CC BY
68
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ - ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА
ОСОБЕННОСТИ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ У ДЕТЕЙ С ОСТРЫМ ЛИМФОБЛАСТНЫМ ЛЕЙКОЗОМ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ПРОГРАММНОЙ ПОЛИХИМИОТЕРАПИИ
Э.Г. Щербакова1, И.А. Василенко2, И.Е. Гаврилова3, В.Б. Метелин2, Г.А. Растунова1, С.В. Бабакова2,
Л. С. Воробьева1
1ГОУДПО Российская медицинская академия последипломного образования Росздрава 2ФГУ Российский геронтологический научно-клинический центр Росздрава 3НИИ детской онкологии и гематологии РОНЦ им. акад. Н.Н. Блохина РАМН
Представлены результаты исследования морфофункционального состояния клеток периферической крови методом витальной компьютерной фазовой морфометрии у детей с острым лимфобластным лейкозом, получавших программную полихимиотерапию и дополнительное сопроводительное лечение пероральны-ми лизоцимсодержащими биосистемами. Проведен многофакторный анализ оптико-геометрических показателей живых Т-лимфоцитов и нейтрофильных гранулоцитов, характеризующих их структурно-объемные и функциональные свойства. Выявлены особенности морфофункционального статуса клеток врожденного и адаптивного иммунитета при остром лимфобластном лейкозе, установлены корреляции с показателями традиционной иммунограммы. Отмечен иммуномодулирующий эффект бифилиза и его сочетаний с натрия нуклеинатом и лактусаном. Обоснована целесообразность использования экспресс-метода компьютерной фазовой морфометрии в детской онкогематологии.
Ключевые слова: острый лимфобластный лейкоз, Т-лимфоциты, нейтрофилы, лизоцимсодержащие биосистемы, полихимиотерапия, компьютерная морфометрия.
FEATURES OF MORPHOFUNCTIONAL IMMUNE CELLS CONDITION IN CHILDREN WITH ACUTE
LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA DURING PROGRAM POLYCHEMOTHERAPY
E.G. Shcherbakova1, I^. Vasilenko2, I^. Gavrilova3, V.B. Metelin2, G^. Rastunova1, S.V. Babakova2, L.S. Vorobiova1
1Russian Medical Academy of Postgraduate Education of the Ministry of Health
2Russian Gerontologic Research and Clinical Center of the Ministry of Health
3N.N. Blokhin Research Institute of Child Oncology and Hematology of RAMS
Morphofunctional condition of peripheral blood cells was studied using computerized vital phase morphometry in children with acute lymphoblastic leukemia who underwent program polychemotherapy plus additional per-oral treatment with Lysozime-containing biosystems. Multifactor analysis of optical-and-geometric indices of living ^lymphocytes and neutrophilic granulocytes was carried out to characterize their structural-and-volumetric and functional properties. Features of morphofunctional cell status of congenital and adaptive immunity in acute lymphoblastic leukemia were revealed, and correlations with indices of traditional immunogram were determined. Immunomodulating effect of Bifilyz and of its associations with Na-nucleinate and Na-lactusan were noted. Expediency of applying the computerized phase morphometry express-method in child oncohematology was substantiated.
Key words: acute lymphoblastic leukemia, ^lymphocytes, neutrophils, Lysozime-containing biosystems, polychemotherapy, computerized morphometry.
Сообщение I.
ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ВОЗМОЖНОСТИ КОМПЬЮТЕРНОЙ ФАЗОВОЙ МОРФОМЕТРИИ КЛЕТОК В ДЕТСКОЙ ОНКОГЕМАТОЛОГИИ
Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) является одним из наиболее часто встречающихся онкологических заболеваний детского возраста и в структуре злокачественных новообразований у детей составляет более 25% [3]. Последние десятилетия ознаменовались значительными успехами в лечении ОЛЛ, позволяющими добиться ремиссии более чем у 90% больных. Однако проведение интенсивной полихимиотерапии (ПХТ) сопровождается нежелательными последствиями, связанными с формированием состояния глубокой миело- и иммунодепрессии. На этом фоне многократно увеличивается риск развития тяжелых инфекционных осложнений, особенно вирусной и грибковой этиологии. По данным ряда авторов, летальность от инфекций в период ПХТ у детей с острыми лейкозами может составлять от 5 до 20%. При этом прослеживается прямая связь между числом развития инфекционных эпизодов, выраженностью нейтропе-нии и уровнем повреждения клеточного и гуморального звеньев иммунитета [4].
Важная роль иммунных факторов в патогенезе ОЛЛ убедительно доказана многочисленными экспериментальными и клиническими исследованиями. В то же время следует признать, что детальные механизмы реагирования иммунной системы в условиях агрессивной ПХТ изучены недостаточно. Сведения об особенностях морфофункционального состояния клеточных звеньев неспецифического и адаптивного иммунитета у детей с ОЛЛ немногочисленны и разноречивы [5, 12]. Новым подходом к диагностике лейкозов явилось использование современных иммунологических методов. Так, внедрение гибридомной технологии и получение панели моноклональных антител к дифференцировочным антигенам позволило тестировать клетки больных ОЛЛ по многим маркерным характеристикам и изучать их цитохимические и морфологические показатели. Новые возможности послужили основой для развития одного из перспективных направлений онкогематологии и онкоиммунологии -изучения особенностей иммунологического профиля больных лейкозом на различных этапах заболевания, выявления уровня нарушений морфофункционального состояния иммунокомпетентных клеток и поиска путей их коррекции [10, 13].
