CC BY
27
Журнал фундаментальной медицины и биологии оригинальные статьи
УДК 612.824-089.843:591.3
ОСОБЕННОСТИ МИКРОГЕМОДИНАМИКИ В ЭМБРИОНАЛЬНОМ НЕЙРОТРАНСПЛАНТАТЕ ЗРИТЕЛЬНОЙ КОРЫ МОЗГА КРЫС
Гафиятуллина Г.Ш., Харахашян А.А., Хананашвили Я.А.
Ростовский государственный медицинский университет, Россия, 344022, пер. Нахичеванский, 29 ggsh@aaanet.ru
Цель. Определить особенности кровоснабжения эмбрионального нейротрансплантата на раннем этапе его интеграции в зрительную область коры головного мозга.
Материалы и методы. Половозрелым крысам-самцам линии Wistar в зрительную область коры головного мозга осуществляли аллогенную гомотопическую трансплантацию 17-дневной эмбриональной нервной ткани. Спустя 4 месяца у крыс определяли особенности поведения, зрительного различения, а методом полярографии измеряли мозговой кровоток и микрососудистые реакции при дозированной фотостимуляции.
Результаты. Крысы с имплантированным в головной мозг нейротрансплантатом осуществляли функцию зрительного различения, отличаясь при этом повышенным уровнем тревожности. Кровоток в нейро-трансплантате распределен неравномерно, его максимальные значения отмечены на глубине 0,6-0,8 мм. Амплитуда дилататорных реакций микрососудов в нейротрансплантате была выше, чем в контрольной зрительной коре.
Заключение. Спустя 4 месяца после аллогенной гомотопической трансплантации эмбриональной нервной ткани микрососуды нейротрансплантата в процессе регулирования кровотока проявляют повышенную дилататорную реактивность.
Ключевые слова: эмбриональный нейротрансплантат, аллогенная гомотопическая трансплантация, головной мозг, мозговой кровоток, регуляция мозгового кровотока.
FEATURES OF MICROHAEMODYNAMICS IN THE EMBRYONIC NEUROTRANSPLANT OF THE VISUAL CORTEX OF THE BRAIN IN RATS
Gafijatullina G.Sh., Kharakhashjan A.A., Khananashvili Ya.A.
Rostov State Medical University 29 Nakhichevansky st., Rostov-on-Don, 344022, Russia ggsh@aaanet.ru
Purpose. To determine the peculiarities of blood supply in embryonic neurotransplant at an early stage of its integration into the visual area of the cerebral cortex.
Materials and methods. Mature rats-males of Wistar line in the visual area of the cerebral cortex was carried out by homotopy allogeneic transplant 17-day embryonic nervous tissue. After 4 months rats were determined behaviors, visual discrimination, measured the cerebral blood flow and microvascular reactions in dosed of photostimulation.
Results. Rats with implanted in the brain with neurotransplant carried out the function of the visual distinction, while a high level of anxiety. The blood flow in neurotransplantation not evenly distributed, and its maximum values occur at the depth of 0.6-0.8 mm. Amplitude dilatatory reactions of microvessels in neurotransplant was higher than in control visual cortex.
Conclusion. 4 months after homotopy allogenic transplantation of embryo nervous tissue microvessels of neurotransplant in the process of regulation of blood flow dilatatory exhibit enhanced reactivity.
Key words: embryonic neurotransplants, homotopy allogeneic transplantation, brain, cerebral blood flow, regulation of cerebral blood flow.
оригинальные статьи
Журнал фундаментальной медицины и биологии
Введение
Нейробиологические исследования свидетельствуют, что трансплантированная в кору головного мозга эмбриональная нервная ткань проявляет уникальные свойства незрелой ткани, а также обладает протекторным действием, обеспечивая нейропластический эффект и активируя в мозге реципиента процессы биосинтеза веществ, необходимых для поддержания тканевого гомеостаза [1].
Известно, что клетки пересаженной эмбриональной ткани проявляют способность развиваться, пролиферировать и дифференцироваться в мозге реципиента [2]. Вместе с тем, многие вопросы о факторах, определяющих интеграцию имплантированной эмбриональной нервной ткани и влияющих на ее жизнеспособность, остаются нерешенными. Очевидно, что один из наиболее важных — это вопрос о характере кровеобеспечения нейротран-сплантата, поскольку полноценная структурно-функциональная реконструкция головного мозга может протекать в условиях адекватного кровоснабжения.
Информативными маркерами состояния эмбрионального нейротрансплантата (ЭНТ), а также его влияния на функциональное состояние мозга реципиента служат характер поведенческих реакций реципиента и уровень деятельности проекционных областей коры мозга. В этом отношении экспериментально изучен вопрос при интеграции ЭНТ в область соматосенсорной коры мозга [3], которая отличается колончатой организацией нейронных популяций. В то же время недостаточно сведений о процессе интеграции ЭНТ в зрительную кору (ЗК) мозга, для нейронов которой в связи с участием в механизмах стереоскопического зрения присуща диспаратность рецептивных полей [4, 5].
