CC BY
128
О.А. Голованова
ОСОБЕННОСТИ ПАТОГЕННОГО МИНЕРАЛООБРАЗОВАНИЯ В ОРГАНИЗМЕ ЧЕЛОВЕКА
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 06-05-65165).
На основе обобщения обширного экспериментального и теоретического материала рассмотрен комплекс проблем, связанных с особенностями генезиса почечных, желчных, зубных и слюнных камней - основных патогенных образований в организме человека. Выявлены отличия состава патогенных биологических сред (желчь, ротовая жидкость) от находящихся в норме и установлены связи между характеристиками камнеобразущих сред и фазовым составом патогенных образований. Показано, что патогенное фазообразование в организме человека крайне неравновесно. Установлена особая роль апатита как наиболее стабильной фазы, встречающейся практически во всех камнях. Выявлено избирательное влияние неорганических (фосфат-, карбонат-анионы и катионы магния) и органических (оксалат-анионы, аминокислоты) компонентов физиологического раствора на образование основных фаз уролитов. Установлено сильное воздействие компонентов камнеобразующей среды на кинетику кристаллизации уевеллита и гидроксилапатита.
Омский регион является крупным промышленным и административно-территориальным центром. Сейчас в Омске функционирует около 470 промышленных организаций, среди которых по объему выбросов вредных веществ 55-62% (от суммарного выброса) приходится на предприятия электроэнергетики, 25-28% - на нефтеперерабатывающую промышленность, около 3-5% -на химию и нефтехимию (табл. 1).
С неблагоприятным состоянием атмосферного воздуха и плохим качеством питьевой воды связан общий
рост числа заболеваний органов дыхания, желудочнокишечного тракта, травм и отравлений, мочеполовой, костной, кровеносной и нервной систем, патогенных минералообразований (табл. 2).
Поскольку суммарным показателем информации о внешнем воздействии на организм человека и ответной реакции на него выступают минералы патогенного характера, важно выявить особенности состава патогенных образований различной локализации в зависимости от местных природных и техногенных факторов среды обитания.
Т а б л и ц а 1
Динамика выбросов загрязняющих веществ в атмосферу от стационарных источников г. Омска (основные отрасли промышленности)
Наименование отрасли 2001 г. 2002 г. 2003 г. 2004 г. 2005 г. 2006 г.
Электроэнергетика 58,0 55,5 58,7 60,3 61,7 60,7
Нефтеперерабатывающая 25,0 27,8 26,8 24,8 25,3 26,4
Химическая и нефтехимическая 3,4 3,9 4,2 4,8 4,2 4,1
Машиностроение и металлообработка (в т.ч. оборонная) 3,6 3,7 4,0 2,6 2,0 1,4
Прочие 10,0 9,1 6,3 7,5 6,8 7,4
Всего по г. Омску, тыс. т 292,9 20,3 198,6 197,7 200,5 192,0
Т а б л и ц а 2
Заболеваемость населения по основным классам болезней на 100 тыс. человек
Заболевания 2001 г. 2002 г. 2003 г. 2004 г. 2005 г. 2006 г.
Инфекционные 4,4 4,2 4,2 4,8 4,8 4,5
Новообразования 0,6 0,6 0,7 0,6 0,8 0,8
Нервной системы 1,8 1,8 1,7 1,7 1,8 1,9
Системы кровообращения 1,8 1,9 2,1 2,2 2,4 2,5
Органов дыхания 27,2 29,4 31,6 31,4 31,2 31,0
Органов пищеварения 7,2 7,4 8,3 8,6 9,4 9,4
Костной системы 3,0 2,8 3,1 3,2 3,3 3,6
Мочеполовой системы 3,9 4,3 4,2 4,3 4,5 4,7
Травмы, отравления 8,9 7,9 8,2 8,2 8,6 8,5
Всего по г. Омску 72,0 74,4 79,1 80,3 84,1 83,8
Патогенные агрегаты генетически являются «болезнями» организма. К ним относятся камни мочевой системы, желчного пузыря, зубные и слюнные камни и некоторые другие. Состав этих агрегатов различен. Трудности изучения патогенных минералов связаны, в первую очередь, со сложным вещественным и элементным составом камней, являющихся органоминеральными агрегатами (ОМА), содержащими как минеральную (часто очень плохо окристаллизованную), так и органическую компоненты, которые очень трудно разделить. Кроме того, механизмы образования и роста
кристаллических фаз, входящих в состав камней, связанные со сложным взаимодействием живого и косного вещества, на данный момент изучены недостаточно и являются дискуссионными.
Для того чтобы продвинуться в направлении понимания закономерностей генезиса мочевых, желчных и других камней в организме человека, необходимо более детально изучить их вещество, привлекая широкий круг современных инструментальных методов, а для установления особенностей образования и роста кристаллических фаз, входящих в их состав, активно ис-
пользовать методы теоретического и экспериментального моделирования. Исследования такого рода в настоящее время ведутся во многих научных центрах; они нашли широкое отражение в ряде работ отечественных исследователей, таких как А.А. Кораго, Н.П. Юшкин, В.И. Каткова, А.К. Полиенко, О.Л. Тик-тинский, Н.А. Пальчик, Т.Н. Мороз, С.С. Потапов, Э.В. Сокол, В.М. Билобров и др. Состав и строение патогенных биоминералов изучали зарубежные исследователи К. Лонсдейл, Д. Сьютор, H.A. Lowenstam, Sh. Weiner, M.A.E. Wandt, L.G. Underhill, V.R. Kodati, A. Hesse, G. Sanders, Ф.В. Зузук, С.В. Кадурин и др., но до окончательного решения проблемы еще далеко.
Обобщение и критический анализ накопленных знаний по вещественному составу и гипотезам образования патогенных агрегатов в организме человека показали, что накопленный фактический материал, полученный на разных этапах развития биоминералогии, не является полным и требует уточнения, систематизации и переосмысления. Представления о механизмах образования камней находятся на уровне гипотез и являются дискуссионными.
Представляемая работа посвящена биоминералогии мочевых, желчных, зубных и слюнных камней камнеосновных патогенных органоминеральных агрегатов, образующихся в организме человека.