Совершенствование способов иммунодиагностики может способствовать выбору адекватной стратегии лечения детей с ОЛЛ, разработке эффективной сопроводительной терапии, неотъемлемой частью которой являются антибактериальные, противогриб-
ковые и противовирусные препараты, а также колониестимулирующие факторы и иммуномодуляторы. В свою очередь это позволит улучшить результаты терапии ОЛЛ и снизить риск развития тяжелых осложнений.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Обследовано 29 детей с острым лимфобластным лейкозом (варианты L-2, L-2/L-4, средний и стандартный риск) в возрасте от 2,5 до 16 лет, находящихся на лечении в НИИ детской онкогематологии ОНЦ им. Н.Н. Блохина. Все пациенты получали программную ПХТ по схеме ALL IC-BFM 2002. Сопроводительное лечение включало антибактериальные (гентамицин, зинацеф, цефазолин, фортум и др.) и противогрибковые (нистатин, дифлюкан и др.) препараты. Обследование больных проводили до начала курса ПХТ.
Клетки (лимфоциты и нейтрофилы) выделяли из 4 мл периферической крови, стабилизированной гепарином (25 ЕД на 1 мл), по методу Boyum на градиенте плотности «Ficoll-Paque» (Amersham Biosciences, Швеция). В пробирках получали две интерфазы: верхняя на границе плазма-фиколл (плотность 1,077 г/см3) -мононуклеары; нижняя - фиколл-фиколл (плотность 1,077-1,093 г/см3) - гранулоциты. Прилипающие к пластику клетки удаляли с помощью инкубации взвеси мононуклеаров на полимерных материалах (чашки Петри диаметром 60 мм Costar, USA). Клетки с низкой адгезивной способностью (Т-лимфоциты) собирали в центрифужные пробирки, концентрировали центрифугированием и доводили суспензию до нужной концентрации добавлением среды 199. Гранулоциты отмывали раствором Хенкса центрифугированием в течение 10 минут при скорости 1,0х103 об/мин. Надо-садок сливали, клетки разводили раствором Хенкса до концентрации 2х106.
Оценку морфофункционального состояния клеток иммунной системы осуществляли методами проточной цитометрии на проточном цитофлюориметре «FACScan» (Becton Dickinson, США) и витальной компьютерной фазовой морфометрии (КФМ) на отечественном фазово-интерференционном микроскопе «Цитоскан» [7]. Комплексный алгоритм морфометрии включал автоматическое определение заданных размерных параметров клеток, статистическую обработку данных и документирование результатов в виде протоколов трех уровней.
I уровень (программа TLUCK) - визуализация фазово-интерференционного образа клетки (топо-грамма, трехмерное изображение, профиль, гистограмма распределения фазовых высот).
II уровень (программа MORPH) - расчет морфометрических показателей отдельных клеток: диаметр
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ - ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ - ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА
(Э), периметр (Р), высота (Н), площадь (А), объем (V); оценка распределения объема и площади фазовоинтерференционного образа клетки по уровням сканирования (взаимодействие с чужеродной поверхностью); контурное изображение топографии интерференционного поля (послойная интерферограм-ма клетки в псевдоцвете).
III уровень (программа STATM) - интегральный анализ клеточной популяции по мерным признакам (Э, Р, Н, А, V), построение гемоцитограмм.
Все полученные данные подвергали статистическому анализу с помощью алгоритмов среды МаНаЬ и математического пакета к^аЙБЙса 6». Стандартная обработка выборок включала подсчет значений средних арифметических величин, ошибок средних, а также величины дисперсии, среднего квадратического отклонения и анализа асимметричности распределения. Различия между сравниваемыми группами рассчитывали по критериям Вилкоксона - Манна - Уитни, Колмагорова - Смирнова или Стъюдента. Уровень значимости устанавливался равным 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Методом витальной КФМ проведена оценка морфофункционального состояния живых циркулирующих клеток крови больных острым лейкозом. На рис. 1 приведены типичные фазово-интерференционные портреты лимфоцита и нейтрофила периферической крови. При анализе полученных изображений оценивали характер рельефа живых клеток и их оптикогеометрические параметры (Э, Р, Н, А, V).
В процессе исследования морфологической структуры гранулоцитов было выделено три основных морфологических типа клеток:
I - клетки округлой формы с четко выраженными границами. Поверхность неровная, бугристая. Цитоплазма плотная, компактная, утолщенная по периферии. Ядра бобовидные, несегментированные или (реже) сегментированные, расположены в центре или по периферии цитоплазмы;
II - клетки разнообразной формы и размера с неровной, бугристой поверхностью. Границы доволь-
Рис. 1. Витальные фазово-интерференционные портреты клеток периферической крови:
■ Т-лимфоцит (топограмма); б - трехмерная реконструкция Т-лимфоцита; в - нейтрофил (топограмма);
г - трехмерная реконструкция нейтрофила
в
г
а
но четкие, сложной формы, извилистые. Цитоплазма более плотная в центре, менее - на периферии. В цитоплазме отдельных клеток определяется зернистость. Отмечаются хорошо сформированные и четко очерченные псевдоподии (2-3 и более). Ядро, преимущественно сегментированное, расположено асимметрично;
III - клетки разнообразной формы и размера с нечеткими размытыми границами. Цитоплазма просветленная, рыхлая, с нарушенной структурой и опустошенными гранулами, вакуолизированная. Ядро сегментированное, расположено асимметрично (рис. 2).
