CC BY
28
МЕДИЦИНА
УДК 001.5:612.015.1:612.014.48
ОСОБЕННОСТИ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ТИМУСА МЫШЕЙ ПРИ ВВЕДЕНИИ НАНОЧАСТИЦ РАЗЛИЧНЫХ МЕТАЛЛОВ
© 2011 г. Е.Ю. Златник, Л.В. Передреева, О. Ф. Евстратова
Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, Rostov Research Oncological Institute,
14-я линия, 63, г. Ростов-на-Дону, 344037, 14 th Line, 63, Rostov-on-Don, 344037,
rnioi@list.ru rnioi@list.ru
Изучали влияние внутрибрюшинного введения наночастиц (НЧ) металлов (Cu, Zn, Fe) на морфофункциональное состояние тимуса мышей. Показано, что при действии НЧ Zn отмечаются морфологические признаки активности тимуса, а при действии НЧ Fe — признаки его истощения, увеличение количества дистрофически измененных тимоцитов. Действие НЧ Cu на состояние тимуса незначительно.
Ключевые слова: наночастицы металлов, тимус, морфология.
Effect of intraperitoneal administration of metallic nanoparticles (Cu, Zn, Fe) on morphofunctional state of murine thymus was studied. Morphologic signs of the activity of thymus were found after administration of Zn nanoparticles while in mice receiving Fe nanoparticles signs of its' exhaustion, i.e. the increase of the amount of dystrophic thymocytes were seen. The effect of Cu nanoparticles on murine thymus is less significant.
Keywords: metallic nanoparticles, thymus, morphology.
Наноразмерные частицы и композиты могут представлять значительный интерес для коррекции различных патологических процессов, развивающихся в клетке, поскольку они обеспечивают многократное возрастание суммарной поверхности и проникающей способности. Известно, что металлы входят в состав соединений, обладающих различными видами биологической активности [1]. Нами ранее был проведен ряд экспериментальных исследований по оценке действия наночастиц металлов (Си, Zn, Бе) на рост перевиваемых опухолей. При этом был получен выраженный противоопухолевый эффект вплоть до полной регрессии мышиной саркомы С37, сопровождающейся развитием значительных дистрофических изменений в опухолевых клетках [2, 3]. Однако многие противоопухолевые агенты обладают иммунодепрессив-ным действием, приводящим к побочным явлениям.
Цель данной работы - экспериментальное исследование действия наночастиц (НЧ) металлов на мор-фофункциональное состояние тимуса животных.
Материалы и методы
В работе были использованы наночастицы (размер 30-100 Нм), представляющие собой ультрадисперсные порошки металлов (Си, 2п, Fe), синтезированные на Саратовском плазмохимическом комплексе ФГУП РФ ГНЦ ГНИИХТЭОС. Эксперимент проводили на 20 самцах белых беспородных мышей, инбредных в 5 поколениях, массой 18-20 г. Взвесь НЧ вводили мышам внутрибрюшинно через день в концентрации 1 мкг/мл сначала 2 раза по 0,1 мл, а затем 4 раза по 1,0 мл. Каждое животное получило в суммарной дозе по 4,2 мкг НЧ (0,21-0,23 мкг/г массы), что в пересчете на среднюю массу человека составляет 14,7 мг и сопоставимо с используемыми дозами некоторых хими-
опрепаратов. Опытные группы животных получали взвесь НЧ Си, 2п или Fe, контрольная группа - аналогичные инъекции физиологического раствора. Внешних изменений состояния животных отмечено не было, все мыши оставались живыми до конца эксперимента. Через 1 неделю после последнего введения НЧ животных выводили из эксперимента, тимусы фиксировали в жидкости Карнуа, после проводки до парафиновых блоков готовили срезы, окрашиваемые гематоксилином-эозином и метиловым зеленым пирони-ном по Браше в модификации Симаковой. Изучали их с помощью светового микроскопа (окуляр х15, объективы х8, х20, х40, х90), выполняли морфометрию.