Ценность данной работы заключается в изучении современными физико-химическими методами ОМА, определении условий, способствующих формированию данных объектов, а также установлению основных факторов, провоцирующих патогенное минералообразование в организме человека. Полученные результаты могут быть использованы специалистами, занимающимися проблемами патогенного биоминералообразования в организме человека.
В настоящей работе исследование основных моментов патогенного минералообразования в организме человека проведено на основе комплексного подхода, включающего детальное изучение основных патогенных органоминеральных агрегатов (мочевых, желчных, зубных и слюнных камней) и соответствующих камнеобразующих сред с использованием широкого круга современных инструментальных методов, а также привлечение теоретического и экспериментального моделирования. Коллекция камней, удаленных по медицинским показаниям в процессе лечения жителей Омска и Санкт-Петербурга, состояла из уролитов (241), холио-литов (185), дентолитов (69) и саливолитов (10).
Желчь как камнеобразующая среда. Проведено количественное определение основных органических компонентов операционной желчи жителей Омского региона. Установлено, что концентрация главного компонента желчи - желчных кислот (стабилизаторов холестерина) - для 25% проб ниже нормы, для 12,5% - в норме, для 62,5% - выше нормы; концентрация холестерина, фосфолипидов и триглицеридов для всех проб выше нормы (для холестерина в среднем в 11 раз); содержание билирубина для 18,7% проб ниже нормы, а для 81,3% - повышено относительно нормы. Таким образом состав патогенной желчи не соответствует норме; в большинстве случаев содержание основных органических компонентов превышает её.
Для подтверждения литогенных свойств проанализированной желчи для всех проб по полученным данным о её составе различными способами были рассчитаны индексы литогенности (ИЛ), являющиеся критериями устойчивости желчи к коагуляции. Оказалось, что все значения ИЛ не соответствуют норме, что подтверждает патогенные свойства анализируемой желчи. При оценке содержания белковой компоненты в исследуемых пробах операционной желчи было определено количество общего азота. Оказалось, что его содержание находится в диапазоне от 1,50 до 1,80 мас.%, что ~ в 3 раза превышает содержание азота в желчи здорового человека (0,48 мас.%). Увеличение доли общего азота, вероятно, связано с возрастанием содержания в патогенной желчи не только аминокислот, но и таких азотсодержащих органических соединений, как билирубин и фосфолипиды. Содержание большинства неорганических компонент в патогенной желчи также повышено, а именно массовая доля натрия в 1,2 раза превышает его содержание в норме, фосфора и калия -в 1,5, кальция - в 2,5, магния - в 4,5; содержание железа в 3,5 раза меньше нормы. Известно, что катионы кальция выполняют цементирующую роль в процессе нуклеации холестерина и преципитируют из желчи в виде карбонатов, пальмитатов и фосфатов. Таким образом, установленные отклонения элементного и вещественного состава патогенной желчи, по-видимому, приводят к нарушению её коллоидной структуры, что способствует коагуляции холестерина и образованию камней.
В виду того что минеральный состав холелитов представлен преимущественно холестерином, для обнаружения других слагающих желчных камней необходимо было предварительно провести извлечение холестерина из образца. Использование разработанной методики поэтапного экстракционного разделения компонентов желчных камней [1] позволило, кроме безводного холестерина С27Н460, обнаружить в исследуемых образцах следующие дополнительные фазы: карбонаты кальция СаС03 (фатерит, арагонит и кальцит), фосфат кальция витлокит Са3(Р04)2 и ряд орагнических соединений -билирубин (С33Н36О^4), натриевая соль желчной кислоты (С21Н37 = С0МНСН2С00№). В двух «черных камнях» холестерин практически отсутствует. Они состоят из билирубина и пальмитата кальция С15Н31(С00)2Са, т.е. относятся к пигментным.
В составе желчных камней идентифицировано более 36 элементов, доля которых колеблется в диапазоне от 10-5 до 2 мас.%. Процентное содержание элементов от общей их массы убывает в следующем порядке: Са, К, Мп, Бе, Си, РЬ, Т1, 2п, V, N1, В1, Сг, Н§. Содержание кальция составляет 95 мас.%, затем следует калий (более 3 мас.%), замыкают ряд хром и ртуть, на долю которых приходится около 0,02 мас.%. Увеличение содержание кальция в патогенной желчи способствует образованию холиолитов, содержащих карбонаты кальция и билирубинат кальция, которые являются основной фазой пигментных камней. По концентрации марганца, железа и меди в исследуемой коллекции выделяются три группы образцов (1) Бе > Си > Мп; 2) Мп > Бе > Си; 3) Си > Бе > Мп). Кроме того, обнаружены единичные желчные камни, в которых среднее
значение отдельных элементов резко завышено: свинца - в 50 раз; ртути - в 12, меди - в 290, железа - в 59 раз. Возможно, что повышенное содержание этих элементов в отдельных желчных камнях связано с экологической обстановкой в Омском регионе [2, 3].
Моча как камнеобразующая среда. В моче здорового человека идентифицировано более двух десятков неорганических и органических соединений. К патологическим компонентам мочи можно отнести глюкозу, белок, кетоновые тела, кровь. Кроме того, при образовании мочевых камней в физиологическом растворе повышается содержание неорганического фосфора (>75 ммоль/л), общего кальция (>7 ммоль/л), магния (>5 ммоль/л), щавелевой кислоты (>0,25 ммоль/л) и мочевой кислоты (>4 ммоль/л). В моче здорового человека содержатся следы белка, не определяемые обычными качественными реакциями. При болезнях почек и ряде других заболеваний выделение белков с мочой возрастает. Среднесуточное значение рН мочи здорового человека лежит в области 5,5-6,5. При оксалатном литиазе рН изменяется в течение суток в интервале 4,8-7,0; при уратном - 4,5-5,8; при фосфатном -6,0-7,7 (Тиктинский, 2000). Таким образом, моча - это сложный многокомпонентный раствор. Основными факторами, влияющими на процесс патогенного минералооб-разования в мочевой системе, являются химический состав и водородный показатель мочи.