Цель исследования состояла в изучении характера кровоснабжения эмбриональной нервной ткани на раннем этапе ее интеграции в зрительную область коры головного мозга крысы-реципиента.
Материалы и методы исследования
Эксперименты выполнены на 20 крысах-самцах линии Wistar массой 180-200 г, из них 12 крыс, которым имплантировали ЭНТ в область ЗК мозга, составили основную группу, а 8 крыс с интактной ЗК — контрольную группу. При проведении экспериментов соблюдались «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», а также этические принципы, принятые Европейским научным фондом (European Science Fundation).
Донорскую ткань получали у 17-дневных эмбрионов крысы. Для этого беременным самкам крыс, наркотизированным кетамином (12,5 мг/кг, внутрибрюшинно), производили «кесарево» сечение, извлекали из рога матки эмбрионы и помещали в 5% раствор глюкозы при t=37 °C. После декапитации и вскрытия мозговых оболочек, из полости черепа эмбриона извлекали мозг и помещали его в новый раствор глюкозы. Далее, руководствуясь координатами атласа пренатального
развития мозга крысы [6], из области, соответствующей зрительной коре, под контролем микроскопа извлекали вещество мозга объемом 1 мм3, используя для этого микрошприц, заполненный 0,9%-ым раствором NaCl. Полученный фрагмент вещества мозга использовали для гомотопической аллоген-ной трансплантации эмбриональной нервной ткани в кору мозга крысы-реципиента.
Крысам-реципиентам, наркотизированным кетамином (12,5 мг/кг, внутрибрюшинно), после фиксации в стереотаксическом приборе трепанировали череп в области проекции ЗК в соответствии с координатами стереотаксического атласа мозга крысы [7]. Через проделанное трепанационное отверстие надрезали твердую мозговую оболочку и микрошприцем удаляли 1 мм3 вещества коры мозга, формируя в ней полость, в которую помещали донорскую эмбриональную нервную ткань. Далее производили аутопластику кости черепа и послойное зашивание тканей головы животного.
Исследования у животных основной группы были проведены через 4 месяца после пересадки ЭНТ, у крыс контрольной группы — в сроки, соответствующие возрасту крыс с ЭНТ.
Функциональное состояние мозга у крыс оценивали на основании их поведения в тесте открытого поля, для чего использовали площадку размером 70*70 см, расчерченную на квадраты с длиной стороны 10 см. При анализе данных учитывали количество перемещений по квадратам (горизонтальная двигательная активность), число стоек (вертикальная двигательная активность), акты груминга и количество выходов в центр площадки.
Функцию зрительного различения у крыс оценивали на основе метода тестирования животных в У-образном лабиринте с освещенным и затемненным отсеками размерами 50*10*40 см. При этом анализировали количество заходов в отсеки лабиринта, время нахождения крыс в движении и продолжительность пребывания в освещенном отсеке.
Исследование кровоснабжения ЭНТ у крыс-реципиентов и ЗК у крыс контрольной группы проводили в условиях острого эксперимента с применением кетаминового наркоза (12,5 мг/кг, внутрибрюшинно). Вначале каждого эксперимента у животных с применением стереотаксической техники производили идентификацию фокуса максимальной активности зрительного вызванного потенциала, для чего в кости черепа проделывали трепанационное отверстие, поверхность мозга покрывали слоем агар-агара, заливали вазелиновым маслом при 1=370С и имплантировали хлорированный серебряный электрод диаметром 200 мкм, посредством которого отводили фокальные ответы на сенсорную стимуляцию. В качестве стимула применяли световое воздействие, производимое фотостимулятором, размещенным на расстоянии 50 см от глаз крысы. Параметры стимуляции составляли: длительность 150 мкс, интенсивность 0,2-0,6 Дж, продолжительность 10 с, перерывы между сериями стимулов 20 с. Фокальные ответы регистрировали посредством электрофизиологической установки УЭФПТ-5 при полосе пропускания усилителей 1-2000 Гц. В идентифицированную зону проекции
Журнал фундаментальной медицины и биологии
первичного зрительного ответа микроманипулятором погружали блок электродов для регистрации локального мозгового кровотока.
