Особенности нуклеотидного полиморфизма митохондриального гена COI у комаров-звонцов (Diptera, Chironomidae)

Дёмин А.Г.; Полуконова Н.В.

Études ent. par Motschulsky 1: 64. Locus typicus: «aux environs de Pekin». Holo-type (by monotypy): female (ZISP). = Tropaea Mandschurica Staudinger, 1892, syn. nov., in: N. M. Romanoff, Mém. Lépid. б: 331. Locus typicus: "Uss[uri], Shanghai; North-China; Peking".

ОСОБЕННОСТИ НУКЛЕОТИДНОГО ПОЛИМОРФИЗМА

МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНА COI У КОМАРОВ-ЗВОНЦОВ

(DIPTERA, CHIRONOMIDAE)

А.Г. Дёмин*, Н.В. Полуконова**

*Саратовский государственный университет, **Саратовский государственный медицинский университет

Пригодность митохондриального гена цитохром оксидазы I (COI) была показана ранее (Guryev et al., 2001; Martin et al., 2002; Гурьев, 2002; Дёмин, Полуконова, 2007а) для филогенетических реконструкций как близкородственных семейств, родов, так видов и подвидов разных групп насекомых, в том числе и комаров-звонцов (Diptera, Chironomidae). Исследования особенностей полиморфизма этого гена позволит оценить его роль в эволюционном процессе хирономид.

Род Chironomus - один из наиболее эволюционно молодых среди бентосных хирономин. Его виды находятся на разных этапах эколого-морфологической и хромосомной дифференциации, в связи с чем внутри рода в настоящее время принято выделять такие группировки видов, как: морфологические виды-двойники, близкородственные виды (хорошо морфологически различимые, но сходные по кариотипу), гомосеквентные виды (с одинаковыми последовательностями дисков политенных хромосом), а также неродственные виды как одного цитологического комплекса (с определенным сочетанием хромосомных плеч), так и разных.

Цель настоящей работы - сравнить данные по нуклеотидному полиморфизму мтДНК гена COI (на участке 595 н.) представителей Chironomus из разных группировок - морфологических видов-двойников, близкородственных видов, неродственных видов одного и разных цитокомплексов, полученные нами (по видам Ch. usenicus, Ch. curabilis, Ch. plumosus (Дёмин, Полуконова, 20076) и используя данные GenBank по ряду других видов Chironomus и Polypedilum.

Материал и методы

В работе использованы личинки IV возраста из водоемов Саратовской области: Ch. curabilis - р. Сазанлей, Балаковский р-н, 07. 2006 г.; Ch. curabilis - ручей Данилов в Н. Банновке, Красноармейский р-н, 06. 2005 г.; Ch. usenicus - оз. Калач, Новоузенский р-н, 02.2007 г.

Выделение ДНК проводилось коммерческим набором реактивов Di-atomtm DNA Prep 100 в соответствии с протоколом фирмы-изготовителя. Амплификация гена проведена с использованием коммерческого набора реактивов GenePak@PCR Core в соответствии с протоколом фирмы-изготовителя на термоциклере Hybaid. Условия ПЦР: 1 этап - 94° - 1 мин; 2 этап - 5 циклов: a) 94° - 1 мин, b) 45 ° - 1.5 мин, с) 72 ° - 1.5 мин; 3 этап - 35 циклов: a) 94 ° - 1 мин, b) 50 °- 1.5 мин, с) 72 ° - 1 мин; 4 этап - 72 ° - 5 мин.

Праймеры: LCO 5'GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG3'

HCO 5'TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA3'.

Электрофорез проводился в 1% агарозном геле, в TBE буфере. Секвенирование образцов осуществлялось на базе ВНИРО (г. Москва) в автоматическом режиме на секвенаторе ABI 3100 с прямого и обратного праймера без предварительной очистки амплификатов.

Для коррекции полученных последовательностей использована программа ChromasPro, вырaвнивание проведено в ClustalW.

При сравнении видов использованы данные GeneBank по гену COI: Ch. plumosus (AF192192) , Ch. balatonicus (AF192193), Ch. entis (AF192195), Ch. muratensis (AF192194) и других видов: Ch. heterodentatus (AF192199), Ch. acutiventris (AF192200), Ch. suwai (DQ648206), Ch. cingularis (AF192191), Ch. bernensis (AF192188) и Ch. luridus (AF192203), Ch. pseudothummi (AF192205), Ch. dorsalis (AF192206), Polypedilm nubiferum (DQ648227).

