nOô2 (n = 4-5), градуировочная зависимость строится на основе раствора галловой кислоты [5, 6]. С помощью комплексообразования с раствором хлорида алюминия и градуировочной зависимости, построенной на основе раствора рутина, можно определить количество флавоноидов, содержащиеся в экстракте [7]. Антиоксидантную активность можно оценить с помощью фосфомолибдатного метода, в основе которого лежит реакция перехода молибдена (VI) в молибден (V) с образованием окрашенного комплекса, градуировочная зависимость строится по реакции реакционного раствора с раствором аскорбиновой кислоты [8, 9].
Зачастую в статьях указываются градуировочные характеристики по водным либо этанольным растворам в стандартных веществах, а в среде DES градуировочных зависимостей найдено не было. Поэтому целью нашей работы являлась оценка влияния присутствия DES на применимость методов определения полифенолов, флавоноидов и общей антиоксидантной активности.
Реагенты и оборудование
Хлорид холина (99 %, Xi'an Tian Guangyuan Biotech Co., Ltd), малоновая, яблочная, щавелевая, лимонная, винная кислоты (все кислоты ЧДА, «Вектон»), алюминий хлористый 6-водный (99 % ИПМ, «Вектон»), фенол Фолина — Чокальтеу (соотв. ИМП, «Вектон»), карбонат натрия (ХЧ, «Вектон»), свободный радикал 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (DPPH) (99 %, Sigma-Aldrich), молибдат аммония (ХЧ, «Вектон»), аскорбиновая кислота (> 99,7 %, HUGESTONE, China), галловая кислота (98 % Sigma-Aldrich), рутин (> 94 %, Sigma-Aldrich), этанол медицинский (95 %, ООО «Росбио»), деионизованная вода Millipore quality.
Ультразвуковая ванна («Вилитек VBS-3-DP»), сушильный шкаф, дозатор лабораторный 100-1000 мкл (Join Lab, Китай), хроматографический шприц объемом 50 мкл, фотометр КФК-3-01 («ЗОМЗ», Россия), кювета на 5,170 мм.
Методы
К навеске хлорида холина, выступающего в качестве акцептора водородных связей, добавляли навеску донора водородных связей, а именно малоновой (MA), яблочной (Mal), лимонной (CA), винной (Tar) кислот в молярном соотношении 1 : 1 (2 : 1 для винной кислоты). Смеси выдерживали при 60-70 °С до образования гомогенной жидкости (DES). В качестве экстрагентов часто используется смесь DES с водой в соотношении 7 : 3 по массе, а при определении параметров экстрактов их разбавляют в 100 раз [10]. Поэтому для построения градуировочных зависимостей в качестве растворителя DES разбавляли водой в 100 раз.
Градуировочная зависимость для количественного определения TPC строилась с помощью серии стандартных растворов галловой кислоты. К навеске галловой кислоты 2 мг добавляли 4 мл растворителя, получая раствор с концентрацией 500 мкг / мл. Далее, последовательными разбавлениями готовили серию
стандартных растворов 12,5-500 мкг / мл. К 1 мл 0,2 М раствора Фолина — Чокальтеу добавляли 0,2 мл градуировочного раствора. Затем приливали 0,8 мл 5 %-го раствора карбоната натрия и оставляли в темноте на 1 ч при комнатной температуре. С помощью фотоколориметра КФК-3-01 («ЗОМЗ», Россия) при длине волны 765 нм измеряли оптическую плотность.
Для построения градуировочной зависимости определения TFC использовался раствор рутина. Навеску галловой кислоты 2 мг растворили в 4 мл растворителя, полученный раствор имел концентрацию 500 мкг / мл. С помощью последовательных разбавлений приготовили серию стандартных растворов в концентрационном диапазоне 12,5-500 мкг / мл. К 1 мл 2 %-го раствора хлорида алюминия в 95 %-м этаноле добавляли 1 мл стандартного раствора рутина. Через час оптическую плотность снимали при длине волны 420 нм.