Исследование локального мозгового кровотока осуществляли ранее описанным [8] способом, основанном на полярографическом определении рН2 при его электрохимической генерации в мозговую ткань. Паттерны кровотока регистрировали посредством прибора «Физиоблок-01», выходные сигналы с которого после аналогово-цифрового преобразования подвергались автоматизированному компьютерному анализу на основе соответствующих прикладных программ. Определение значений кровотока и его распределение в разных слоях нервных структур осуществляли при ступенчатом (с шагом в 10 мкм) погружении блока электродов. При анализе паттернов кровотока, возникающих в ответ на фотостимуляцию, определяли латентные периоды и амплитуду сосудистых реакций.
После опыта крыс подвергали эвтаназии введением летальной дозы кетамина, череп вскрывали и мозг вместе с погруженными в него микроэлектродами перфузировали вначале 0,9%-ым раствором №С1, а затем 10%-ым раствором формалина. После 7-дневной фиксации фрагменты ЭНТ обезвоживали, заключали в целлоидин, приготовленные срезы окрашивали гематоксилин-эозином и полученные препараты подвергали микроскопированию.
Статистический анализ данных производили с помощью программы Statistica 6.0. Для проверки статистических гипотез, определения значимости различий между выборками использовали Ькритерий Стьюдента для независимых выборок. При наличии достоверных различий распределения признаков от нормального, применяли Т-критерий Уилкоксона и и-критерий Манна-Уитни. Статистически значимыми считали различия между выборками при р< 0,05.
оригинальные статьи
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты исследования поведения крыс в тесте открытого поля представлены в таблице 1, из которой видно, что через 4 месяца после пересадки ЭНТ в зрительную область коры мозга показатели поведенческих реакций крыс-реципиентов отличались увеличением горизонтальной и вертикальной двигательной активности, возрастанием актов гру-минга, что в совокупности свидетельствовало о характерном для них высоком уровне тревожности.
Результаты исследования зрительного различения при тестировании животных в У-образном лабиринте представлены в таблице 2, из которой следует, что крысы-реципиенты через 4 месяца после пересадки им ЭНТ в зрительную область коры обладают способностью к зрительному различению. В то же время у них выявлено увеличение времени нахождения в движении и уменьшение продолжительности нахождения в освещенном отсеке лабиринта, что также отражало наличие у крыс с ЭНТ повышенного уровня тревожности.
Таблица 1
Изменения поведенческих реакций в тесте открытого поля у крыс с эмбриональным
нейротрансплантатом через 4 месяца после пересадки
Показатель Крысы с ЭНТ Контроль
Перемещения по квадратам 79,3+5,43* 60,8+9,32
Стойки 27,3+1,29* 10,5+5,12
Груминг 23,5+5,44* 9,0+2,45
Выходы в центр 1,2+0,60 0,7+0,05
Обозначения: * - различие достоверно по сравнению с контролем при р < 0,05;
ЭНТ - эмбриональный нейротрансплантат.
30 20 10 ■
ЭНТ
-=ц
ги.
0 10 20 30 40 50 60 70 80
30 20 ■ 10 о
Контроль
-Ш-
пи
10 20 30 40 50 60 70 80
Рисунок. Гистограммы распределения интенсивности кровотока в условиях функционального покоя в эмбриональном нейротрансплантате через 4 месяца после пересадки и в контрольной зрительной коре.
Обозначения: по оси абсцисс - классы значений интенсивности мозгового кровотока; по оси ординат - число значений в каждом классе (в % к общей выборке); ЭНТ - эмбриональный нейротрансплантат.
оригинальные статьи
Журнал фундаментальной медицины и биологии
Таблица 2
Изменения показателей зрительного различения в Y-образном лабиринте у крыс с эмбриональным нейротрансплантатом через 4 месяца после пересадки
Показатель Крысы с ЭНТ Контроль
Число заходов в отсеки 13,4+5,78 14,7+2,34
Время в движении, с 11,8+4,12* 3,7+3,12
Нахождение в освещенном отсеке, с 2,3+0,40* 5,8+1,39
Обозначения: * — различие достоверно по сравнению с контролем при р<0,05;
ЭНТ - эмбриональный нейротрансплантат.
Исследование мозгового кровотока у крыс в состоянии функционального покоя показало, что при ступенчатом погружении электродов в ЭНТ значения его интенсивности варьировали в диапазоне от 26 до 69 мл/100г/мин. Наибольшие значения кровотока были зарегистрированы на глубине 0,5-0,7 мм. Гистограмма распределения величин кровотока имела близкую к симметричной форму (рис.), значение моды величин соответствовало 4550 мл/100г/мин. Интенсивность кровотока в ЭНТ составила в среднем 42,9+2.3 мл/100г/мин.
У контрольных крыс величина кровотока в ЗК варьировала по глубине коры от 35 до 81 мл/100г/ мин, а максимальные его значения были зарегистрированы на глубине 0,6-0,8 мм. Гистограмма распределения интенсивности кровотока имела близкую к симметричной форму (рис.), мода значений находилась в диапазоне 55-60 мл/100г/мин. Интенсивность кровотока составила в среднем 55,9+1,9 мл/100г/мин.