В настоящее время в составе мочевых камней идентифицировано 29 минералов, из которых большинство
являются солями кальция. В камнях исследуемой коллекции идентифицировано 11 соединений. Наиболее часто встречаются оксалаты: уевеллит СаС204 (1+х) х х Н20 (х ~ 0,00-0,07) и уедделлит СаС204 (2+х)Н20, (х ~ 0,13-0,37); фосфаты: струвит MgNH4P04•6H20, гидроксилапатит Са5(Р04)3(0Н), брушит СаНР04^2Н20 и витлокит Са3(Р04)2; ураты: урикит C5H4N403, дигидрат мочевой кислоты С5Н^403-2Н20, урат аммония C5H203N4(NH4)2. В 5% образцов обнаружен редкий для почечных камней кварц Б102, в одном камне (вместе с кварцем) впервые встречен силикат кальция хатрурит Са3Б105. Частота встречаемости минералов в мочевых камнях различных регионов варьирует. Всегда преобладают оксалатные камни (45-75%), далее следуют фосфатная (20-40%) и уратная (10-20%) группы [1].
Большинство исследованных уролитов имеют слоистую, часто тонкозональную, структуру с чередованием как минеральных и органических слоев, так и слоев различного минерального состава. Слоистость удается наблюдать на разных уровнях исследования, как при визуальном изучении срезов крупных камней (рис. 1), так и на электронномикроскопических снимках отдельных участков образцов (рис. 2).
Впервые обнаружены основные типы локализации органических веществ белковой природы: ядерная (в центре агрегата), прослоечная (концентрические и лучевые прослойки), диффузная (в виде вкраплений в кристаллы минералов).
Рис. 1. Слоистая структура фосфатно-оксалатного почечного камня: срез (1,5 крат)
Как правило, в мочевых камнях фиксируются одновременно все типы локализации органического вещества с заметным преобладанием одного их них. Практически во всех исследованных уролитах методом сканирующей электронной микроскопии установлено проявление микрогетерогенности. В оксалатных и струвитных камнях (мономинеральных по данным РФА) выявлены зерна апатита (4-5 мкм); в фосфатных и уратных обнаружены отдельные кристаллики уевел-лита (размером 150-200 мкм). Результаты кластерного анализа показали, что почечные камни различного минерального состава - оксалатные, фосфатные и урат-ные - отличаются по содержанию таких элементов, как Са, Р, Mg, N8, К, 8, Б (более 0,1 мас.%), а также 8г, 2п, Ва, Си, Вг, РЬ, 8Ь, 2г, ЯЬ (менее 0,1 мас.%). Для камней смешанного фосфатно-оксалатного и уратно-оксалатного состава данная дифференциация носит размытый
Рис. 2. Зональное распределение слоев струвита (темные) и апатита (белые) под электронным микроскопом
характер. Максимальное число микроэлементов (Б, К, Бг, 2п, Ва, 2г, БЬ, ЯЬ) тяготеет к фосфатной группе, что можно объяснить их изоморфным вхождением в кристаллические структуры фосфатов, в первую очередь, гидроксилапатита.
Ротовая жидкость как камнеобразующая среда. Проведено количественное определение главных компонентов ротовой жидкости (смешанной слюны) 250 жителей Омска, относящихся к четырем группам (табл. 3). В ротовой полости членов трех испытуемых групп (кроме контрольной) присутствовали зубные камни.
Достоверное изменение параметров слюны (по сравнению с контрольной группой) зафиксировано у лиц, принимающих лекарственные препараты и подверженных кариесу. В ротовой жидкости членов этих групп выявлено увеличение концентрации ионов калия, натрия, понижение содержания белка, неорганического
фосфора, а также как понижение, так и повышение рН относительно нормы. В составе органической составляющей ротовой жидкости жителей г. Омска определено 15 аминокислот; их среднее суммарное содержание составляет 0,34 мас.%, что меньше, чем в ротовой жидкости в норме. Кроме того, в ротовой полости всех пациентов, у которых присутствовали зубные камни, обна-
В составе исследованных зубных и слюнных камней обнаружены различные фосфаты кальция: апатит, бру-шит, октакальций фосфат Са8Н2(Р04)6 • 5Н20, витлокит. Самым распространенным минералом является апатит. Как известно, минеральная компонента твердых тканей зуба (эмаль, дентин) представлена только апатитом. Таким образом, минеральный состав образующихся в полости рта патогенных образований (зубные и слюнные камни) более разнообразен, чем физиогенных. Различные диапазоны изменений параметров кристаллической решетки физиогенных и патогенных биоапатитов отражают тот факт, что механизм образования твердых тканей зуба полностью контролируется организмом, а формирование ОМА вызвано аномальными изменениями параметров камнеобразующей среды.
Для зубных и слюнных камней также характерно концентрически-слоистое строение, проявляющееся на разных уровнях. Обычно слои неорганического вещества разделяются более тонкими слоями органического вещества. Установлено, что большинство исследованных камней имеют один центр, от которого происходило их разрастание, встречаются также камни с несколькими центрами (ядрами), вокруг которых формируются концентрические слои. Ряд средних концентраций (мас.%) химических элементов в зубных камнях (2п > Бе > Си > N1 > Мп) практически совпадает с соответствующим рядом для ротовой жидкости. Это указывает на то, что аминокислоты, легко образующие комплексы с соответствующими тяжелыми металлами, извлекаются из общего кругооборота аминокислот. При этом происходит нарушение связи ионов кальция с белковыми коллоидами, находящимися в слюне, в результате чего освободившиеся ионы кальция связываются с фосфат-ионами, что приводит к образованию нерастворимых фосфатов кальция, являющихся основными компонентами зубных и слюнных камней.
Онтогенетические закономерности. Изучение структурно-текстурных особенностей исследуемых патогенных агрегатов показало, что их образование протекает стадийно. Характерной особенностью многих мочевых, зубных и слюнных камней являются пе-
ружено повышенное содержание ряда микроэлементов (конц. порядка 0,5 мг/л): Бе, Мп, N1, А1, 2п и Си. Выявлено различие картин микрокристаллизации слюны здоровых людей (контрольная группа) и лиц, длительное время работающих на компьютере; предложен способ оценки состояния ротовой полости человека после длительного воздействия компьютерной нагрузки [4].