Результаты статистически обрабатывали с помощью параметрических и непараметрических методов: вычисляли средние величины (М), ошибку средней (т), достоверность различий (/, р) между значениями, полученными при исследовании препаратов тимусов опытных и контрольных мышей.
Результаты
Результаты исследования показали, что у опытных и контрольных мышей не отмечается значительных признаков угнетения вилочковой железы, сходных с теми, которые обычно развиваются при введении цито-статиков. Ни в одной группе животных не наблюдались выраженное уменьшение площади паренхимы, измельчение долек, истончение коркового слоя, снижение плотности распределения тимоцитов, а также уменьшение количества эпителиоретикулоцитов и тканевых базофилов (тучных клеток). У всех животных размеры долек тимусов были крупными и средними, часто встречались гигантские сливные дольки с высокой плотностью расположения тимоцитов и широким корковым слоем. Однако при сравнении гистологиче-
ской характеристики тимуса между изучаемыми группами животных были обнаружены некоторые различия. У контрольных мышей и животных, получавших НЧ Си и НЧ 2п, капсула тимуса и междольковая соединительная ткань были тонкими или умеренно выраженными с наличием небольших очажков жировой ткани рядом с дольками, а сами дольки были крупными вплоть до гигантских размеров с преобладанием коркового вещества над мозговым. А при введении НЧ Fe междольковая соединительнотканная прослойка была расширена, очаги жировой ткани находились не только вокруг, но и в самих дольках. В тимусах мышей, получавших НЧ Fe, наряду с крупными и гигантскими дольками встречались мелкие с нарушением их структуры: неравномерным расположением коркового и мозгового вещества, последнее местами было представлено в виде участков с размытыми контурами среди коркового вещества (рис. 1а).
в
Рис. 1. Тимусы мышей при действии НЧ различных металлов. Окраска метиловым зеленым пиронином по Браше (х120). 1 - НЧ Ее. Снижение пролиферативной активности: слабо развитое корковое вещество, неравномерное расположение мозгового вещества; б - НЧ 7и. Усиление пролиферативной активности: крупные дольки со значительным преобладанием коркового вещества, высокая плотность расположения тимоцитов; в - контроль
В тимусе мышей, которым вводили НЧ 2п, наблюдалось наиболее активное состояние органа без признаков угнетения, оцениваемое по таким критериям, как четкость деления долек на корковое и мозговое вещество с преобладанием первого, а также высокая плотность расположения тимоцитов (рис. 1б). Указанные различия регистрировались по сравнению с контролем (рис. 1в).
Процессы дифференцировки и пролиферации ти-моцитов регулируются с участием клеток в их микроокружении. При этом значительную роль играют тучные клетки (тканевые базофилы), в гранулах которых содержатся различные биологически активные вещества, и эпителиоидные клетки (эпителиоретикулоци-ты) - продуценты тимозина. Тучные клетки в около-дольковой соединительной ткани тимуса контрольных мышей встречаются очень редко, содержат небольшое количество гранул, дегрануляция выражена слабо. У мышей, получавших НЧ Си, отмечаются группы тучных клеток до 9 в поле зрения (при увеличении х600 и х1350), содержащих гранулы, в некоторых наблюдается интенсивная дегрануляция.
После введения НЧ 2п в тимусах животных выявляются одиночные крупные или группы средних по размеру тучных клеток, часть из которых находится в состоянии активной дегрануляции (рис. 2).
Рис. 2. Тучные клетки в тимусе мышей при введении НЧ 7и. Окраска метиловым зеленым пиронином по Браше (х 1350). Скопления активных крупных тучных клеток с гранулами; их дегрануляция
В ткани тимуса мышей, которым вводили НЧ Fe, тучные клетки встречаются редко (1-2 крупных клетки в поле зрения), их дегрануляция не отмечена. Эпи-телиоидные клетки с морфологическими признаками активации в корковом и мозговом веществе вилочко-вой железы мышей контрольной группы, а также получавших НЧ Си и НЧ 2п, встречаются чаще, чем при введении НЧ Fe. Тельца Гассаля, напротив, чаще отмечаются в мозговом веществе тимуса животных, получавших НЧ Fe.
