Особенности популяционного состава и функциональной активности клеток перитонеальной жидкости у женщин с наружным генитальным эндометриозом Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

© Р. В. Павлов 1, С. А. Сельков 2

1 Ставропольская государственная медицинская академия: кафедра акушерства и гинекологии;

2 НИИ акушерства и гинекологии

им. Д. О. Отта РАМН, Санкт-Петербург

ОСОБЕННОСТИ ПОПУЛЯЦИОННОГО СОСТАВА И ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК ПЕРИТОНЕАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ У ЖЕНЩИН С НАРУЖНЫМ ГЕНИТАЛЬНЫМ ЭНДОМЕТРИОЗОМ

УДК 618.145-007.415-07

■ В статье представлены результаты изучения популяционного состава и цитокинпродуцирующей активности мононуклеарных клеток перитонеальной жидкости больных наружным генитальным эндометриозом. Доказано, что при возникновении и прогрессировании эндометриоза в перитонеальной жидкости больных увеличивается количество макрофагов

и снижается количество CD3, CD4, CD16 и CD25 клеток. Мононуклеарные клетки перитонеальной жидкости больных наружным генитальным эндометриозом in vitro продуцируют достоверно большее количество ИЛ1Р, ИЛ6, ИЛ8 и ФНОа и достоверно меньшее количество ИЛ2 и ИФНу. При этом степень увеличения или снижения продукции цитокинов мононуклеарными клетками перитонеальной жидкости больных эндометриозом зависела не от распространения заболевания, а от пролиферативной активности клеток эндометриоидных гетеротопий.

■ Ключевые слова: эндометриоз; цитокины; иммунология

В последнее время большое значение в патогенезе наружного генитального эндометриоза (НГЭ) отводится иммунной системе. В связи с этим особый интерес представляет изучение особенностей местного иммунитета при этом заболевании, в частности состояние функциональной активности им-мунокомпетентных клеток перитонеальной жидкости [2-15].

Большое количество научных статей, посвященных этой проблеме подчеркивает значимость исследований, проводимых в этом направлении. Однако в доступной литературе нами не было найдено работ, посвященных изучению перитонеального микроокружения больных НГЭ с учетом пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия очагов НГЭ.

Цель исследования

Целью настоящей работы была оценка популяционного состава и функциональной активности иммунокомпетентных клеток перитонеальной жидкости (ПЖ) больных НГЭ в сопоставлении с пролиферативной активностью клеток эндометриоидных гетеротопий и степенью распространения заболевания.

Материал и методы

Активность иммунокомпетентных клеток и клеточный состав ПЖ были исследованы у 150 больных НГЭ, находившихся на лечении в гинекологическом отделении Ставропольского Краевого клинического перинатального центра и Ставропольского Краевого клинического центра оказания специализированных видов медицинской помощи в период с 2003 по 2007 год. Контрольную группу составили 30 практически здоровых женщин, поступивших в вышеуказанные отделения с целью проведения плановой хирургической стерилизации. С помощью клинического обследования и лапароскопии у них были исключены тяжелая экстрагенитальная патология и гинекологические заболевания.

Возраст больных основной группы — 20-35 лет, гормонального лечения НГЭ не получал никто, а на этапе операции ни одна из них не была беременной и не имела внутриматоч-ной спирали.

Всем исследованным пациенткам обеих групп проводилось стандартное предоперационное обследование, включающее общеклинические методы, ультразвуковое исследование органов малого таза, определение уровня СА125 в периферической крови.

Лапароскопия проводилась по общепринятой методике, с использованием оборудования фирмы Karl Storz (Германия). После визуальной ревизии брюшной полости и исключения другой патологии осуществлялся забор ПЖ. Оценивались локализация и цвет эндометриоидных гетеротопий и степень рас-

пространения НГЭ. Эндометриоидные очаги иссекались в пределах здоровых тканей и направлялись на гистологическое исследование.

Оценка степени распространения НГЭ осуществлялась согласно классификации r-AFS (1985); все больные были разделены на две группы: I группа — 86 больных с I—II степенью распространения НГЭ, II группа — 64 больные с III—IV степенью.

Оценка пролиферативной активности клеток эпителия эндометриоидных гетеротопий проводилась согласно критериям, рекомендованным Г. Г. Автандиловым (1996): площадь ядер, плоид-ность клеток и активность областей организаторов ядрышек [1].