рерывы в процессе их роста. Нередко отмечается растворение образовавшихся ранее слоев, в результате чего вновь возникающие слои перекрывают несколько зон «с несогласием». Применение метода рентгеновской компьютерной микротомографии позволило выявить скрытые плотностные аномалии - понижения плотности, которые также указывают на изменения обстановки формирования уролитов, дентолитов и саливолитов. В целом полученные данные свидетельствует об очень сложных переменных условиях камнеобразования, когда рост камней неоднократно сменялся их растворением. Уролиты исследуемой коллекции, состоящие из уевеллита, уедделита или урикита, имеют, как правило, сферолитовое (рис. 3) или дендритное строение. Развитие сферолитов происходит вследствие интенсивного расщепления кристаллов; сферолиты часто сложены одним минералом. Сферолито-вая структура агрегатов свидетельствует о прямой кристаллизации компонентов камня с зарождением на инициирующих центрах. При этом возможна кристаллизация метастабильной фазы (уедделлита) с последующим её замещением на уевеллит. При изучении шлифов выявляется изменение интенсивности отложения вещества при росте сферолитовых агрегатов с повторными зарождениями сферолитов. Границы роста в местах соприкосновения сферолитов формируют сложную систему пустот (кавернозность агрегатов).
Зернистая структура фосфатных камней (уролитов, дентолитов и саливолитов) указывает на то, что формирование этих ОМА обусловлено в основном седиментацией и агломерацией мелкозернистого или аморфного материала (рис. 4). Собственно кристаллизация в этом случае имеет подчиненное значение, участвуя в формировании второстепенных минералов с более высокой растворимостью (оксалаты, струвит и брушит). Характерные для уролитов камни смешанного типа имеют слоистое строение, в котором чередуются зернистые и сферолитовые агрегаты. Такие камни образуются в наиболее неравновесных условиях в результате чередования процессов кристаллизации и седиментации. Слоистое строение в камнях сферолитового типа фиксируется более четко, чем в зернистых камнях. В целом выявленные закономерно-
Т а б л и ц а 3
Сравнительная характеристика электролитного состава ротовой жидкости жителей г. Омска
Показатель ротовой жидкости Группа пациентов
контрольная принимающая лекарственные препараты подверженная компьютерной нагрузке кеариесподверженная
рН 6,80±0,11 7,04±0,02 6,75±0,35 6,59±0,09
С (№+), г/л 0,30±0,04 0,38±0,08 0,31±0,12 0,32±0,06
С (К+), г/л 0,72±0,05 1,15±0,03 0,77±0,25 1,08±0,32
Общий кальций, г/л 0,051±0,004 0,057±0,005 0,049±0,013 0,05±0,01
Фосфор, г/л 0,16±0,01 0,20±0,02 0,15±0,05 0,19±0,05
Белок, мг/мл 1,73±0,24 1,33±0,06 1,69±0,07 1,68±0,75
Примечание. Приведенные доверительные интервалы соответствуют Р = 0,95.
сти онтогении мочевых, слюнных и зубных камней хорошо согласуются между собой и дополняют полученные
Рис. 3. Микрофотографии шлифа оксалатного камня -сферолиты уевеллита ~100%
Большинство желчных камней являются концентри-чески-зональными сферолитами. Они имеют периферическую тонкослоистую оболочку и более грубую зональность в центральных и промежуточных областях. Обмен веществ и периодическая выработка желчи способствуют формированию концентрических зон различной окраски. Сферолитовое строение холестериновых камней с радиальной, крупнокристаллической, веероподобной структурой указывает на их формирование из истинных растворов. При этом зональное распределение окраски камня дает основание полагать, что один и тот же камень может поочередно формироваться как из истинного раствора желчи, так и из коллоидного, обогащенного билирубинатом. Можно предположить, что желчь в пузыре периодически переходит из состояния истинного раствора в коллоидное. Таким образом, для камней, минеральная компонента которых состоит из органических соединений (оксалатные и мочекислые уролиты, холестериновые холелиты), характерна сферо-литовая структура и прямой рост фаз из пересыщенных растворов. Для фосфатных камней (фосфатные уролиты, дентолиты и саливолиты) характерно зернистое скрытокристаллическое строение и образование путем осаждения вещества (седиментации).
Далее рассмотрим результаты моделирование в прототипах биологических жидкостей. Синтез одноводного оксалата кальция из водных растворов в условиях, приближенных к физиологическим (рН = 4,5; 6,0; 7,5; ионная сила - 0,3), показал, что на образование данной фазы не влияют такие факторы, как рН раствора, температура и введение в систему неорганических и органических добавок, характерных для физиологического раствора [5]. Путем определения периодов индукции - времени образования первых кристаллов в растворах без добавок - изучено влияние пересыщения на зародышеобразование одноводного оксалата кальция. Время индукции обратно пропорционально скорости зародышеобразования, которая в свою очередь выражается экспоненциальной функцией пересыщения, включающей в качестве параметра поверхностную энергию (с) на границе «кристалл - раствор». Определенные по величине наклона значения поверхностной
ранее по уролитам результаты А.К. Полиенко, В.И. Катковой, Ф.В. Зузуком и др.