Установлено, что у больных ОЛЛ до начала ПХТ соотношение в циркуляции клеток I, II и III морфологических типов соответственно составляло 48,8±9,2; 25,8±4,2 и 25,4±9,9%, в то время как у соматически здоровых лиц - 19,7±3,1; 71,2±4,3 и 9,1±2,8%. Полученные результаты позволяют предположить, что период обострения лейкоза характеризуется наличием высокого процента клеток I морфологического типа, представленных функционально и структурно незрелыми ней-трофилами. Содержание клеток функционально активных (II тип) и дистрофически измененных нейтрофилов (III тип) остается практически равнозначным.
Изменение средних в популяции размерных клеточных параметров (Э, Р, Н, А, V) нейтрофилов периферической крови больных острым лимфобластным лейкозом представлено в табл. 1. Характерно, что по сравнению с соматически здоровыми лицами у больных уменьшены средние по популяции величины фазовой высоты и объема нейтрофилов на 14 и 10%, соответственно (р<0,05). Среднепопуляционная площадь клеток увеличена на 11% (р<0,05).
При анализе фазово-интерференционных изображений следует учитывать, что размерные параметры фазового портрета содержат информацию не только о пространственно-объемных характеристиках клетки, но и о ее оптических свойствах, в частности, о внутриклеточной анизотропии. Показатель преломления, измеряемый в каждой точке, непосредственно зависит от концентрации, химического состава, агрегатного состояния внутриклеточного вещества, наличия или отсутствия органелл и включений. Изменение любого из указанных условий находит отражение в характерных локальных трансформациях фазового изображения клетки.
Очевидно, что величины диаметра и периметра могут непосредственно отражать все изменения фор-
а б в
Рис. 2. Схема различных морфологических типов живых функционирующих нейтрофильных гранулоцитов периферической крови: а - неактивный нейтрофил (I тип); б - функционально активный нейтрофил (II тип); в - дегенеративно измененный нейтрофил (III тип)
Таблица 1
Средние в популяции размерные показатели фазовых портретов нейтрофилов
периферической крови (М±б)
Группы 0, мкм Р, мкм Н, мкм А, мкм2 V, мкм3
Соматически здоровые 11,5±2,9 35,2±4,1 2,8±0,6 68,4±18,5 86,5±35,6
Больные ОЛЛ 11,3±3,2 34,9±10,4 2,4±0,8* 76,1±38,9* 77,7±44,5*
: достоверность различий: р<0,05.
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ - ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ - ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА
мы, связанные с появлением псевдоподий по мере активации нейтрофилов и реализации их основных эффекторных реакций (фагоцитоза, эндоцитоза, кил-линга, переваривания, выделения биологически активных продуктов). Величина фазовой высоты зависит от особенностей состояния ядерных структур и гранулярного аппарата клетки. Площадь и объем нейтрофи-лов также характеризуют степень активации, дегрануляции и вакуолизации нейтрофилов.
При исследовании морфофункционального статуса лимфоцитарного звена основное внимание было уделено Т-клеточному гейту, поскольку в иммунологической структуре заболевания у обследованных пациентов превалировал пре-В-иммуновариант острого лейкоза, и анализ популяции В-лимфоцитов в силу выраженной неоднородности был затруднен для интерпретации. В табл. 2 приведены средние в популяции значения размерных показателей Т-лимфоцитов больных ОЛЛ до начала ПХТ.
Установлено, что у Т-лимфоцитов больных ОЛЛ по сравнению с показателями нормы наблюдается тенденция к незначительному увеличению средних в популяции значений диаметра, периметра и площади клеток, уменьшению фазовой высоты и объема. При этом отмечено повышение величин стандартного отклонения (ст) по всем анализируемым клеточным параметрам в 1,5 раза, связанное, по-видимому, с выраженной неоднородностью популяции Т-лимфоцитов у обследованных больных.
Разделение клеток по величине их диаметра на малые (менее 6,5 мкм), средние (6,5-8,5 мкм) и большие (более 8 мкм) в определенной мере помогает понять механизм изменений состава Т-лимфоцитов. Так, известно, что малые и средние лимфоциты включают 95% всего количества циркулирующих Т-хелперов и около половины общего числа цитотоксических Т-лимфоцитов. Большие лимфоциты представлены оставшейся половиной цитотоксических Т-клеток и натуральными киллерами. У больных ОЛЛ в популяции зарегистрировано увеличение числа малых лимфоцитов (30 против 25%), снижение количества больших Т-лимфоцитов (8 против 16%), содержание средних Т-клеток практически соответствует значениям соматически здоровых лиц (62 и 59%).
Распределение процентного состава лимфоцитов по величине их фазовой высоты (до 1,5 мкм, от 1,5 до 3,0 мкм и выше 3,0 мкм) составило у больных ОЛЛ 28, 65 и 7%, против 21, 73 и 6% у здоровых. Этот показатель косвенно отражает способность лимфоцитов к пролиферации. Увеличение или уменьшение этого параметра связано со степенью упаковки хроматина в ядре клетки: большая высота соответствует оптически более плотному состоянию ядерных структур и, соответственно, более низкой пролиферативной активности. Этот факт свидетельствует о том, что пролиферативная активность клеток у больных ОЛЛ имеет тенденцию к увеличению: содержание клеток с высотой менее 1,5 мкм на 7% превышает значение нормы.