Результаты и обсуждение

Обнаруженные генные мутации у Ch. curabilis и Chironomus группы plumosus в гене мтДНК COI относятся к одному типу - мутации по типу замены. Всего на участке 595 н.п. гена COI у исследованных видов Chironomus обнаружено 80 вариабельных нуклеотидов и 107 нуклеотидных замен (рисунок).

Наиболее распространена замена тимидилового нуклеотида (Т) на цитидиловый (Ц) (29%), которая в 27 случаях из 31 приходится на третий нуклеотид в кодоне и только очень незначительная часть - на первый и второй. Количество трансверсий в два раза превышает число транзиций. Внутрипопуляционный полиморфизм Ch. usenicus связан с одной синонимичной заменой на участке 595 п.н. (G меняется на А в третьем положении), межпопуляционный - Ch. curabilis - с пятью синонимичными заменами.

Для анализа внутри- и межвидового полиморфизма гена COI у Chironomus были выбраны следующие виды: группы видов цитологического комплекса thummi - plumosus (Ch. plumosus, Ch. balatonicus, Ch. muratensis, Ch. entis, Ch. usenicus), obtusidens (Ch. heterodentatus, Ch. acutiventris), отдельные виды цитокомплекса thummi - Ch. suwai, Ch. cingulatus, группа

lacunarius, включающая представителей цитокомплекса lacunarius и modified lacunarius - Ch. bernensis и Ch. commutattus; отдельные виды цитокомплекса pseudothummi - ^. luridus, Ch. pseudothummi, Ch. dorsalis.

В качестве внешней группы выбран Polypedilum nubiferum. В результате сравнения подсчитаны замены в последовательности гена COI (таблица).

Ch. plumos us Ch. curahllls_pmz Ch. cuj:abilis_Ban Ch. usenlcus_Gl.2 Ch. usenlcus_Gl.1 Ch.usenicus_Gl.1. Ch. entls Ch. muz at ens Is Ch.balatonlcus

GGAATAGTAGGGACTT С TTTAAGTАТАС TTATTС GAGCAGAATTAGGAC GACС С GGAAC TTTTAT TGGTGAC GAC CAAATTT

G... G...

. C.. . C.. . C..

. G... . G... . G... . G... . G... . G...

. C. . C.

. T... . T... . T...

. G... . G... . G... . G...

Ch.plumos us Ch. cuzahllls_%siz Ch. cuzabllls_Ban Ch. usenlcus_Gl.2 Ch. usenlcus_Gl.1 Ch. usenlcus_Gl.1. Ch. entls Ch.muzat ens Is Ch.balatonlcus

ATAATGTAGTAGTTACAGCTCACGCATTTATTATAATTTTTTTCATAGTTATGCCAATTTTAATTGGTGGTTTTGGAAATTG

.............................................................................................С......................................................................................................................................................

............................................................................................................................................................A......................................................................................

Ch.plumos us Ch. cuj:ajbi.J.is_5as Ch. cuzahllls_B5in Ch. usenlcus_Gl.2 Ch. usenlcus_&1.1 Ch. usenlcus_Gl.1. Ch. entls Ch. muz at ens Is Ch.halatonlс us

ACTCGTAC CTTTAATATTGGGGGC CCCTGATATAGCTTTCCCTCGAATAAATAATATAAGTTTTTGACTTCTTCCCCCATCA

. T... . T... . T... . T... . T... . T...

. C... . C... . C... . C.„ . C... . C...

. C.. . C.. . C.. . C.. . C.. . C.. . C.. . C..

A.. A.. A.. A.. A.. A..

. C. . C.„

. C.

Выравнивание нуклеотидных последовательностей гена COI видов Chironomus группы plumosus и Chironomus curabilis. Обозначения: Ch. Curabilis Saz — р. Сазанлей, Балаковский р-н Саратовской обл., 07. 2006 г.; Ch. curabilis Ban — ручей Данилов в Н. Банновке, Красноармейский р-н Саратовской обл., 06. 2005 г.; Ch. usenicus — оз. Калач, Новоузенский р-н, Саратовской обл., 02.2007 г. (G1.2, G1.1 варианты хромосомных последовательностей плеча G); данные GenBank: Ch. plumosus

(AF192192) , Ch. balatonicus (AF192193), Ch. entis (AF192195), Ch. muratensis (AF192194)

Ch. plumosus Ch. curabilis Ch. curabilis Ban Ch. usenlcus.2 Ch.usenlcus Gl.l Ch. usenicus_Gl . 1. Ch. eniis Ch. лзига i shs Is Ch. balatonicus

CTTACCTTACTCTTTTCAAGTTCATTTGTTGAAAATGGAGCAGGAACAGGATGAACAGTCTATCCCCCTCTTTCTTCAGCTA

.... С............ТС................................................G...

