CC BY
61
ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА ГЛУТАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ И ОКСИДА АЗОТА В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ НОВОРОЖДЕННЫХ КРЫСЯТ, РАЗВИВАВШИХСЯ В УСЛОВИЯХ НАРУШЕНИЯ МАТОЧНО-ПЛАЦЕНТАРНОГО КРОВООБРАЩЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ МАГНЕ В6
Томилова И. К.1*, кандидат медицинских наук,
Громова О. А.2’3, доктор медицинских наук,
Слободин В. Б.1, доктор медицинских наук
1 Кафедра биологической химии ГБОУ ВПО «Ивановская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, 153012, Иваново, просп. Ф. Энгельса, д. 8
2 Кафедра фармакологии и клинической фармакологии ГБОУ ВПО «Ивановская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России
3 Российский сотрудничающий центр Института микроэлементов ЮНЕСКО, 109652, Москва, Большой Тишинский пер., д. 26, стр. 15/16
РЕЗЮМЕ В головном мозге новорожденных крысят, развивавшихся в условиях недостаточности маточно-плацентарного кровообращения и применения препарата Магне В6, исследовали обмен глутаминовой кислоты и оксида азота. Показано, что применение Магне В6 оказывает протективное действие на метаболические процессы, причем в большей степени в ранние сроки беременности.
Ключевые слова: нейроонтогенез, глутаминовая кислота, оксид азота, Магне В6, нарушение маточно-плацентарного кровообращения, крысы.
* Ответственный за переписку (corresponding author): тел.: 8-910-990-86-09.
Работа поддержана грантом РФФИ № 09-04-97552
Общеизвестно, что патологическое течение антенатального периода часто приводит к задержке внутриутробного развития, повреждению различных органов и систем. Среди неблагоприятных факторов, действующих в этот период, большое значение имеет нарушение маточно-плацентарного кровообращения (МПК), которое, в свою очередь, приводит к развитию гипоксии, являющейся центральным звеном патогенеза антенатального повреждения плода [1, 5], особенно его центральной нервной системы (ЦНС).
В последние годы благодаря успехам современной науки особый интерес в изучении патогенеза гипоксических церебральных поражений вызывают исследования роли нейромедиаторов ЦНС, прежде всего глутамата и оксида азота (II). Механизм повреждающего действия глутаминовой
кислоты связан с перевозбуждением глутамат-ергических рецепторов, повышением внутриклеточной концентрации кальция и активацией ряда ферментов, катализирующих гиперпродукцию оксида азота и вызывающих интенсификацию перекисного окисления липидов [2, 4]. Биологическая роль оксида азота связана не только с его участием в регуляции церебрального кровотока, но также с синтезом высокоактивных радикалов, которые приобретают особое значение в гибели клеток при гипоксии [4, 6].
Естественным антагонистом кальция является магний, основная функция которого - защита нервной системы от всевозможных стрессов. Потребность именно в этом элементе у беременной женщины возрастает в несколько раз [14]. Причинами гипомагниемии являются гестоз, уг-
Tomilova I. K., Gromova O. A., Slobodin V. B.
THE PECULIARITIES OF GLUTAMINIC ACID AND NITROGEN OXIDE METABOLISM IN THE BRAIN OF NEWBORN RATS WHICH HAD BEEN DEVELOPED IN UTEROPLACENTAL CIRCULATION DISORDER AND MAGNE B6 ADMINISTRATION
ABSTRACT Glutaminic acid and NO metabolism was studied in the brain of newborn rats which had been developed in insufficient uterinoplacental circulation and Magne B6 administration. It was demonstrated that Magne B6 taking exerted protective influence over metabolic processes and to an even greater degree in the early terms of pregnancy.
Kev words: neuroontogenesis, glutaminic acid, NO, Magne B6, uteroplacental circulation disorder, rats.
роза прерывания беременности, плацентарная недостаточность [11]. Дефицит магния приводит к спастическому сокращению матки, что, в свою очередь, еще больше ослабляет МПК, увеличивает вероятность преждевременных родов, самопроизвольных абортов [4]. Гипомагниемия очень часто сопровождается дефицитом пиридоксина, влияющего на уровень и метаболизм биогенных аминов и нейромедиаторов, в частности, глутаминовой кислоты и глутамина в нервной ткани [8]. При этом симптоматика дефицита пиридоксина во многом перекликается с клинической картиной магниевого дефицита, что обусловливает их применение в сочетанном виде.
Цель работы - исследовать особенности метаболизма глутамата и оксида азота в головном мозге новорожденных крысят, развивавшихся в условиях нарушения МПК и применения препарата Магне В..
6
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Эксперимент проводился на белых беспородных беременных крысах массой 220-280 г. Первые сутки беременности определялись по наличию во влагалищных мазках сперматозоидов. Модель нарушения МПК воспроизводилась по методике М. М. Вартановой [3] путем перевязки 1/3 препла-центарныхсосудов на 16-17-е сутки беременности, т. е. в тот период, когда после завершения плацен-тации плод полностью переходит на плацентарное кровообращение. На 2-е сутки после рождения проводилось взвешивание крысят, измерялась их длина, оценивалось состояние кожных покровов, двигательной активности, после чего они декапи-тировались с извлечением головного мозга.
Новорожденные крысята были разделены на 3 группы. Первую группу составили животные, развивавшиеся в условиях нарушенного (опытная подгруппа) и нормального (контрольная подгруппа) МПК.