Поскольку описанные различия между исследуемыми группами не были резко выраженными и не сходны с обычно наблюдаемыми при введении цито-статиков, для более детальной характеристики особенностей действия различных НЧ металлов была проведена морфометрия для оценки гистологических признаков пролиферативной активности тимоцитов: величины их ядер и толщины субкапсулярного слоя долек (табл. 1).
Данные морфометрии показали, что ширина суб-капсулярного слоя коркового вещества, содержащего широкоплазменные пиронинофильные лимфобласты (незрелые тимоциты), не отличается от контроля ни в одной из исследуемых групп. Однако диаметр ядер незрелых тимоцитов мышей, получавших НЧ Fe, был
* - статистически достоверные отличия от контроля (р<0,05); |
У мышей опытных и контрольной групп подсчитывали процент дистрофически измененных тимоци-тов коркового и мозгового вещества, включая различные виды дистрофических изменений (табл. 2).
Таблица 2
Количество дистрофически измененных тимоцитов у мышей, получавших НЧ металлов
Показатель, % Группа мышей
Контроль НЧ Cu НЧ Zn НЧ Fe
Количество дистрофически измененных тимоцитов в корковом веществе 25,78± 1,49 10,73± 1,64 *| 9,01± 0,99 *| 33,31± 2,69 *
Из них Кариопикноз 20,0± 1,43 22,68± 1,81 23,27± 1,91 6,25± 0,5 *|
Кариорексис 32,03± 2,29 13,66± 0,96 *| 26,48± 2,34 41,62± 3,33 *t
Кариолизис 29,93± 2,14 40,98± 3,73 *| 29,05± 2,56 33,38± 2,67
Вакуолизация ядра и цитоплазмы 18,04± 1,29 22,68± 1,12 *| 21,2± 1,77 18,75± 1,5
Количество дистрофически измененных тимоцитов в мозговом веществе 27,24± 2,76 13,59± 1,79 *| 11,38± 1,12 *| 29,06± 3,27
Из них Кариопикноз 19,61± 1,83 11,15± 0,67 *| 12,55± 1,33 *| 12,67± 1,33 *|
Кариорексис 32,15± 3,0 27,79± 2,34 34,27± 4,06 36,48± 3,83
Кариолизис 32,16± 2,76 33,28± 3,25 31,27± 2,95 34,95± 3,37
Вакуолизация ядра и цитоплазмы 16,08± 1,5 27,78± 1,92 21,91± 1,84 15,9± 1,67
* - статистически достоверные отличия от контроля (р<0,05); | - повышение показателя; | - снижение показателя.
Как видно из табл. 2, введение НЧ Си вызывает снижение количества дистрофически измененных ти-моцитов в корковом и в мозговом веществе по сравнению с контрольными животными. При этом в первом
статистически достоверно ниже, чем в контрольной группе и группах, которым вводили НЧ Си и НЧ 2п (табл. 1). Это позволяет предположить некоторое истощение резервов пролиферативной активности тимуса после введения НЧ Fe и их сохранность после введения НЧ Zn и НЧ Си.
снижается количество клеток в состоянии кариорекси-са, а число клеток с признаками кариолизиса и вакуолизации ядра и цитоплазмы возрастает. Во втором увеличивается процент клеток с вакуолизацией и уменьшается количество клеток с кариопикнозом.
При введении НЧ 2п по сравнению с контролем снижается количество клеток с наличием дистрофических изменений, в частности, с признаками кариопик-ноза в мозговом веществе, при росте процента тимоци-тов с вакуолизацией ядра и цитоплазмы. Важно отметить, что в корковом слое тимуса количество дистрофически измененных клеток уменьшается по сравнению с контролем, а содержание клеток с отдельными видами дистрофии не отличается от контроля.