. АС...............С................................................G...

.А................................С.................................А..

.... С... ТТ... АС............Т...............Т......С......А..

...................ТС......................................................

. Т... .С... . Т... . Т... . Т...

. Т... . Т...

Т......G...

. G... . G...

..............G...... .....А...

...........CG...... .....С...

& С

......т................................................

Ch. plumosus Ch. curabilis_Saz Ch. cuj:ajbilis_Ban Ch. usenlcus.2 Ch. usenicus_Gl.1 Ch.usenlcus Gl.l. Ch. eniis Ch. лш.г a i e¡3s Is Ch. balatonicus

TTGCTCATAGTGGGGCС ТС TGTTGATTTAGC TATTTTCТС T TTGCATTTAGCGGGAGТС ТС С ТСAATTCTTGGАТС TGTAAA

С.. С.. С..

. е.. . е.. .е.. . е.. . е.. . е..

.А.. .А.. .А.. .А.. .А.. .А.. .А.. .А..

. Т... .А.. .А.. .А.. .А.. .А.. .А..

. G... .А..

.С. .С.

Ch. plumosus Ch. curabilis_5az Ch. cuj:ajbilis_Ban Ch.usenlcus Gl.2 Ch. usenicus_Gl.1 Ch.usenlcus Gl.l. Ch. eniis Ch. лш.г a i e¡3s Is Ch. balatonicus

TTTTATTACTACTGTTATTAATATACGTGCAAAGGATTACTTTAGACCGAATACCCTTATTTGTTTGATGTCAGTTGTTATT

....................................С.........................................................................................................T..............................................................................A.................

....................................С.........................................................................................................T...................................................С........................A.................

................................................................................................................................................T...................................................С........................A.................

....................................С..........................................A...........................................................С...................................................С........................А.................

............................................................................................................А..................................................G.................................................................................

...............................................................................................................................................................................................................G....................................

Выравнивание нуклеотидных последовательностей гена COI видов Chironomus группы plumosus и Chironomus curabilis.

(Продолжение)

Выравнивание нуклеотидных последовательностей гена COI видов Chironomus группы plumosus и Chironomus curabilis.

(Окончание)

Уровень отличий популяций и видов в разных группировках рода Chironomus

по гену мтДНК - COI

Сравниваемые объекты Число замен от 595 п.н., %

значимых незначимых всего

Индивидуальный полиморфизм особей одной популяции Ch. usenicus 0 (0) 2 (0.34) 2 (0.34)

Межпопуляционный полиморфизм Ch. curabilis 0 (0) 5 (0.84) 5 (0.84)

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Межвидовой полиморфизм среди видов-двойников групп plumosus, ob-tusidens и lacunarius 0-3 (0.17-0.50) 18-49 (3.03-8.24) 19-55 (3.19-11.0)

Межвидовой полиморфизм среди неродственных видов внутри цитокомплексов: thummi, lacunarius, modified lacunarius, pseudothummi 1-3 (0.17-0.50) 68-115 (11.43-19.33) 69-118 (11.6019.83)

Межвидовой полиморфизм среди видов разных цитокомплексов: thummi, lacunarius, pseudothummi 2-6 (0.34-1.01) 132-165 (22.18-27.730) 134-171 (22.5228.74)

Межродовой полиморфизм на примере Chironomus и Polypedilum 14 (2.35) 181 (30.42) 195 (32.77)

Значимые замены подсчитывали на основе сравнения аминокислотных последовательностей.