Больные II—III степени распространения НГЭ (100 женщин) были разделены на две группы: I группа — 30 больных с красными (активно про-лиферирующими) эндометриоидными гетерото-пиями на брюшине малого таза или их сочетанием с черными, и II группа — 70 женщин с черными гетеротопиями (без признаков активной пролиферации) или их сочетаниями с белыми (регрессирующими). При подборе этих групп на основании морфометрической оценки учитывалось достоверное отличие в снижение показателей пролифера-тивной активности эктопического эндометрия.

Исследование ПЖ включало в себя определение клеточного состава и цитокинпродуци-рующей активности мононуклеарных клеток (МНК) in vitro. Определение состава субпопуляций МНК в ПЖ выполнялось методом проточной цитометрии на проточном цитометре Bio Rad (Brute-HS, США), с использованием антител, конъюгированных с флуоресциинизотиоциона-том и фикоэритрином (Caltag Laboratories, США). Определялось количество CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD25 и CD95 клеток в ПЖ.

Перед органотипическим культивированием выделение МНК из ПЖ осуществляли по методу, описанному A. Boyum (1968). Полученная клеточная суспензия инкубировалась в течение 24 часов при 37 °С и 100 % влажности в атмосфере 5% СО2. После истечения срока культивирования суперна-танты очищали центрифугированием при 400 g, в течение 30 минут, собирали в стерильные пластиковые пробирки типа «Эппендорф» и хранили до тестирования при -40 °С не более 3 месяцев.

Уровень ИЛ8 («ВекторБест», Россия), ИЛф, ИЛ2, ИЛ4, ИЛ6, ФНОа и ИФНу («Протеиновый контур», Россия), в культуральных средах определяли методом твердофазового иммуноферментно-го анализа на планшетном фотометре «Labsystems iEMS Reader MF» (Финляндия), согласно прилагаемым к наборам методикам.

Статистическую обработку полученных данных проводили на компьютере PENTIUM III с

использованием программы «Primer Biostatistic 4.03. for Windows». Для всех показателей определяли средние значения (М), а также стандартную ошибку среднего (m). Для оценки степени достоверности различий между значениями использовался простой критерий Стьюдента (t). Различия между показателями считали достоверными при р < 0,05 и абсолютно достоверными при р < 0,01.

Результаты исследования

Согласно данным иммунологического исследования в ПЖ больных НГЭ наблюдается достоверное увеличение количества иммунокомпетентных клеток по сравнению со здоровыми женщинами. При этом клеточность ПЖ возрастала не только с распространением заболевания, но и при увеличении пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия. Увеличение клеточности ПЖ больных НГЭ происходит преимущественно за счет макрофагов, абсолютное количество которых резко возрастает при возникновении НГЭ и определяется не столько степенью его распространения, сколько пролиферативной активностью эпителия гетеротопий. Абсолютное количество нейтрофи-лов и лимфоцитов в ПЖ больных НГЭ достоверно не отличалось от нормы (табл. 1, 2).

При анализе субпопуляционного состава МНК ПЖ больных НГЭ было установлено снижение абсолютного количества CD3 и CD4 лимфоцитов, степень которого не зависела от распространенности НГЭ и пролиферативной активности эпителия эндометриоидных гетеротопий. Абсолютное количество CD16 и CD25 лимфоцитов в ПЖ больных НГЭ также снижалось по сравнению с нормой, однако степень этого снижения была более выражена у больных с высокой пролиферативной активностью гетеротопического эндометрия и не зависела от распространенности заболевания. Абсолютное количество CD8, CD19 и CD95 лимфоцитов в ПЖ больных НГЭ не претерпевало существенных изменений по сравнению с нормой (табл. 1, 2).

При изучении продукции цитокинов МНК ПЖ больных НГЭ было установлено, что уровень продукции ИЛ1Р, ИЛ6, ИЛ8 и ФНОа не зависел от степени распространенности заболевания и был достоверно выше нормы, при этом продукция этих цитокинов достоверно возрастала у больных с высокой пролиферативной активностью клеток гетеротопий. Подобное изменение продукции ци-токинов может указывать на возрастание функциональной активности перитонеальных макрофагов больных НГЭ, прогрессирующее с увеличением активности клеток эндометриоидных гетеротопий (табл. 1, 2). Кроме этого, все вышеперечисленные цитокины обладают выраженным проангиоген-ным действием, инициируют неоангиогенез, а

Таблица 1

Популяционный состав и цитокинпродуцирующая активность МНК ПЖ больных НГЭ с разной степенью распространения заболевания (М ± т)

Показатели Здоровые женщины (n = 30) Больные НГЭ Достоверность отличий между группами

I—II степень (n = 86) Ш—IV степень (n = 64)