Определение TAC экстрактов на основе DES требует использования модифицированной методики [11], которая в самом простом случае сводится к уменьшению объема аликвоты экстракта, приливаемого к реакционному раствору. Поскольку при определении TAC не требуется разбавления экстракта [9], навеску аскорбиновой кислоты растворяли в смеси DES + вода 7 : 3 по массе. К 2 мл реакционного раствора (4 мМ молибдата аммония, 28 мМ дигидрофосфата калия, 0,6 M серной кислоты) с помощью хроматографического шприца добавляли по 5 мкл градуировочных растворов аскорбиновой кислоты концентраций 1-20 мг / мл. Полученные растворы выдерживали 90 мин при температуре 95 °C. Оптическая плотность измерялась при длине волны 805 нм.
Во всех экспериментах проводилось три параллельных измерения.
Обсуждение результатов
Параметры линейной аппроксимации градуировочных зависимостей a и b (наклон и сдвиг соответственно), стандартные ошибки их определения (SE) и коэффициент детерминации (R2) для всех экстрагентов приведены в табл. 1.
Таблица 1
Параметры линейной аппроксимации градуировочных зависимостей a и b (наклон и сдвиг соответственно), стандартные ошибки их определения (SE) и коэффициент детерминации (R2) для всех экстрагентов
Экстрагент a b SE a SE b R2
TAC
EtOH 0,150 -0,086 0,002 0,030 0,996
MA 0,147 -0,138 0,004 0,039 0,994
Mal 0,120 -0,085 0,004 0,044 0,988
CA 0,110 -0,117 0,002 0,030 0,994
Tar 0,125 -0,049 0,002 0,026 0,996
TFC*
EtOH 4,630 45,505 0,053 12,361 0,998
MA 4,643 172,106 0,084 19,590 0,995
Mal 4,730 17,947 0,078 18,256 0,996
CA 3,919 49,077 0,047 11,037 0,998
Tar 4,315 26,221 0,034 7,927 0,999
TFC*
EtOH 4,363 0,476 0,093 26,229 0,991
MA 2,589 -43,296 0,043 11,972 0,995
Mal 3,581 -17,732 0,054 15,270 0,996
CA 3,884 -53,493 0,059 16,700 0,996
Tar 3,820 -20,291 0,052 14,634 0,996
* Для градуировочных зависимостей ТРС и TFC приведены значения параметров, умноженных на 1000.
Для оценки влияния природы растворителя на результаты определения ключевых параметров экстрактов был проведен однофакторный дисперсионный анализ в программе MS Excel 2010, который позволял учесть и при необходимости исключить случайные факторы. Дисперсионный анализ коэффициентов линейного уравнения a и b (наклон и сдвиг соответственно) приведен в табл. 2. Если ^-распределение Фишера — Снедекора менее табличного (^-критическое, равное 3,478 для всех методов), то это означает, что влияния природы растворителя на получаемые коэффициенты нет.
Таблица 2
Значение ^"-распределения для коэффициентов линейных уравнений a и b градуировочных зависимостей в методах определения TAC, TPC, TFC
Анализ F (a) F (b)
TAC 18,1 Значимо 1,9 Не значимо
TPC 6,8 То же 57,1 Значимо
TFC 54,3 » 4,5 То же
Получено, что для всех параметров аппроксимаций F > F-критического. Только на параметр b для определения TAC не было обнаружено влияния природы растворителя (F = 1,9). Наибольшее влияние природы растворителя на параметр b заметно в случае определения TPC, что говорит о значительном матричном эффекте. Из этого можно заключить, что при использовании в качестве экстрагентов DES и определении ключевых параметров экстрактов на их основе необходимо проводить градуировку с использованием каждого конкретного растворителя.