Рис. 4. Микрофотографии шлифа струвит-апатитового мочевого камня - зернистая структура
энергии в интервалах пересыщений 5-15 и 15-25 составляют соответственно 36,4 и 20,7 кДж/м2. Такое поведение времени индукции обычно трактуется как переход от гетерогенного зарождения при малых пересыщениях к гомогенному при больших. При этом меньшее значение поверхностной энергии является «эффективным», отражающим адгезию зародыша на активном центре. Из полученных кондуктометриче-ским методом кинетических кривых следует монотонное увеличение степени полноты протекания кристаллизации уевеллита во времени (а = (С0-С) / (С0-С8), С0 - концентрация вещества в пересыщенном растворе, С - его растворимость). Изучение влияния ионной силы среды на кристаллизацию одноводного оксалата кальция показало, что при ионной силе, равной 0,3 (соответствующей физиологическому раствору), кристаллизация в растворе с пересыщением у = 7 не происходит и начинается лишь при увеличении пересыщения до у = 10. Полученные результаты можно объяснить тем, что в растворах с большой ионной силой велико влияние электростатических сил отталкивания, действующих между одноименными ионами, что сказывается на снижении способности катионов кальция и окса-лат-анионов к химическим взаимодействиям, а следовательно, и к образованию зародышей. Эксперименты по изучению роли катионов магния при кристаллизации моногидрата оксалата кальция также выявили их сильное ингибирующее действие. Дисперсионный анализ показал, что при добавлении в раствор, имеющий пересыщение у = 7, катионов магния в концентрации
С = 10-3 моль/л средний размер кристаллов уменьшается в 2,5 раза, т.е. происходит очень сильное торможение их роста. Увеличение концентрации катионов магния до СМё = 10-2 моль/л (физиологическая концентрация) приводит к усилению ингибирующего эффекта, кристаллизация уевеллита при данном пересыщении (у = 7 ) вообще не происходит. Образование кристаллов данной фазы при физиологической концентрации катионов магния в растворе начинается лишь при увеличении пересыщения до у = 20. Таким образом,
присутствие ионов магния оказывает существенно больший ингибирующий эффект на кристаллизацию уевеллита, чем ионная сила. При внесении кристаллов гидроксилапатита (размером 4,29±0,06 мкм) в раствор оксалата кальция (у = 7, рН=6,5) средний размер кристаллов моногидрата оксалата кальция существенно возрастает: от 6,38± 0,19 мкм в растворе без добавок до 14,14 ± 0,29 мкм. Таким образом, установлено, что присутствие в растворе кристаллов гидроксилапатита инициирует процесс кристаллизации моногидрата оксалата кальция. По-видимому, кристаллы апатита выступают в качестве зародышей гетерогенной нуклеации уевеллита.
Синтез гидроксилапатита из растворов, моделирующих биологическую жидкость (рН=4,5; 6,0; 7,5; ионная сила - 0,3) в присутствии оксалат-ионов
Эту закономерность можно объяснить исходя из неполной компенсации зарядов в нестехиометрических гидроксилапатитах Саю-х(РО4)6-х(ИРО4)х[ОН2-х(Н2О)х]. Возможно также, что отрицательный заряд поверхности частиц обусловлен частичной диссоциацией в растворе поверхностных гидрофосфатных групп с отщеплением иона водорода. Положительный заряд частиц гидроксилапатита со стехиометрическим соотношением Са/Р также можно объяснить неполной компенсацией положительного заряда при уменьшении дефицита кальция в структуре. Однако, возможно, это связано с адсорбцией на поверхности частиц ионов Са2+, находящихся в растворе в избытке. Последнее предположение согласуется с правилом Фаянса-Панета, согласно которому потенциалопределяющими ионами в мицеллах, существующих в растворах, являются ионы, входящие в состав частиц. Дисперсионный анализ показал, что по мере увеличения соотношения Са/Р в твердой фазе и соответственно в исходном растворе, из которого осуществлялся синтез, происходит увеличение среднего диаметра частиц гидроксилапатита (от 17,30 до 28,35 мкм). При этом при последовательном переходе к более высоким значениям соотношения Са/Р увеличивается степень бимодальности кривой распределения, что можно связать с возрастанием агрегации частиц. Это, в свою очередь, может быть объяснено уменьшением заряда частиц полученных золей (табл. 4), в результате чего происходит уменьшение сил электростатического отталкивания между частицами, приводящее
(0,23 ммоль/л) и других добавок, являющихся компонентами биологического раствора [4], показал, что увеличение концентрации катионов магния (выше 8,2 ммоль/л) приводит к образованию струвита; избыток карбонат-ионов (выше 50 ммоль/л) - к осаждению кальцита; присутствие оксалат-ионов и аминокислот не влияет на фазовый состав полученного осадка.
Изучение электрокинетических свойств синтезированных гидроксилапатитов (знака заряда, электрофоретической подвижности и ^-потенциала) показало (табл. 4), что заряд и значение ^-потенциала частиц гидроксилапатита зависят от его стехиометрии (атомного соотношения Са/Р), при этом наблюдается закономерное смещение ^-потен-циала частиц в положительную область при приближении данного соотношения к стехиометрическому (1,67).
к увеличению степени их агрегации. Именно на агрегации частиц и основан «седиментационный» механизм формирования фосфатных камней.
Как отмечают некоторые исследователи, сложность изучения кристаллизации биоминералов обусловлена наличием в биологических системах большого числа факторов, по-разному влияющих на протекание процесса. При этом большое влияние на характер процесса оказывают органические вещества [1], в частности белковой природы, являющиеся компонентами биологической жидкости. Роль белковой компоненты в патогенном минералообразовании в организме человека изучали путем поиска связей между органической и минеральной компонентами ОМА и проведения экспериментов по влиянию аминокислот на кристаллизацию основных фаз уролитов (уевеллита и гидроксилапатита).
С использованием оригинальной методики отделения белковой компоненты [6] показано, что среднее содержание водорастворимых органических веществ с пептидной связью варьирует в уролитах в зависимости от их минерального состава и составляет 1,4-3,8 мас.% Различные по минеральному составу уролиты по содержанию аминокислот можно ранжировать в следующий ряд: уратные > уратно-оксалатные > фосфатные > фосфатно-оксалатные > оксалатные. Кластерный анализ выявил три группы уролитов (уратную, фосфатную, оксалатную), отличающиеся качественным и количественным набором аминокислот (рис. 5).