Из приведенных данных следует, что через 4 месяца после пересадки интенсивность кровоснабжения ЭНТ в состоянии функционального покоя была в среднем на 23,2% ниже (р<0,05), чем в ЗК крыс контрольной группы.
В опытах с регистрацией мозгового кровотока у крыс в условиях их фотостимуляции установлено, что в ответ на сенсорное воздействие, как в ЭНТ у крыс-реципиентов, так и в ЗК у крыс контрольной группы возникали вазодилататорные реакции, сопровождающиеся увеличением интенсивности кро-
вотока и отражающие развитие функциональной гиперемии.
Сравнительный анализ пространственно-временных параметров функциональной гиперемии показал (табл. 3), что через 4 месяца после пересадки в ЭНТ по сравнению с контрольной ЗК не было выявлено различий в продолжительности латентного периода вазодилататорных реакций, тогда как амплитуда этих реакций в ЭНТ была примерно в 1,8 раза больше (р<0,05).
Таблица 3
Параметры функциональной гиперемии в эмбриональном нейротрансплантате через 4 месяца после пересадки и в зрительной коре мозга контрольных крыс
Параметры ЭНТ ЗК
Латентный период, с 5,1+0,83 6,4+2,61
Амплитуда, % 15,4+1,67* 8,4+4,84
Обозначения: * — различие достоверно по сравнению с ЗК при р<0,05;
ЭНТ — эмбриональный нейротрансплантат; ЗК — зрительная кора контрольных крыс.
Из этого следует, что микрососудам ЭНТ свойственна повышенная дилататорная реактивность при осуществлении ими регуляторных реакций, компенсирующих наличие исходно сниженной интенсивности кровоснабжения нервной ткани [9] и обеспечивающих жизнеспособность ЭНТ на раннем этапе ее интеграции в зрительную область коры головного мозга крысы-реципиента.
Выводы
1. Трансплантация эмбриональной нервной ткани в зрительную область коры на раннем этапе интеграции оказывает влияние на функционирование мозга крыс-реципиентов, что, в частности, проявляется повышением уровня тревожности.
2. Кровоснабжение пересаженной в мозг реципиента эмбриональной нервной ткани отличается исходно сниженным уровнем в состоянии функционального покоя.
3. На раннем этапе интеграции с мозгом реципиента микрососудистые реакции в пересаженной эмбриональной нервной ткани характеризуются повышенной дилататорной способностью.
ЛИТЕРАТУРА
1. de Gobbi FH, Foxa AM, Tuscha ES, Sorondb F, Mohammed AH, Daffnera KR. In vivo evidence for neuroplasticity in older adults. Brain Research Bulletin. 2015; 114:56-61.
2. Coyne T, Marcus A, Woodbury D. Stromal cells transplanted to the adult brain are rejected by an inflammatory response and transfer donor Labels to Host Neurons and Glia. Stem Cells. 2006; 24:2483-92.
3. Гафиятуллина Г.Ш., Хананашвили Я.А. Принципы организации эмбрионального нейротрансплантата коры головного мозга. Вест. новых мед. технологий. 2011; ХVШ(1):100-4. [Gafijatullina G.Sh., Khananashvili Ya.A. Principles of organization of somatic brain embryonic neurotransplant. J New Medical Technologies. 2011; ХУШ(1):100-4. (In Russ.)].
4. Mountcastle VB. The columnar organization of the neocortex .Brain;1997 120:701-22.
5. Hubel DH, Wiesel TN. Brain and visual perception: the story of a 25-year collaboration. Oxford University Press US; 2005.
6. Altman J., Bayer SA. Atlas of Prenatal Rat Brain Development. FL. USA CRC Press. Boca Raton; 1995.
7. Konig J, Klippel RA. Stereotaxic Atlas of Forebrain and Lower Parts of the Brain Stem. Baltimor; 1963.
8. Гафиятуллина Г.Ш., Хананашвили Я.А., Харахашян А.А. Циркуляторно-метаболическое обеспечение и биоэлектрическая активность эмбрионального нейротрансплантата зрительной коры мозга крыс. Изв. вузов. Сев.-Кавк. регион. Естеств. Науки; 2006: С.16-9.
[Gafijatullina G.Sh., Kharahashjan A.A., Khananashvili Ya.A. Circulatory maintenance and functional activity of visual cortex embryonic neurotransplant at rats. University news North-Caucasian region. Natural sciences series; 2006: С. 16-9. (In Russ.)].
9. Rosenstein JМ, More NS. Immunocytochemical expression of the blood-brain barrier glucose transporter (GLUT-1) in neural transplants and brain wounds. J Comp Neur 1994;58(2): 229-40.