Число значимых замен может слабо различаться или не различаться совсем у видов-двойников, близкородственных видов и видов одного цитологического комплекса. Виды Chironomus внутри цитокомплекса могли отличаться друг от друга, как и виды-двойники, по 1-3-м значимым заменам. Значимые замены гена COI резко возрастают при сравнении видов Chironomus с разным сочетанием хромосомных плеч, т.е. разных цитокомплексов, за исключением модифицированных. Модифицированные цитокомплексы характеризуются уменьшенным числом хромосом на основе присоединения короткого плеча G чаще всего к плечу Е длинной хромосомы. Виды разных родов, таких как Chironomus и Polypedilum, могут иметь до 14 значимых замен.

Число синонимичных нуклеотидных замен увеличивается по мере удаленности видов в группах и групп видов внутри рода - от 2 синонимичных замен у особей внутри популяции и 5 - у особей одного вида разных популяций до 18-49 замен между видами-двойниками, 68-115 -между видами одного цитокомплекса, 132-165 замен - между видами разных цитокомплексов и 181 замены между видами разных родов.

Таким образом, определены диапазоны изменчивости гена СО I в трибе Chironomini - от 3 до 11% всех замен между видами внутри групп видов-двойников и близкородственных видов, от 11 до 20% - между видами одного цитокомплекса, более 20 до 30% - между видами разных цитокомплексов и

более 30% - между разными родами. Установленные диапазоны нуклеотидной изменчивости гена мтДНК - COI вполне адекватно отражают различия между особями внутри- и межвидовых группировок, что свидетельствует о корреляции накопления изменений в этом гене в процессе эволюции комаров-звонцов. Наблюдается прямая корреляция числа синонимичных замен с систематической удаленностью видов, что подтверждает возможность использования мтДНК в филогенетических реконструкциях комаров-звонцов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Гурьев В.П. Молекулярная филогения рода Chironomus (Diptera, Nematocera): Автореф. дис. ... канд. биол. наук. Новосибирск, 2002. 17 с.

Дёмин А.Г., Полуконова Н.В. Изученность нуклеотидных последовательностей ядерных и митохондриальных генов хирономид (Chironomidae, Diptera) и основные подходы их использования в эволюционном анализе // XXI Любищевские чтения. Современные проблемы эволюции (сборник докладов). Ульяновск, 2007 а. С. 157-168.

Дёмин А.Г., Полуконова Н.В. Изменчивость митохондриального гена COX I у европейских видов Chironomus и Baeotendipes (Chironomidae, Diptera) // Сб. науч.трудов XIII Междунар. школы-конф. молодых учёных «Биология внутренних вод». Борок, 23-26 окт. 2007 г. Борок, 2007 б. С. 64-69.

Guryev V., Makarevich I., Blinov A., Martin J. Phylogeny of the genus Chironomus (Diptera) inferred from DNA sequences of mitochondrial cytochrome b and cytochrome oxidase I // Mol. Phylogenet. Evol. 2001. Vol. 19. P. 9-21.

Martin J., Guryev V., Blinov A. Population variability in Chironomus (Camptochirono-mus) species (Diptera, Nematocera) with a Holarctic distribution: evidence of mitochondrial gene flow // Insect Mol. Biol. 2002. Vol. 11, № 5. P. 387-397.

THE FEATURES OF NUCLEOTIDE POLYMORPHISM OF MITOCHONDRIAL GENE COI OF MIDGES (DIPTERA, CHIRONOMIDAE)

A.G. Demin*, N.V. Polukonova**

*Saratov State University, ** Saratov State Medical University

The level of intra- and interpopulation, intra- and interspesial polymorphism of mitochondrial cytochrome oxidase 1-COI gene of Chironomus was established.

The variability range of COI gene in the tribe Chironomini - from 3 till 11% of all change between sibling-species, from 11 till 20% - between unrelated species of one cytocomplex, more than 20 till 30% between species of different cyto-complexes and more than 30% between different genera of one tribe.

Особенности нуклеотидного полиморфизма митохондриального гена COI у комаров-звонцов (Diptera, Chironomidae) Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

Аннотация научной статьи по биологическим наукам, автор научной работы — Дёмин А.Г., Полуконова Н.В.

Похожие темы научных работ по биологическим наукам , автор научной работы — Дёмин А.Г., Полуконова Н.В.

THE FEATURES OF NUCLEOTIDE POLYMORPHISM OF MITOCHONDRIAL GENE COI OF MIDGES (DIPTERA, CHIRONOMIDAE)

Текст научной работы на тему «Особенности нуклеотидного полиморфизма митохондриального гена COI у комаров-звонцов (Diptera, Chironomidae)»