Выводы
В работе были найдены коэффициенты градуировочных зависимостей для методов определения общего содержания полифенолов по методу Фолина — Чокальтеу, флавоноидов с использованием реакции комплексообразования с хлоридом алюминия и общей антиоксидантной активности по фосфомолибдатному методу для случаев использования этилового спирта в сравнении с глубокими эвтектическими смесями хлорида холина с малоновой, яблочной, винной и лимонной кислотами в качестве растворителя. Проведен дисперсионный анализ полученных данных для определения влияния природы растворителя на параметры линейных зависимостей. Было установлено, что природа растворителя сильно влияет на градуировочные коэффициенты, что говорит о необходимости использования отдельных градуировок для каждого типа растворителя.
Полученные данные служат расширением и углублением методологической базы фотометрического определения указанных параметров в растительных экстрактах, в особенности приготовленных с использованием DES.
Список источников
1. Tang В., Row K. H. Recent developments in deep eutectic solvents in chemical sciences // Monatshefte fur Chemie. 2013. Vol. 144, № 10. P. 1427-1454.
2. Zainal-Abidin M. H., Hayyan M., Hayyan A., Jayakumar N. S. New horizons in the extraction of bioactive compounds using deep eutectic solvents: A review // Anal. Chim. Acta. Elsevier Ltd. 2017. Vol. 979. P. 1-23.
3. Shishov A., Pochivalov A., Nugbienyo L., Andruch V., Bulatov A. Deep eutectic solvents are not only effective extractants // TrAC — Trends Anal. Chem. Elsevier Ltd. 2020. Vol. 129. P. 115956.
4. Shishov A., Pochivalov A., Nugbienyo L., Andruch V., Bulatov A. Trends in Analytical Chemistry Deep eutectic solvents are not only effective extractants // Trends Anal. Chem. Elsevier Ltd. 2020. Vol. 129. P. 115956.
5. Ainsworth E. A., Gillespie K. M. Estimation of total phenolic content and other oxidation substrates in plant tissues using Folin — Ciocalteu reagent // Nat. Protoc. 2007. Vol. 2, № 4. P. 875-877.
6. Denisenko T. A., Vishnikin A. B., Tsiganok L. P. Spectrophotometric determination of phenolic compounds sum in plants using aluminum chloride, 18-molybdodiphosphate and Folin — Ciocalteu reagents // Anal. i Kontrol. 2015. Vol. 19, № 4. P. 373-380.
7. Korovkina A., Zhirov V., Tsvetov N., Petrashova D. Herbaceous plants growing in Arctic zones as potential perspective sources of valuable flavonoids // IOP Conf. Ser. Earth Environ. Sci. 2020. Vol. 613, № 1.
8. Korovkina A. V., Tsvetov N. S., Nikolaev V. G. Flavonoid content and antioxidant activity of extracts of Polygonum Weyrichii Fr. Schmidt // IOP Conf. Ser. Earth Environ. Sci. 2020. Vol. 421, № 5.
9. Пасичник Е. Ю., Цветов Н. С. Применение эвтектической смеси хлорид холина + малоновая кислота для экстракции биологически активных соединений из Chamaenerion Angustifolium (L.) // Сборник научных трудов IX Международной научной конференции молодых ученых «Современные тенденции развития технологий здоровьесбережения». 2021. C. 283-288.
10. Tsvetov N., Sereda L., Korovkina A., Artemkina N., Kozerozhets I., Samarov A. Ultrasound-assisted extraction of phytochemicals from Empetrum hermafroditum Hager. using acid-based deep eutectic solvent: kinetics and optimization // Biomass Convers. Biorefinery. Springer Berlin Heidelberg. 2022. № 12.
11. Паукшта О. И., Цветов Н. С., Петрова В. И. Разработка метода определения антиоксидантной активности экстрактов на основе глубоких эвтектических растворителей // Труды Кольского Научного центра РАН. 2020. Т. 3, № 4. C. 142-145.
References
1. Tang B., Row K. H. Recent developments in deep eutectic solvents in chemical sciences. Monatshefte für Chemie, 2013, vol. 144, no 10, pp. 1427-1454.