1 2 3

Лейкоциты, х109/л 1,6 ± 0,1 2,3 ± 0,2 2,8 ± 0,1 Р 1-2 < 0,05 Р 13 < 0,001 Р .3 < 0,05

Нейтрофилы, х109/л 0,20 ± 0,01 0,30 ± 0,03 0,30 ± 0,06 -

Макрофаги, х109/л 0,6 ± 0,1 1,3 ± 0,1 1,7 ± 0,1 р 1-2 < 0,001 Р 1 3 < 0,001 Р 2-3 < 0,05

Лимфоциты, х109/л 0,7 ± 0,1 0,6 ± 0,1 0,6 ± 0,1 -

CD3, х109/л 0,50 ± 0,07 0,30 ± 0,04 0,30 ± 0,04 Р 1-2 < 0,05 Р 1-3 < 0,05

CD4, х109/л 0,40 ± 0,02 0,20 ± 0,04 0,30 ± 0,03 Р 1-2 < 0,05 Р 1-3 < 0,05

CD8, х109/л 0,20 ± 0,02 0,10 ± 0,02 0,20 ± 0,03 -

CD16, х109/л 0,20 ± 0,03 0,08 ± 0,01 0,08 ± 0,01 Р 1-2 < 0,001 Р 13 < 0,001

CD19, х109/л 0,20 ± 0,04 0,10 ± 0,01 0,10 ± 0,02 -

CD25, х109/л 0,20 ± 0,03 0,10 ± 0,02 0,10 ± 0,02 Р 1-2 < 0,01 Р 1-3 < 0,01

CD95, х109/л 0,2 ± 0,1 0,10 ± 0,03 0,2 ± 0,1 -

ИЛ1Р, пкг/мл 64,1 ± 3,2 80,8 ± 4,5 82,9 ± 4,1 Р 1-2 < 0,05 Р 1-3 < 0,01

ИЛ2, пкг/мл 49,5 ± 4,1 32,5 ± 3,7 26,6 ± 1,2 Р 1-2 < 0,01 р 1-3 < 0,001

ИЛ4, пкг/мл 37,2 ± 2,3 36,5 ± 1,8 30,9 ± 4,7 -

ИЛ6, пкг/мл 234,6 ± 33,8 2133,0 ± 43,2 2183,0 ± 35,2 Р 12 < 0,001 Р 13 < 0,001

ИЛ8, пкг/мл 528,8 ± 28,4 1246,0 ± 18,9 1254,0 ± 16,2 Р 1-2 < 0,001 Р 13 < 0,001

ФНОа, пкг/мл 78,9 ± 2,4 179,0 ± 17,9 215,1 ± 29,4 Р 1-2 < 0,01 Р 1-3 < 0,01

ИФНу, пкг/мл 39,6 ± 1,0 24,1 ± 2,6 11,7 ± 1,9 Р 1-2 < 0,001 Р 1-3 < 0,001 Р 2-3 < 0,001

ФНОа способствует и имплантации эндометрио-идных клеток на мезотелии брюшины.

Продукция ИЛ4 МНК ПЖ больных НГЭ не зависит от степени распространения заболевания и пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия, достоверно не отличаясь от нормы (табл. 1, 2).

Уровень продукции ИЛ2 и ИФНу МНК ПЖ больных НГЭ был достоверно ниже, чем у здоровых женщин, при этом степень снижения продукции ИЛ2 не зависела от степени распространения заболевания и пролиферативной активности гете-ротопий, а продукция ИФНу достоверно снижалась как при распространении заболевания, так

и при увеличении пролиферативной активности клеток гетеротопического эпителия. Подобные изменения в продукции цитокинов указывают на снижение активности иммунокомпетентных клеток, принимающих участие в реализации неспецифической и специфической противоопухолевой цитотоксичности и регуляции пролиферативных процессов в ПЖ больных НГЭ.

Заключение

Полученные результаты позволяют утверждать, что при возникновении и прогрессировании НГЭ наблюдается увеличение не только количества, но и функциональной активности макрофагов ПЖ.