Т а б л и ц а 4
Электрокинетические свойства частиц золя гидроксилапатитов с различным соотношением Са/Р в присутствии аминокислот (I = 0,3, pH = 6,5, Сак = 0,004 М)
Атомное соотношение Са/Р Аминокислота Знак заряда частиц Электрофоретическая подвижность, см Ç-потенциал, мВ
1,58±0,01 - - 2,1-10-4 -28,6
Глицин (Gly) + 1,2-10-4 +16,3
Аспарагиновая (Asp) - 1,0-10-4 -22,2
Глутаминовая (Glu) - 1,6-Ю-4 -13,8
Лизин (Lys) + 2Д-10-4 +28,3
1,65±0,01 - - 5,9-10-5 -8,0
1,67±0,01 - + 5,410-5 +7,4
Глицин (Gly) - 8,7-10-5 -11,7
Аспарагиновая (Asp) - 1,2-10-4 -17,0
Глутаминовая (Glu) - 1,2-Ю-4 -16,5
Лизин (Lys) + 5,410-5 +7,2
;
•
1 :
' І ' 1
Тгр Не 1г Зег 61у АІа ¥а1 Ме1 1_еи 61л Рго Рііе Ьуз Агд Аминокислоты
-о- Кластер 1 -О' Кластер 2 ■■■»■■ Кластер 3
Рис. 5. Средние значения содержания аминокислот в мочевых камнях, принадлежащих к различным кластерам:
1 - оксалаты; 2 - фосфаты; 3 - ураты
Результаты определения аминокислот в различных патогенных образованиях (уролиты, дентолиты и сали-волиты), показали, что содержание в них глутамина и лизина больше, чем других аминокислот. Отличительной особенностью данных аминокислот является наличие в их составе дополнительных боковых функциональных групп (аминогруппы - в лизине, карбоксильного остатка - в глутаминовой кислоте), что позволяет им активно участвовать в образовании ОМА. Данное предположение подтверждается результатами экспериментов по кристаллизации уевеллита и апатита в присутствии аминокислот.
Влияние аминокислот на кристаллизацию уе-веллита. В качестве испытуемых были выбраны аминокислоты, характеризующиеся относительно высоким содержанием как в почечных камнях фосфатного типа, так и в моче.
Значения рН (6,45±0,05), ионная сила (0,3) и концентрации аминокислот (0,004 моль/л) в модельных растворах были близки к среде, в которой протекает образование уролитов. Предварительное изучение визуальным методом влияния глутаминовой и аспарагиновой аминокислот на период индукции одноводного оксалата кальция показало, что в диапазоне концентраций (10-510-6 моль/л) эти кислоты практически не изменяют кинетику нуклеации. При увеличении концентраций данных аминокислот до 10-2 моль/л (именно в такой концентрации в среднем аминокислоты присутствуют в моче) удалось выявить их ингибирующее действие на образование зародышей кристаллизации (табл. 5).
Природа аминокислоты также влияет на стадию нуклеации одноводного оксалата кальция. Присутствие в растворе таких аминокислот, как глицин и пролин, катализирует образование зародышей (табл. 6); воздействие возрастает с увеличением концентрации аминокислот. Такое поведение «коротких» аминокислот можно объяснить близкими геометрическими размерами этих аминокислот и оксалат-иона. В этом случае катионы кальция в растворе могут участвовать в образовании не только одноводного оксалата кальция, но и хелатных комплексов с аминокислотами, которые, в свою очередь, становятся центрами кристаллизации. На кинетических кривых, ха-растеризующих полноту протекания кристаллизации оксалата кальция во времени (а), в присутствии аминокислот установлено снижение этого параметра. Эффект возрастает с увеличением концентрации вводимой добавки. Это можно объяснить тем, что в результате кристаллизации изучаемого малорастворимого соединения уменьшается количество подвижных ионов и общая проводимость системы падает пропорционально их остаточной концентрации и количеству образующегося осадка.
Т а б л и ц а 5
Результаты определения периодов индукции одноводного оксалата кальция (у = 7) в присутствии аминокислот
Добавка Концентрация Время, с
Нет 0 663
Глутаминовая 10-5 578
10-2 2365
Аспарагиновая 10-5 567
10-2 1920
Глицин 10-5 55
10-2 2
Пролин 10-5 32
При изучении кинетики ростовых процессов минералов наибольший интерес представляет участок на кинетических кривых, характеризующий рост образовавшихся частиц без увеличения их общего количества, поэтому в дальнейшем именно его использовали при расчете основных характеристик кристаллизации одноводного оксалата кальция (табл. 6).
Полученные результаты показали, что присутствие добавок аминокислот в концентрации 10-6 моль/л при пересыщениях от 5 до 7 не изменяет кинетику роста оксалата кальция. Увеличение концентрации аминокислот на порядок (до 10-5 моль/л) ведет к снижению константы скорости реакции осаждения. Дальнейшее увеличение концентрации аминокислот до значения 10-2 моль/л резко снижает константу скорости кристаллизации. Ингибирующее действие аминокислот можно объяснить ад-
сорбцией их ионов на активных точках роста кристаллов уевеллита. Если принять во внимание данные о нахождении аминокислот в водных растворах в виде цвиттер-ионов, а также ионную природу одноводного оксалата кальция, то наиболее вероятным представляется электростатическое взаимодействие аминокислот с поверхностью синтезируемых кристаллов. Увеличение концентрации аминокислоты в растворе приводит к блокировке большего количества активных центров, что способствует дальнейшему замедлению роста кристалла. Из всех изученных аминокислот наибольшим влиянием на рост кристаллов уевеллита обладает глутаминовая аминокислота. С помощью дисперсионного анализа (минимальный размер кристаллов - 0,03 мкм) удалось установить, что аминокислоты оказывают разное влияние на величину индукционного периода.
Т а б л и ц а 6
Кинетические характеристики кристаллизации одноводного оксалата кальция в присутствии добавок (у = 7)
Добавка Концентрация К'
Без добавок 0 1023
Глутаминовая кислота 10-5М 1010
10-2М 105
Аспаргиновая кислота 10-5М 1011
10-2М 107
Пролин 10-5М 1012
10-2М 109
Аланин 10-5М 1014
10-2М 1010
Глицин 10-5М 1013
10-2М 109
При у = 7 первые кристаллы оксалата кальция при добавлении пролина, глицина и аланина (концентрация 10-5 моль/л) были зафиксированы уже менее чем через 1 мин от начала реакции кристаллизации, а при добавлении глутаминовой кислоты в той же концентрации -лишь спустя более 5 мин после начала реакции. В системе без добавок аминокислот образование кристаллов начиналось практически сразу после сливания растворов. Для одноводного оксалата кальция без добавок полученная зависимость носит бимодальный характер и имеет большую дисперсию, которая к тому же возрастает с увеличением пересыщения (рис. 6).