2. Zainal-Abidin M. H., Hayyan M., Hayyan A., Jayakumar N.S. New horizons in the extraction of bioactive compounds using deep eutectic solvents: A review. Anal. Chim. Acta, 2017, vol. 979, pp. 1-23.
3. Shishov A., Pochivalov A., Nugbienyo L., Andruch V., Bulatov A. Deep eutectic solvents are not only effective extractants. TrAC — Trends Anal. Chem., 2020, vol. 129, p. 115956.
4. Shishov A., Pochivalov A., Nugbienyo L., Andruch V., Bulatov A. Trends in Analytical Chemistry Deep eutectic solvents are not only effective extractants. Trends Anal. Chem., 2020, vol. 129, p. 115956.
5. Ainsworth E. A., Gillespie K. M. Estimation of total phenolic content and other oxidation substrates in plant tissues using Folin-Ciocalteu reagent. Nat. Protoc., 2007, vol. 2, no 4, pp. 875-877.
6. Denisenko T. A., Vishnikin A. B., Tsiganok L. P. Spectrophotometric determination of phenolic compounds sum in plants using aluminum chloride, 18-molybdodiphosphate and Folin — Ciocalteu reagents. Anal. i Kontrol, 2015, vol. 19, no. 4, pp. 373-380.
7. Korovkina A., Zhirov V., Tsvetov N., Petrashova D. Herbaceous plants growing in Arctic zones as potential perspective sources of valuable flavonoids. IOP Conf. Ser. Earth Environ. Sci., 2020, vol. 613, no. 1.
8. Korovkina A. V., Tsvetov N. S., Nikolaev V. G. Flavonoid content and antioxidant activity of extracts of Polygonum Weyrichii Fr. Schmidt. IOP Conf. Ser. Earth Environ. Sci., 2020, vol. 421, no. 5.
9. Pasichnik E. Yu., Tsvetov N. S. Primenenie evtekticheskoj smesi hlorid holina + malonovaya kislota dlya ekstrakcii biologicheski aktivnyh soedinenij iz Chamaenerion Angustifolium (L.) [Application of eutectic mixture of choline chloride + malonic acid to extract biologically active compounds from Chamaenerion angustifolium (L.)]. Sbornik nauchnyh trudov IX Mezhdunarodnoj nauchnoj konferencii molodyh uchenyh "Sovremennye tendencii razvitiya tekhnologij zdorov'esberezheniya" [Proceedings of the IX International Scientific Conference of Young Scientists "Modern trends in health saving technologies"], 2021, pp. 283-288.
10. Tsvetov N., Sereda L., Korovkina A., Artemkina N., Kozerozhets I., Samarov A. Ultrasound-assisted extraction of phytochemicals from Empetrum hermafroditum Hager. using acid-based deep eutectic solvent: kinetics and optimization. Biomass Convers. Biorefinery. Springer Berlin Heidelberg, 2022, no.0123456789.
11. Paukshta O. I., Cvetov N. S., Petrova V. I. Razrabotka metoda opredeleniya antioksidantnoj aktivnosti ekstraktov na osnove glubokih evtekticheskih rastvoritelej [Development of a method for determining the antioxidant activity of extracts based on deep eutectic solvents]. Trudy Kol'skogo Nauchnogo Centra RAN [Proceedings of the Kola Scientific Center RAS], 2020, vol. 3, no. 4, pp. 142-145.
Информация об авторах
Е. Ю. Пасичник — студентка;
Н. С. Цветов — кандидат химических наук.
Information about the authors
E. Yu. Pasichnik — Student; N. S. Tsvetov — PhD (Chemistry).
Статья поступила в редакцию 14.02.2022; одобрена после рецензирования 04.04.2022; принята к публикации 08.04.2022. The article was submitted 14.02.2022; approved after reviewing 04.04.2022; accepted for publication 08.04.2022.