Результаты иммунофенотипирования выявили у больных ОЛЛ снижение общего числа Т-клеток (СЭ3+) до 48,8% и цитотоксических (СЭ8+) лимфоцитов (ЦТЛ) до 14,0%. Количество активированных Т-лимфоцитов находилось в диапазоне нормальных значений, но ближе к нижней границе нормы (табл. 3). Кроме того, у детей с ОЛЛ было отмечено исходно сниженное содержание ^ (110,0±11,57 МЕ/мл) и ^А (63,19±11,32 МЕ/мл) при повышенном уровне ^М (182,5±30,32 МЕ/мл), однако из-за большого разброса полученных результатов, различия оказались недостоверными.
Для корректной интерпретации полученных данных мы попытались перейти от количественного анализа средних значений морфометрических показателей лимфоцитов и данных традиционной иммунограммы к анализу структуры корреляционных взаимосвязей между ними. Установлено, что величины среднего диаметра и периметра Т-клеток положительно коррелируют с числом лимфоцитов, экспрессирующих активационные молекулы HLA-DR (г=0,39; р=0,09 и г=0,42; р<0,05), и отрицательно - с количеством ЦТЛ (г=-0,33; р>0,05 и г=-0,33; р>0,05). Выявлены отрицательные корреляции числа больших Т-лимфоцитов (Э>8 мкм) с уровнем зрелых Т-клеток (г=0,42; р<0,05). Величина площади фазово-интерференционных портретов Т-лимфоцитов положительно коррелирует с содержанием HLA-DR+клеток (г=0,41; р<0,05).
Для фазовой высоты Т-лимфоцитов характерно наличие отрицательных корреляций с клетками,
Таблица 2
Средние в популяции размерные показатели фазовых портретов Т-лимфоцитов
периферической крови (М±о)
Группы Э, мкм Р, мкм Н, мкм А, мкм2 V, мкм3
Соматически здоровые 7,1±1,1 20,9±3,1 2,2±0,4 32,0±10,1 37,6±13,9
Больные ОЛЛ 7,3±1,5 21,5±4,6 2,1±0,4 34,2±16,1 34,9±16,0*
* достоверность различий: р<0,05.
Таблица 3
Иммунофенотипическая характеристика лимфоцитов периферической крови больных ОЛЛ, %
Показатель Норма Больные ОЛЛ
СЭ3+ (Т-лимфоциты) 60-75 48,8±8,0
СЭ4+ Т-хелперы/индукторы) 35-46 35,2±8,6
СЭ8+ (Т-супрессоры/цитотоксические) 25-30 14,0±2,9
СЭ20+ (В-лимфоциты) 5-15 8,3±3,6
HLA-DR (В-лимфоциты, активированные Т-лимфоциты) 7-15 12,7±4,5
СЭ38+ (активированные лимфоциты) 24-40 31,2±6,6
СЭ25+ (а-цепь рецептора ИЛ-2) 0-5 0,6±0,2
СЭ16+ (ЫК-клетки) 10-20 1,5±0,7
СЭ4+/8+ (иммунорегуляторный индекс) 1,2-2,4 2,45±0,2
несущими маркеры ранней и поздней активации (г=-0,36; р>0,05 и г = -0,36; р>0,05, соответственно), а для фазового объема - с незрелыми или активированными клетками СЭ38+ (г=-0,45; р<0,05). Груп -па Т-лимфоцитов со значениями фазовой высоты от 1,5 до 3 мкм отрицательно коррелирует с количеством лимфоцитов, несущих маркер поздней активации (г=-0,55, р<0,05). Т-клетки с высотой более 3 мкм имеют отрицательные корреляционные связи с содержанием СЭ16+, СЭ8+ и СЭ25+ лимфоцитов (г=-0,58, р<0,05; г=-0,38, р>0,05 и г=-0,41, р<0,05, соответственно).
Полученные данные компьютерной морфоме-трии убедительно свидетельствуют о наличии при остром лейкозе нарушений морфофункционального состояния клеток неспецифического и адаптивного иммунитета. Они выражаются в снижении функциональной полноценности нейтрофилов с изменением их структурно-метаболической организации, перестройке субпопуляционного состава Т-лимфоцитов, связанной с уменьшением содержания цитотоксиче-ских и НК-клеток, повышении пролиферативного потенциала циркулирующих Т-лимфоцитов.
Представленные результаты позволяют сделать вывод о том, что компьютерная морфометрия дает возможность в рамках одного метода оперативно оценить индивидуальные изменения размерных показателей каждого отдельного лимфоцита, проанализировать структуру популяционного состава клеточного звена иммунитета, выявить уровень функциональной полноценности циркулирующих лимфоцитов и даже косвенно судить о возможных изменениях фенотипического профиля иммуноком-петентных клеток. При этом выбор компьютерной фазовой морфометрии в качестве экспресс-метода может быть продиктован следующими его преимуществами:
-возможностью изучения живых нативных клеток крови, не подвергавшихся предварительной обработке, окрашиванию или фиксации;
- оперативному получению высокоточных и объективных данных на основе компьютерной технологии;
- использованию универсальных критериев оценки для любых типов клеток, характеризующих как морфологические, так и функциональные их особенности;
- потребностью малого (не более 3-4 мл) объема крови для одновременного проведения анализа морфофункционального состояния всех клеточных элементов.
Прикладное использование экспресс-метода компьютерной фазометрии клеток может оказаться эффективным при определении состояния нормы или патологии, а также оценке адекватности лечебной коррекции выявленных нарушений. Получение с помощью этого метода качественно новой информации, недоступной при традиционных подходах, может способствовать выявлению некоторых аспектов, касающихся структуры и функции цитообъектов, изучению закономерностей поведения клетки в условиях нормального функционирования, их возможных нарушений при различных патологических состояниях, а также при направленном воздействии физическими, химическими или биологическими факторами. Применение прибора нового типа, каким является компьютерный фазовый интерференционный микроскоп, может оказаться эффективным и экономически оправданным. Ориентировочный круг потребителей, испытывающих острый недостаток в автоматизированных оптических неразрушающих методах контроля, довольно широк. Указанные возможности делают систему мощным универсальным инструментом как для исследовательских, так и для практических целей.