Вероятно, рост кристаллов в процессе кристаллизации осуществляется одновременно на кристаллических центрах нескольких типов, что и обусловливает полимодальность полученных кривых распределения. Бимодальность сильнее проявляется при увеличении пересыщения раствора.
Добавки аминокислот приводят к резкому сжатию кривых распределений и уменьшению среднего размера кристаллов. Это подтверждает выводы, сделанные на основании кинетических экспериментов, о том, что аспарагиновая и глутаминовая аминокислоты оказывают ингибирующее действие на процессы роста кристаллов одноводного оксалата кальция. При чем ингибирующее действие аминокислот сильнее проявляется при меньших пересыщениях. Кроме того, в условиях малых пересыщений средний размер образующихся кристаллов в присутствии глутаминовой кислоты меньше, чем в присутствии аспарагиновой кислоты. Было установлено, что степень ингибирования возрастает с увеличением концентрации аминокислоты (табл. 7).
Особое влияние как на нуклеацию, так и на рост кристаллов одноводного оксалата кальция оказывает глутаминовая кислота.
а б
Рис. 6. Распределение кристаллов одноводного оксалата кальция по размерам: 1 - без добавок; 2 - с добавкой аспаргиновой кислоты, С = 10-5 моль/л; 3 - с добавкой глутаминовой кислоты, С = 10_5 моль/л (у = 7 (а), 10 (б); q - объемная доля, %)
Т а б л и ц а 7
Средние размеры кристаллов одноводного оксалата кальция при кристаллизации с добавками аминокислот (пересыщение у = 7)
Аминокислота Концентрация, моль/л
10-5 10-2
Глутаминовая 3,88±0,09 мкм Менее 0,03мкм
Аспарагиновая 5,08±0,06 мкм Менее 0,03мкм
Глицин 6,11±0,07мкм 3,95±0,05 мкм
Аланин 5,52±0,04 мкм 4,32±0,06 мкм
Пролин 5,30±0,07 мкм 4,73±0,04 мкм
Оксалат кальция без добавок 10,31 ±0,07 мкм
При этом фактором, способствующим адсорбции, яв- уменьшается адсорбционный эффект. Кристаллизация
ляется рН, с увеличением которого (более 6-8) заметно одноводного оксалата кальция в присутствии глутамино-
вой кислоты при концентрации С = 10 2 моль/л начинается лишь при пересыщении у = 10 . Таким образом, ингибирующий эффект глутаминовой кислоты сопоставим с воздействием компонент фонового электролита. Кроме того, из полученных данных следует, что ингибирующее действие аминокислот возрастает с увеличением числа карбоксильных групп. По возрастанию ингибирующего эффекта на кристаллизацию одноводного окса-лата кальция аминокислоты можно расположить в следующий ряд: глицин < аланин < пролин < аспарагиновая кислота < глутаминовая кислота.
Таким образом, сильное сродство ди- карбокси-групп к оксалату кальция указывает на то, что белки, богатые аспарагиновой и глутаминовой кислотами, могут, с одной стороны, подавлять рост кристаллов уевеллита вследствие адсорбции на их поверхности, а с другой - служить центрами нуклеации, адсорбируя ионы кальция из раствора, т.е. стимулировать камнеоб-
разование. Ингибирующий эффект аминокислот сопоставим с воздействием компонент фонового электролита, но меньше чем тормозящее влияние катионов магния. Кроме того, по результатам дисперсионного анализа установлено, что при внесении в раствор оксалата кальция с добавкой глутаминовой кислоты (концентрация С = 10-2 моль/л) кристаллов гидроксилапатита (8,29 ± 0,16 мкм) при пересыщении 7 (т.е. в условиях ингибирования кристаллизации) наблюдается кристаллизация одноводного оксалата (средний размер частиц твердой фазы возрастает до 19,14±0,29 мкм). Следовательно, в присутствии кристаллов гидроксилапатита происходит образование и рост кристаллов уевеллита даже при высоких концентрациях аминокислот.
Влияние аминокислот на кристаллизацию апатита. Изучено влияние аминокислот на электрокинетические свойства частиц золя стехиометрического и нестехиометрического (Са/Р = 1,58) гидроксилапатитов (табл. 8).