Таблица 2

Популяционный состав и цитокинпродуцирующая активность МНК ПЖ больных НГЭ в зависимости от пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия (М ± т)

Показатели Здоровые женщины (n = 30) Больные НГЭ Достоверность отличий между группами

I—II степень (n = 86) III-IV степень (n = 64)

1 2 3

Лейкоциты, х109/л 1,6 ± 0,1 2,9 ± 0,1 2,1 ± 0,1 Р 12 < 0,001 Р 1_з < 0,01 p 2-3 < 0,001

Нейтрофилы, х109/л 0,20 ± 0,01 0,30 ± 0,05 0,30 ± 0,04 -

Макрофаги, х109/л 0,6 ± 0,1 1,9 ± 0,1 1,1 ± 0,1 Р 12 < 0,001 Р 1-3 < 0,01 p 2-3 < 0,001

Лимфоциты, х109/л 0,6 ± 0,1 0,5 ± 0,1 0,6 ± 0,1 -

CD3, х109/л 0,50 ± 0,07 0,30 ± 0,04 0,30 ± 0,03 Р 1-2 < 0,01 Р 1-3 < 0,05

CD4, х109/л 0,40 ± 0,02 0,20 ± 0,04 0,30 ± 0,02 Р 12 < 0,001 Р 1-3 < 0,01

CD8, х109/л 0,20 ± 0,02 0,20 ± 0,02 0,20 ± 0,03 -

CD16, х109/л 0,20 ± 0,01 0,06 ± 0,01 0,10 ± 0,01 Р 12 < 0,001 p 13 < 0,001 Р 2-3 < 0,05

CD19, х109/л 0,20 ± 0,04 0,10 ± 0,03 0,10 ± 0,01 -

CD25, х109/л 0,20 ± 0,03 0,10 ± 0,01 0,15 ± 0,01 Р 12 < 0,001 Р 1-3 < 0,01 Р 2-3 < 0,01

CD95, х109/л 0,10 ± 0,03 0,20 ± 0,03 0,10 ± 0,04 -

ИЛ^, пкг/мл 64,1 ± 3,2 89,0 ± 4,0 75,1 ± 3,3 Р 12 < 0,001 Р 1-3 < 0,05 Р 2-3 < 0,01

ИЛ2, пкг/мл 49,5 ± 4,1 29,8 ± 3,9 30,2 ± 2,8 Р 1-2 < 0,001 Р 13 < 0,001

ИЛ4, пкг/мл 37,2 ± 2,3 36,9 ± 1,3 29,9 ± 3,0 -

ИЛ6, пкг/мл 234,6 ± 33,8 2301,0 ± 40,6 1947,0 ± 72,6 Р 12 < 0,001 p 13 < 0,001 Р 2-3 < 0,01

ИЛ8, пкг/мл 528,8 ± 28,4 1560,0 ± 12,2 941,0 ± 11,2 Р 12 < 0,001 Р 1 3 < 0,001 Р 12-33 < 0,001

Увеличение активности макрофагов сопровождается продукцией ими факторов, обладающих не только цитотоксическим действием на клетки опухоли, но и активизирующих процессы ангиогенеза (ИЛф, ИЛ6 и ИЛ8), а также стимулирующих адгезию клеток эндометрия к мезотелию брюшины (ФНОа).

Помимо увеличения активности макрофагов в ПЖ больных НГЭ наблюдается снижение количества Т-хелперов (CD4 лимфоцитов), активированных Т-лимфоцитов (CD25 лимфоцитов) и естественных киллеров (CD16 лимфоцитов), а также нарушается их активность, на что указывает низкий уровень продукции ИЛ2 и ИФНу. Снижение у больных НГЭ в ПЖ количества и функциональной активности иммунокомпетен-

тных клеток, принимающих непосредственное участие в реализации специфической и неспецифической противоопухолевой резистентности, может быть причиной не контролируемого роста эпителия эндометриоидных гетеротопий.

Таким образом, одним из механизмов возникновения и прогрессирования НГЭ может быть дисбаланс в противоопухолевой и ангиогенной активности иммунокомпетентных клеток перитоне-альной жидкости в сторону увеличения последней. Дополнительным подтверждением данного предположения можно считать усугубление описанной иммунологической дисфункции при увеличении пролиферативной активности клеток гетеротопи-ческого эндометрия и распространении НГЭ.

Литература

1. Автандилов, Г. Г. Компьютерная микротелефотометрия в диагностической гистоцитопатологии / Г. Г. Автандилов — М.: РМАПО, 1996. — 256 с.

2. Адамян, Л. В. Эндометриозы: руководство для врачей / Л. В. Адамян, В. И. Кулаков, Е. Н. Андреева. — 2-е изд., перераб. и доп. — М.: Медицина, 2006. — 416 с.

3. Анциферова, Ю. С. Роль цитокинов перитонеальной жидкости в развитии наружного генитального эндометрио-за и бесплодия, ассоциированного с эндометриозом / Ю. С. Анциферова, Л. В. Посисеева, А. Л. Шор // Акуш. и гин. — 2003. — № 1. — С. 41-44.