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ - ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ - ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА
Сообщение II.
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ЛИЗОЦИМСОДЕРЖАЩИХ БИОСИСТЕМ НА ФОНЕ ПРОГРАММНОЙ ПОЛИХИМИОТЕРАПИИ
Принципы лечения острых лейкозов у детей были разработаны еще в конце 60-х гг. в США. Они практически не претерпели изменений до сих пор и включают индукцию ремиссии основными препаратами - вин-кристином и преднизолоном, - использование эндо-люмбального введения метотрексата и краниального облучения с целью профилактики нейролейкемии, применение 6-меркаптопурина и метотрексата для поддерживающей терапии в ремиссии. Это означает, что у всех больных применяются четко определенные дозы и комбинации химиопрепаратов в установленные сроки, согласно соответствующему протоколу [1].
Большинство современных протоколов лечения ОЛЛ у детей строится на принципах интенсивной инициальной ПХТ для максимального разрушения пула лейкемических клеток [6]. В то же время совершенствование химиотерапии, связанное с увеличением доз цитостатических препаратов, ограничивается не-специфичностью их действия, так как одновременно с опухолевыми клетками они поражают здоровые органы и ткани, способствуя снижению иммунологической реактивности и гипоплазии костного мозга у больных. У детей в состоянии гранулоцитопении при интенсивной ПХТ увеличивается риск развития опасных инфекций, которые могут привести к летальному исходу [8].
Исследованиями последних лет доказано, что адекватная сопроводительная терапия позволяет предупредить и лечить многие осложнения, связанные с иммуносупрессией и индуцированной цитопе-нией. Эффективная комплексная биокоррекция может быть достигнута применением физиологичных пероральных лизоцимсодержащих биосистем (ЛСБС), ведущим компонентом которых является лизоцим в сочетании с пробиотиками, пребиотиками и природными иммунокорректорами. ЛСБС восполняют дефицит эндогенного лизоцима и обеспечивают реализацию всего широчайшего спектра защитного действия этого уникального мультифункционального фермента, оказывающего корригирующее влияние на различные системы обеспечения гомеостаза и иммунобиологической реактивности организма [2].
Бифилиз является первым комбинированным лизоцим- и бифидосодержащим препаратом, высокоэффективным в комплексном лечении и профилактике дисбактериоза и инфекционно-воспалительных осложнений. Он применяется при вторичных имму-нодефицитных состояниях в педиатрической практике у детей и взрослых при кишечных бактериальных и вирусных инфекциях, гастроэнтерологических заболе-
ваниях, туберкулезе легких, в комплексной профилактике и лечении послеоперационных осложнений и др. Препарат сохраняет свою активность на фоне системной антибиотикотерапии и хорошо сочетается с другими лекарственными средствами [9].
Нами предпринята попытка, используя морфометрические критерии, оценить эффективность применения бифилиза и его сочетаний с натрия нуклеинатом и лактусаном для коррекции иммунореактивности организма в сопроводительном лечении детей с острыми лейкозами при программной ПХТ.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Обследованы две группы детей с острым лимфобластным лейкозом (варианты L-2, L-2/L-4, средний и стандартный риск) в возрасте от 2,5 до 16 лет, находящихся на лечении в НИИ детской онкогематологии ОНЦ им. Н.Н. Блохина. Программную ПХТ по схеме ALL IC-BFM 2002 и сопроводительное лечение антибактериальными (гентамицин, зинацеф, цефазолин, фортум и др.) и противогрибковыми (нистатин, дифлюкан и др.) препаратами получали 13 пациентов, составивших 1-ю группу. Дополнительное сопроводительное лечение ЛСБС проводилось 16 пациентам 2-й группы. Обследование выполняли до лечения и через один месяц после начала курса ПХТ.
Оценку морфофункционального состояния лимфоцитов осуществляли методами проточной цитометрии на проточном цитофлюориметре «FACScan» (Becton Dickinson, США) и витальной КФМ на отечественном фазово-интерференционном микроскопе «Цитоскан» [7].
Для коррекции микробиоценоза кишечника и иммунореактивности больных в сопроводительном лечении при программной ПХТ назначали бифилиз и его сочетания с натрия нуклеинатом, лактусаном и (или) традиционными лактобактерийными пробиотиками -ацилактом, ациполом.
Бифилиз сухой производства ООО «Фермент» (Москва), содержащий в одной дозе 10 мг лизоцима и 107 живых бифидобактерий.
Натрия нуклеинат производства ОАО «Биосинтез» (Пенза) - натриевая соль низкомолекулярной дрожжевой РНК - применяется в медицинской практике в качестве стимулятора Т- и В-систем иммунитета при иммунодефицитах. Используется для стимуляции клеточного метаболизма и нуклеинового обмена, лейкопоэза и антитоксической резистентности организма при широком круге заболеваний, в том числе при лейкопении и агранулоцитозе, для снижения токсического действия цитостатиков, антибиотиков и других лекарственных препаратов при всех формах злокачественных новообразований.