Введение НЧ Fe способствует повышению количества дистрофически измененных тимоцитов по сравнению с контролем. Кроме того, выявлено трехкратное повышение этого показателя по сравнению с полученными при действии НЧ Си и НЧ 2п. Отмеченные изменения происходят за счет увеличения количества тимоцитов с явлениями кариорексиса в корковом слое.
Представленные результаты свидетельствуют о том, что влияние исследованных разновидностей НЧ металлов на состояние тимуса мышей неодинаково, хотя ни одна из них не вызывает его грубых повреждений. На основании описанных гистологических особенностей тимусов мышей можно говорить о стимулирующем эффекте введения НЧ 2п. Введение НЧ Си не приводит к заметным изменениям структуры тимуса, а введение НЧ Fe оказывает определенное повреждающее действие на некоторые структурные характеристики вилочковой железы.
Полученный эффект НЧ 2п обусловлен, по-видимому, тем, что атом этого металла входит в состав тимических гормонов, благодаря чему препараты цинка обладают иммуномодулирующим действием, как, по всей вероятности, и использованные нами НЧ. Ранее нами были получены данные, характеризующие цитотоксическое и противоопухолевое действие вышеописанных НЧ металлов, причем наиболее выраженный эффект вызывали НЧ цинка и меди, а самый слабый и регистрируемый не во всех модельных сис-
Таблица 1
Морфометрические характеристики тимуса мышей, получавших НЧ металлов, мкм
Показатель Группа мышей
Контроль НЧ Cu НЧ Zn НЧ Fe
Ширина субкапсулярного пиронинофильного слоя коркового вещества (х120) 128,9±8,32 120,64±10,4 118,56±10,44 130,0±9,36
Диаметр ядер незрелых тимоцитов субкапсулярного слоя коркового вещества (х600) 9,45±0,37 9,87±0,44 9,24±0,42 7,77±0,27 *|
Диаметр ядер тимоцитов середины коркового вещества (х600) 5,46±0,23 6,09±0,28 6,72±0,21 *| 6,09±0,21
- повышение показателя; 1 - снижение показателя.
темах проявляли НЧ железа [3-5]. Результаты, представленные в данной работе, свидетельствуют о сохранности структуры и функции тимуса при введении экспериментальным животным взвеси НЧ цинка или меди, что позволяет использовать их для индукции антипролиферативного действия без повреждения Т-клеточного звена иммунной системы.
Авторы выражают глубокую благодарность проф. Саратовского государственного медицинского университета В.Б. Бородулину за любезное предоставление наночастиц металлов.
Литература
1. Кудрин А.В., Громова О.М. Микроэлементы в иммунологии и онкологии. М., 2007. 544 с.
2. Противоопухолевое действие наночастиц металлов
(экспериментальное исследование) / Ю.С. Сидоренко [и др.] // Изв. Самарского науч. центра РАН. 2009. Т. 11, № 5(2). С. 482-487.
3. Противоопухолевая активность наночастиц металлов /
Е.Ю. Златник [и др.] // Актуальные вопросы преканце-рогенеза и злокачественных опухолей в различных климато-географических зонах: материалы межрегион. науч.-практ. конф. онкологов с междунар. участием. 15.10.09. Якутск, 2009. С. 133-135.
4. Влияние наночастиц металлов на рост опухолевых кле-
ток / Е.Ю. Златник [и др.] // Материалы XII Рос. онкол. конгр. Москва 18-20.11.08. М., 2008. С. 213.
5. Златник Е.Ю., Передреева Л.В. Влияние наночастиц
металлов на опухолевый рост // Онкология - XXI век. Здоровье и образование: материалы IV (XIII) Междунар. науч. конф. 27.04-7.05.09. Хошимин, Вьетнам, 2009. С. 84-87.
Поступила в редакцию
8 июля 2010 г.