Т а б л и ц а 8
Результаты дисперсионного анализа среднего размера частиц синтезированных гидроксилапатитов в присутствии аминокислот ( = 37,0 ± 0,5 °С; рН = 7,5 ± 0,1; С = 0,004 моль/л)
Аминокислота Средний диаметр частиц D, мкм
Са/Ртв = 1,58±0,01 Са/Ртв = 1,65±0,01 Са/Ртв = 1,67±0,01
D, мкм А % Sr D, мкм А % Sr D, мкм А % Sr
- (0) 17,30 0,0 0,02-0,03 22,54 0 0,02-0,03 28,35 0,0 0,02-0,03
Глицин (Gly) 16,94 -2,1 19,32 -14,3 32,10 +13,2
Аспарагиновая (Asp) 15,62 -9,5 17,49 -22,4 18,20 -35,8
Глутаминовая (Glu) 14,65 -15,3 17,81 -21,0 21,10 -25,6
Лизин (Lys) 12,35 -28,6 16,54 -26,6 21,93 -22,7
В качестве испытуемых были выбраны аминокислоты, характеризующиеся относительно высоким содержанием как в почечных камнях фосфатного типа, так и в моче, при этом рН (6,45±0,05), ионная сила (0,3) и концентрации аминокислот (0,004 моль/л) в модельных растворах были близки к среде, в которой протекает образование уролитов. Показано, что сорбция аминокислот на кристаллах стехиометрического и нестехиометрического гидроксилапатитов различна и определяется характером электростатического взаимодействия. В зависимости от природы аминокислоты при данной концентрации, рН и ионной силы раствора заряд и значение ^-потенциала поверхности апатитов варьируют. Взаимодействие аминокислот с поверхностью кристаллов нестехиометрического гидроксилапатита увеличивается с уменьшением отрицательного заряда доминирующей в растворе формы аминокислоты. Для стехиометрического гидроксилапатита наблюдается обратная закономерность. При этом по увеличению силы электростатического взаимодействия с нестехиометрическим гидроксилапатитом испытуемые аминокислоты можно ранжировать в следующий ряд: лизин > глицин > глутаминовая кислота > аспарагиновая кислота. Для стехиометрического гидроксилапатита, имеющего положительно заряженную поверхность, ряд будет обратным. Вероятно, данные закономерности обусловлены способностью глицина и лизина перезаряжать поверхность частиц нестехиометрического гидро-ксилапатита, а также изменением знака заряда поверхности стехиометрического гидроксилапатита при адсорбции глицина, аспарагиновой и глутаминовой ами-
нокислот. Кривые распределения по размерам частиц апатитов, полученных в присутствии разных аминокислот, но при одинаковых соотношениях Са/Р, подобны (хотя средние размеры частиц отличаются), что свидетельствует об идентичности механизмов взаимодействия разных аминокислот с основным фосфатом кальция. Из табл. 5 видно, что в диапазоне изучаемых концентраций данные кислоты оказывают ингибирующее действие на рост кристаллов гидроксилапатита. При этом ингибирующая способность глутаминовой и аспарагиновой кислот возрастает с увеличением соотношения Са/Р, что видно по изменению средних размеров частиц твердой фазы. Полученную закономерность можно объяснить увеличением силы электростатического взаимодействия между твердой фазой и аминокислотами, обусловленной изменением заряда поверхности частиц гидроксилапатита в зависимости от степени нестехиометрии его состава. Сила электростатического взаимодействия аминокислот с поверхностью кристаллов нестехиометрического гидроксилапатита увеличивается с уменьшением отрицательного заряда доминирующей в растворе формы аминокислоты. Влияние глицина на процесс кристаллизации стехиометрического гидроксилапатита несколько отличается от воздействия остальных кислот; при исходном соотношении в растворе Са2+/Р043- = 1,90 присутствие глицина в концентрации 0,004 моль/л ведет к увеличению среднего размера частиц по сравнению с фазой, полученной в отсутствие аминокислоты. При других исходных значениях в растворе Са2+/Р043- (1,80 и 1,67) происходит уменьшение среднего размера частиц апатита
по сравнению с контрольными пробами, но в меньшей степени, чем в присутствии остальных кислот. Можно предположить, что увеличение среднего размера частиц синтезированного гидроксилапатита в присутствии глицина связано с возможностью анионной формы глицина замещать гидроксил-ионы в структуре гидроксилапати-та. Ингибирование аминокислотами роста и агрегации кристаллов гидроксилапатита уменьшается с увеличением ионной силы раствора. Это является подтверждением того, что взаимодействие исследуемой твердой фазы с аминокислотами носит в основном электростатический характер. Уменьшение адсорбции аминокислот на поверхности гидроксилапатита может происходить за счет сорбции ионов индифферентного электролита.
Таким образом, аминокислоты оказывают ингибирующее действие на рост кристаллов оксалатов и фосфатов кальция, которое обусловлено их адсорбционным взаимодействием с поверхностью растущего кристалла; ингибирование ослабляется с увеличением ионной силы раствора. Кинетические характеристики кристаллизации уевеллита и гидроксилапатита зависят от природы аминокислоты и её концентрации. Электростатическое взаимодействие аминокислот (глицина,
лизина, глутаминовой и аспарагиновой) с апатитом зависит от степени нестехиометричности его состава.
В данной работе разработан и использован комплексный подход к исследованию патогенного минера-лообразования в организме человека, включающий всестороннее изучение органоминеральных агрегатов (почечных, желчных, зубных и слюнных камней), соответствующих камнеобразующих сред, а также широкое применение методов теоретического и экспериментального моделирования в прототипах биологических жидкостей. Детально исследована представительная коллекция почечных, желчных, зубных и слюнных камней (их морфология, структура, минеральный и химический состав); установлены связи между компонентами ОМА; проанализирована онтогения органоминеральных агрегатов. Проведено определение параметров желчи и ротовой жидкости в норме и патологии; выявлены отличия состава патогенных камнеобразующих сред; установлены связи между характеристиками физиологических растворов и образующихся в них камней. Изучены условия фазообразования в моче и ротовой жидкости и особенности кристаллизации основных патогенных фаз почечных камней (оксалатов, фосфатов).
ЛИТЕРАТУРА
1. Голованова О.А. Патогенные минералы в организме человека / О. А. Голованова. - Омск, 2007. - 395 с.
2. Голованова О.А. Сравнительная характеристика минерального и микроэлементного состава желчных камней, удаленных у пациентов в Но-
восибирской и Омской областях / О. А. Голованова, Н.А. Пальчик, Н.Ю. Березина, Л.Н. Юдина // Химия в интересах устойчивого развития. - 2006. - № 14. - С. 125-131.
3. Куркин Б. Без очищенной воды нам, товарищи, «кранты»! / Б. Куркин // «Комсомольская правда» в Омске. - 2002. - 5 июля.
4. Голованова О.А. Способ определения уровня воздействия компьютерного излучения на состояние зубов / О.А. Голованова, Л.В. Бельская,
Л.М. Ломиашвили, М.А. Борисенко: Решение о выдаче патента на изобретение. Заявка 2666110490/15(011425) от 21.03.2007.
5. Биохимия / Под ред. Е.С. Северина. - М.: ГЭОТАР Мед., 2003. - 356 с.
6. Борбат В.Ф. Способ определения микроколичеств белковых соединений в почечных камнях / В.Ф. Борбат, О. А. Голованова, П. А. Пятанова,
Е.В. Россеева. Патент № 2238549: Решение о выдаче патента на изобретение. Заявка № 2003104252/15(004438) от 12.02.2003.
Статья представлена научной редакцией «Биология» 2 мая 2008 г.