Лактусан производства ЗАО «Фелицата» (Ярославль) -40% сироп лактулозы - является эффективным пребиотиком, обладающим выраженным детоксицирующим действием и стимулирующим эндогенную лакто- и бифидофлору, продукты метаболизма которой улучшают моторику кишечника.
Дети с ОЛЛ получали бифилиз в течение 20 дней, начиная с 10-12-го дня от начала ПХТ. Из них четыре ребенка получали также лактусан (по одной чайной ложке дважды в день в течение первых 10 дней) и натрия нуклеинат (по 0,25 г 2 раза в день с 11-го по 20-й день биотерапии). Двое детей одновременно с бифи-лизом получали аципол и лактусан.
Полученные данные подвергали статистическому анализу с помощью алгоритмов среды МаНаЬ и математического пакета к^аЙБЙса 6».
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При динамическом обследовании детей с ОЛЛ, получавших только химиопрепараты, не обнаружено никаких значимых изменений клеточных показателей Т-лимфоцитов. Анализ результатов КФМ Т-клеток периферической крови не выявил разницы между величинами клеточных параметров до и после курса ПХТ. Наблюдалась лишь тенденция к незначительному уменьшению средних в популяции диаметра, периметра и площади клеток (табл. 4).
При разделении Т-лимфоцитов по величине их диаметра на малые (менее 6,5 мкм), средние (6,58,5 мкм) и большие (более 8 мкм) зарегистрировано незначительное увеличение числа больших лимфоцитов до 14% (р>0,05). Процентное содержание в циркулирующей популяции клеток с различной фазовой высотой (до 1,5 мкм, от 1,5 до 3,0 мкм и выше 3,0 мкм) оставалось практически неизменным: соответственно 25, 67 и 7% против 28, 65 и 7% до лечения.
Полученные результаты морфометрического исследования свидетельствуют о том, что после курса
ПХТ наблюдаются незначительные изменения активационного и цитотоксического потенциала Т-популяции лимфоцитов. Данные иммунофенотипирования также не позволяют сделать однозначных выводов об изменении функционального состояния лимфоцитов, что может быть связано с выраженной гетерогенностью иммунофенотипического профиля клеток у каждого больного ОЛЛ и в значительной мере затруднить итоговую оценку результатов (табл. 5).
Через месяц после начала ПХТ на фоне увеличения общего числа CD3+ клеток отмечалось недостоверное повышение процентного содержания CD4+, CD8+ и CD16+ лимфоцитов. Именно увеличение доли цитотоксических Т-лимфоцитов и натуральных киллеров в популяции нашло отражение в изменении средних морфометрических показателей клеток и количества больших лимфоцитов.
Учитывая имеющиеся в литературе сведения о выраженном иммуномодулирующем эффекте ЛСБС [9, 11], мы провели более детальный анализ результатов КФМ Т-лимфоцитов периферической крови у 16 детей с ОЛЛ, получающих стандартную ПХТ по протоколу ALL IC-BFM 2002 и сопроводительное лечение ЛСБС. Это позволило выделить среди пациентов две подгруппы больных, до проведения очередного курса достоверно отличающихся по величине клеточных параметров (табл. 6).
Для пациентов 1-й подгруппы было характерно значительное увеличение диаметра, периметра, площади и объема клеток при неизменной их фазовой высоте. Содержание больших лимфоцитов возросло до 42%, средних составляло 38%, малых - 20%. У больных 2-й подгруппы клетки обладали достоверно меньшими величинами диаметра, периметра, площади и объема. Фазовая высота оставалась практически такой же, как в группе сравнения. Содержание больших лимфоцитов было снижено до 13%, средних составляло 43%, а малых - 44%. Такая разница в показателях, по-видимому, объясняется многими факторами: степенью тяжести и длительностью заболевания, уровнем
Таблица 4
Средние в популяции размерные показатели Т-лимфоцитов периферической крови детей с острым лимфобластным лейкозом до и после курса ПХТ без сопроводительного лечения ЛСБС (М±о)
Группы D, мкм P, мкм H, мкм S, мкм2 V, мкм3
Больные ОЛЛ до курса ПXТ 7,3±1,5 21,5±4,6 2,1±0,4 34,2±16,1 34,9±16,0
Больные ОЛЛ после курса ПXТ 7,1±1,1 20,7±3,9 2,2±0,4 31,7±12,8 35,2±15,3
* достоверность различий: р<0,05.
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ - ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ - ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА
Таблица 5
Иммунофенотипическая характеристика лимфоцитов периферической крови больных ОЛЛ до и после курса ПХТ без сопроводительного лечения ЛСБС, %
Показатель Норма Больные ОЛЛ
до лечения после лечения
Сй3+ (Т-лимфоциты) 60-75 48,8±8,0 84,0±4,6
Сй4+ (Т-хелперы/индукторы) 35-46 35,2±8,6 49,1±3,6
Сй8+ (Т-супрессоры/цитотоксические) 25-30 14,0±2,9 24,9±6,3
Сй20+ (В-лимфоциты) 5-15 8,3±3,6 2,3±0,3
Н1_А-РК (В-лимфоциты, активированные Т-лимфоциты) 7-15 12,7±4,5 5,9±1,2
Сй38+ (активированные лимфоциты) 24-40 31,2±6,6 36,8±5,9
Сй25+ (а-цепь рецептора ИЛ-2) 0-5 0,6±0,2 1,3±1,1
Сй16+ (ЫК-клетки) 10-20 1,5±0,7 8,4±2,2
СР4+/8+ (иммунорегуляторный индекс) 1,2-2,4 2,45±0,2 2,27±0,7
Таблица 6
Морфометрические параметры Т-лимфоцитов периферической крови больных ОЛЛ, получавших сопроводительное лечение ЛСБС (М±а)
Пациенты й, мкм Р, мкм Н, мкм А, мкм2 V, мкм3
Подгруппа 1 (п=7) до ПХТ 8,3±1,8 24,6±5,4 2,2±0,4 45,1±19,8 52,3±24,1
после ПХТ 7,4±1,2* 21,8±3,9* 2,3±0,4 34,4±12,2* 41,2±14,2*
Подгруппа 2 (п=9) до ПХТ 7,0±1,3 20,0±3,6 2,3±0,4 28,8±9,8 35,4±12,5
после ПХТ 8,2±1,7* 24,1±5,6* 2,1±0,4 41,4±18,8* 44,3±20,7*
* достоверность различий: р<0,05.