4. Махмудова, Г. М. Роль некоторых факторов перитонеальной жидкости в патогенезе эндометриоза / Г. М. Махмудова, А. В. Попов // Российский вестник акушерства и гинекологии. — 2004. — № 2. — С. 27-30.

5. Савицкий, Г. А. Перитонеальный эндометриоз и бесплодие (клинико-морфологические исследования) / Г. А. Савицкий, С. М. Горбушин. — СПб.: ЭЛБИ-СПб, 2002. — 170 с.

6. Сельков, С. А. Локальная продукция цитокинов у пациенток с наружным генитальным эндометриозом / С. А. Сельков, Н. Л. Крамарева, О. В. Павлов, М. И. Ярмолинская // Ж. акуш. и жен. болезн. — 2002. — Т. LI, Вып. 3. — С. 57-62.

7. Сельков, С. А. Особенности локальной продукции интерлейки-нов и ростовых факторов при наружном генитальном эндо-метриозе / С. А. Сельков, Н. Г. Солодовникова, О. В. Павлов, Д. А. Ниаури // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2005. — Т. 139, № 4. — С. 439-442.

8. Системные и локальные уровни регуляции иммунопатоге-нетических процессов у пациенток с наружным генитальным эндометриозом / С. А. Сельков, М. И. Ярмолинская, О. В. Павлов [и др.] // Ж. акуш. и жен. болезн. — 2005. — Т. LIV, № 1. — С. 20-28.

9. Исследование цитокинового профиля и ангиогенного потенциала перитонеальной жидкости больных с наружным генитальным эндометриозом / Д. И. Соколов, Н. Г. Солодовникова, О. В. Павлов [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2005. — Т. 140, № 11. — С. 552-555.

10. Солодовникова, Н. Г. Исследование in vitro особенностей секреции цитокинов при наружном генитальном эндометрио-зе (НГЭ) / Н. Г. Солодовникова, О. В. Павлов, С. А. Сель-ков, Д. А. Ниаури // Мед. иммунология. — 2004. — Т. 6, № 3-5. — С. 390.

11. Особенности продукции цитокинов иммунокомпетен-тными клетками перитонеальной жидкости у женщин

с наружным генитальным эндометриозом / Г. Т. Сухих, Н. Ю. Сотникова, Ю. С. Анциферова [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2004. — Т. 137, № 6 — С. 646-649.

12. Different concentrations of interleukins in the peritoneal fluid of women with endometriosis: relationships with lymphocyte subsets / A. Gallinelli, G. Chiossi, L. Giannella [et al.] // Gynecol. Endocrinol. — 2004. — Vol. 18, N 3. — P. 144-151.

13. Dmowski,P. W. Immunology of endometriosis / P. W. Dmowski, D. P. Braun // Best. Pract. Res. Clin. Obstet. Gynecol. — 2004. — Vol. 18, N 2. — P. 245-263.

14. Pathogenesis of endometriosis / A. W. Nap, P. G. Groothuis, A. Y. Demir [et al.] // Best Pract. Res. Clin. Obstet. Gynecol. — 2004. — Vol. 18, N 2. — P. 233-244.

15. Seli, E. Pathogenesis of endometriosis / E. Seli, M. Berkkanoglu, A. Arici // Obstet. Gynecol. Clin. North Am. — 2003. — Vol. 30, N 1. — P. 41-61.

Статья представлена М. И. Ярмолинской НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН,

Санкт-Петербург

PECULIARITIES OF POPULATION STRUCTURE AND FUNCTIONAL ACTIVITY OF PERITONEAL FLUID CELLS AT WOMEN WITH EXTERNAL GENITAL ENDOMETRIOSIS

Pavlov R. V., Selkov S. A.

■ Summary: This article represents research results of population structure and cytokine-producing activity of peritoneal fluid mononuclear cells at patients with external genital endometriosis. It was proved that endometriosis onset and dissemination are accompanied by quantity increasing of macrophages and decreasing of CD3, CD4, CD16 and CD25 cells. Peritoneal fluid mono-nuclear cells at patients with external genital endometriosis in vitro produce for certain more ILip, IL6, IL8 and TNFa and less IL2 and IFNy. At the same time increasing and decreasing degree of cytokine production by peritoneal fluid mononuclear cells at patients with external genital endometriosis did not depend on dissemination of disease, but was mediated by cell proliferative activity of endometrioid heterotopias.

■ Key words: endometriosis; cytokines; immunology