бластемии, выраженностью лейкоцитоза, индивидуальной иммунореактивностью, исходной способностью клеток к спонтанному апоптозу и т.д.
После 20 дней лечения с применением ЛСБС у пациентов 1-й подгруппы было отмечено снижение величин клеточных показателей, исходно увеличенных по сравнению с контролем (диаметр, периметр, площадь и объем). Фазовая высота клеток возросла незначительно. Нормализовалось процентное соотношение малых, средних и больших Т-лимфоцитов: 28, 57 и 15%, соответственно. У пациентов 2-й подгруппы, напротив, отмечалось некоторое увеличение исходно сниженных клеточных показателей (диаметра, периметра, площади и объема). Фазовая высота снижалась практически на 10% от исходной величины. Наблюдалось перераспределение соотношения субпопуляций Т-лимфоцитов. Содержание малых, средних и больших Т-клеток составило соответственно 10, 56 и 34%.
Суммированные в табл. 7 результаты иммунофе-нотипирования подтверждают зарегистрированное с помощью КФМ модулирующее влияние ЛСБС. Положительный эффект наглядно проявляется в нормализации фенотипического профиля клеток.
Механизмы Т-клеточных дисфункций при ПХТ окончательно не выяснены. Изменение морфофункционального статуса Т-клеток может быть обусловлено усилением спонтанного апоптоза под действием цитостатиков. Кроме того, модификация различных параметров лимфоцитов может быть следствием дефекта костимуляторной активности антигенпрезен-тующих клеток.
Известно, что в результате воздействия лизоци-ма наблюдается активация макрофагов, Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток, происходит усиление активности противоопухолевого иммунитета. В литературе приводятся сведения о том, что при пероральном
Таблица 7
Иммунофенотипическая характеристика лимфоцитов периферической крови больных ОЛЛ,
получающих сопроводительное лечение ЛСБС, %
Показатель Больные ОЛЛ
подгруппа 1 подгруппа 2
до лечения после лечения до лечения после лечения
Сй3+ (Т-лимфоциты) 79,3±1,4 82,0±3,1 78,2±4,0 68,5±2,7
Сй4+ Т-хелперы/индукторы) 40,0±5,7 43,3±13,9 48,5±0,8 36,7±2,7
Сй8+ (Т-супрессоры/цитотоксические) 36,7±8,7 45,4±9,8 24,7±5,2 29,1±4,6
Сй20+ (В-лимфоциты) 2,5±0,1 4,2±1,9 1,3±0,5 5,6±0,9
Н-А-йК (В-лимфоциты, активированные Т-лимфоциты) 5,6±1,5 15,0±4,6 2,6±0,8 2,6±0,8
Сй38+ (активированные лимфоциты) 29,8±1,7 47,7±17,2 35,1±6,9 58,1±9,7
Сй25+ (а-цепь рецептора ИЛ-2) 0,4±0,2 0,2±0,1 0,6±0,2 0,6±0,2
Сй16+ (ЫК-клетки) 6,2±2,7 8,7±2,6 9,1±3,3 13,1±4,2
Сй4+/8+ (иммунорегуляторный индекс) 1,64±0,7 1,2±0,7 2,28±0,5 1,4±0,3
применении лизоцим расщепляет клеточные стенки бактерий и высвобождает полирибопиримидиновые кислоты и пептидогликаны, способные индуцировать продукцию интерферона и обладающие противоопухолевой активностью.
Активирующее действие лизоцима зависит от его ферментных свойств и специфичности рецепторного аппарата иммунокомпетентных клеток. При прямом воздействии лизоцима на опухолевые клетки повышается их иммуногенность: лизоцим способен расщеплять гликопротеины на поверхности клеточной мембраны как нормальной, так и патологической клетки, что открывает доступ к молекулам МНС-11. Согласно некоторым данным, лизоцим выступает в роли антигена и заставляет опухолевую клетку экспрессировать комплекс из молекулы лизоцима и МНС-11, что приводит к активации цитотоксических Т-лимфоцитов. Следовательно, физиологическая роль лизоцима может быть сравнима с ролью лимфокинов при модуляции лимфоцитов в макрофагопосредованном цитотокси-ческом ответе [11].
Проведенные нами исследования показали, что ЛСБС являются достаточно эффективным средством для коррекции осложнений у онкогематологических больных. Целесообразность проведения сопроводительного лечения ЛСБС подтверждается улучшением показателей иммунореактивности у детей, страдающих острым лейкозом. При этом оральная форма препаратов создает для детей определенные удобства.
ЛИТЕРАТУРА
1. Алейникова О. В., Савва Н.Н., Быданова О. И. и др. Результаты лечения первого рецидива острого лимфобластного лейкоза у детей и подростков: данные ретроспективного мультицентрового исследования (Беларусь
- Россия - Казахстан) // Вопр. гемат., онкол. иммунопа-тол. в педиатрии. 2004. №4. С.14-20.
2. Баранов А.А., Щербакова Э.Г., Дорофейчук В.Г. и др. Ли-зоцимсодержащие биосистемы для профилактики и лечения социально значимых болезней детского возраста // Рос. педиатрич. журн. 2000. №4. С.9-14.
3. Божьева М.Г., Маякова С.В., Тупицын Н.Н. и др. Клинико-гематологические особенности и результаты лечения детей больных острым лимфобластным лейкозом с экспрессией миелоидных антигенов // Рос. онкол. журн. 2003. №1. С.32-34.
4. Борисевич Н.В., Белевцев М. В., Алейникова О. В. Иммунологическая характеристика первых рецидивов острого лимфобластного лейкоза у детей и оценка эволюции иммунофенотипа бластных клеток в рецидиве // Гема -тол. трансфузиол. 2004. №2. С.14-17.
5. Зуева Е.Е., Афанасьев Б. В., Тотолян А.А. Иммунофенотипическая диагностика острых лейкозов методом проточной цитометрии // Мед. иммунол. 2004. №1-2. С.9-24.
6. Осипова Е.Ю., Астрелина Т.А., Румянцев С.А. и др. Клиническое значение исследования спонтанного и индуцированного апоптоза бластных клеток при остром лимфобластном лейкозе у детей // Вопр. гематол. онкол. иммунопатол. в педиатрии. 2004. №4. С.21-24.
7. Шабалин В.Н., Василенко И.А., Бабакова С.В. и др. Новый подход к прижизненной оценке морфофункционального состояния клеток крови человека // Ежегодник национального геронтологического центра. 2002. Вып.1. С.7-14.
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ - ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ - ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА
8. Шевела Е.Я., Сизикова С.А., Тихонова М.А. и др. Характеристика нарушений функциональной активности Т-клеток у больных лимфомами при проведении программной полихимиотерапии // Гематол. трансфузиол. 2004. №1. С.15-19.
11. Cartci F., Cartci C, Ccschia V. et al. Recovery of lymphocyte CD4+/CD8+ ratio in patients treated with lysozyme // Drug Invest. 1992. №4. P.51-57.
9. Щербакова Э.Г. Бифилиз - механизмы действия и клиническое применение // Рос. мед. вести. 2000. №2.
12. Hrusak O., Porwit-MacDonald A. Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias // Leukemia. 2002. V.16. P.1233-1258.
10. Basso G., Buldini B., de Zen L. et al. A new methodological approaches for immunophenotyping acute leukemias // Haemotologica. 2001. V.86. P.675-692.
С.43-53.
13. Richards S.J., Jack A.S. The development of integrated hae-matolopathology laboratories: a new approach to diagnosis of leukemia and lymphoma // Clin. Lab. Haematol. 2003. V.25, No.6. P.337-345.
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ МУЦИНОВ В КАРЦИНОМАХ РАЗЛИЧНЫХ АНАТОМИЧЕСКИХ ОТДЕЛОВ ЖЕЛУДКА
Л.Е. Гаганов, И.А. Казанцева, Л.Е. Гуревич, Н.А. Корсакова
ГУ Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского
(МОНИКИ)
Проведено сравнительное иммуногистохимическое исследование экспрессии муцинов в 55 карциномах желудка, развившихся в различных его отделах и переходных зонах между ними, вне зависимости от гистологического типа опухоли. Показатели экспрессии муцинов в карциномах разных отделов желудка неоднородны. Наиболее частым экспрессируемым муцином является МиС1, наиболее редким - МиС2. Наибольшее количество опухолевых клеток экспрессировали МиС1 (высокая иммунореактивность), наименьшее - МиС2 (низкая иммунореактивность). Карциномы фундального отдела чаще, чем других отделов желудка, экспрессировали МиС1, реже - МиС5, МиС6 и МиС2. Самая большая иммунореактивность к муцинам наблюдалась в карциномах, развившихся на границах анатомических отделов. Частота и интенсивность экспрессии муцинов не зависела от глубины инвазии опухоли.
Ключевые слова: рак желудка, иммуногистохимия, муцин.
COMPARATIVE IMMUNOHISTOCHEMICAL RESEARCH OF MUCIN EXPRESSION IN CARCINOMAS
OF DIFFERENT GASTRIC DIVISIONS
L.E. Gaganov, I.A. Kazantseva, L.E. Gurevich, N.A. Korsakova
M.F. Vladimirsky Moscow Regional Clinical and Research Institute (MONIKI)
Comparative immunohistochemical study of mucin expression (MUC1, -5AC, -6 and -2) was carried out in 55 gastric carcinomas. These mucins originated in cardiac, fundic and antral divisions of the stomach and in transition zones between them regardless of the tumor histologic type. Mucin expression indices were irregular in carcinomas of different gastric divisions. MUC1 is the most frequently expressed mucin, and MUC2 is the rarest one. The majority of tumor cells expressed MUC1 (high immunoreactivity), and the least number of them - MUC2 (low immunoreactivity). Fundic carcinomas expressed MUC1 more frequently as compared to the tumors of the other gastric parts, MUC5, MUC6 and MUC2 being expressed less often. The larger immunoreactivity was shown in carcinomas at the boarders between anatomic structures. Incidence and intensity of mucin expression was independent of the degree of tumor invasion.
Key words: gastric cancer, immunohistochemistry, mucin.