Вторую группу составили 2-дневные крысята, развивавшиеся в условиях нарушенного (опытная подгруппа) и нормального (контрольная подгруппа) МПК, но родившиеся от крыс, которым вводился препарат Магне В6 после операции с 16-го дня беременности (т. е. после моделирования нарушения МПК).
Третью группу составили крысята, развивавшиеся в условиях нарушенного (опытная подгруппа) и нормального (контрольная подгруппа) МПК и родившиеся от крыс, которым препарат Магне В6 вводился с 6-го дня беременности. Выбор срока определялся данными литературы о том, что критически низкий уровень пиридоксина (витамина В6) отмечается у женщин к концу первого триместра
[11, 14]. Магне В6 вводился беременным крысам внутрижелудочно в дозе, рекомендуемой беременным и кормящим женщинам, - 10-15 мг/кг/сут.
В митохондриальной и цитоплазматической фракциях головного мозга крысят определялись показатели обмена глутамата: количество глутаминовой кислоты [7], активность глутаматде-гидрогеназы [10], активность глутаминазы [12], активность аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (ACT) с помощью набора реактивов (унифицированный метод определения активности аминотрансфераз по Рей-тману и Френкелю).
О метаболизме оксида азота косвенно судили по суммарному количеству его конечных метаболитов - нитрит- и нитрат-ионов (устанавливаемому с использованием реакции Грисса [17] после восстановления последних хлоридом ванадия), а также по уровню продукта NO-синтазной реакции -цитруллина [16].
Микроэлементный статус определялся методом эмиссионной спектрометрии с индукционно связанной аргоновой плазмой (работа проделана сотрудниками независимого экспертно-аналити-ческого совета по разработке и внедрению современных методов исследований и анализа на базе кафедры неорганической и аналитической химии МСХА им. К. А. Тимирязева и кафедры клинической и лабораторной диагностики РГМУ).
Статистическая обработка результатов проведена по общепринятым методикам параметрической и вариационной статистики. Достоверность различий данных рассчитывалась по критерию Стьюдента с помощью программы «Statistica» 5.5 и электронных таблиц «Microsoft Excel».
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В головном мозге новорожденных крысят, развивавшихся в условиях нарушения МПК, содержание глутаминовой кислоты было достоверно выше в 1,4 раза по сравнению с контролем (9,26 ±1,03 и 6,56 ± 0,71 ммоль/г ткани соответственно) (табл. 1).
Учитывая, что комплексная система компартмен-тализации нейронов предполагает разделение метаболического и нейротрансмиттерного (ме-диаторного) пула глутамата, для оценки состояния метаболического пула была определена активность глута м атд е гид ро ген азы, ACT и АЛТ, которые в мозге новорожденных крысят, развивавшихся при недостаточности МПК, были увеличены по сравнению с контролем (табл. 1).
В качестве предшественника медиаторного пула рассматривают глутамин [6, 9], поэтому глутами-наза может быть использована как маркер актив-
ности глутаматергических нейронов. В головном мозге крысят опытной группы ее активность оказалась достоверно выше в 1,36 раза (табл. 1).
Таким образом, метаболический пул глутамата уменьшался, что можно рассматривать как компенсаторно-приспособительную реакцию при гипоксии, направленную на интенсификацию окислительной его утилизации с целью энергообеспечения нейронов. Однако увеличение количества медиаторного глутамата приводит к избыточной активации глутаматных рецепторов, при этом в роли вторичного посредника выступают ионы кальция [4]. Образование глутамат-рецеп-торного комплекса приводит к увеличению внутриклеточной концентрации Са2+ (за счет открытия связанных с Ы1\ЮА- и АМРА-рецепторами кальциевых каналов) наряду с перекисной модификацией самих рецепторов в условиях гипоксии.
И действительно, содержание Са2+ в гомогенатах головного мозга опытных крысят было увеличено в 1,36 раза, в то время как концентрация модулятора его внутриклеточных эффектов - Мд2+-оказалась достоверно ниже (табл. 2). Рост уровня кальция вызывает активацию протеинкиназ, фос-фолипаз, протеаз, нитроксидсинтетазы, а также нарушение митохондриальных функций и образование свободных радикалов [15].
Применение Магне В6 вызвало неоднозначные изменения содержания кальция. Так, в головном мозге опытных плодов второй группы оно не только уменьшилось по сравнению со значениями контрольной подгруппы, но и оказалось на уровне показателей интактных крысят первой группы. В третьей группе концентрация кальция в опыте была выше - на уровне показателей опытных животных первой группы (табл. 3).
Содержание магния было увеличено в головном мозге опытных крысят как второй, так и третьей групп (табл. 3). Полученные данные можно рассматривать как доказательство положительного влияния Магне В6, т. к. увеличение концентрации магния уменьшает проявления эксайтотоксичнос-ти глутамата, что подтверждается высоким уровнем отрицательной корреляции между его содержанием и концентрацией Мд2+ (г = -0,91).
Изучение метаболизма другого нейромедиатора, оксида азота, показало достоверное увеличение суммарного содержания его конечных метаболитов (нитрит- и нитрат-ионов) в головном мозге крысят, развивавшихся при недостаточности МПК. Полученные результаты были подтверждены повышенной концентрацией продукта ЫО-син-тазной реакции - цитруллина (табл. 3).
Таблица 1. Показатели обмена глутаминовой кислоты в головном мозге новорожденных крысят
Подгруппа Содержание глутамата, ммоль/г Активность ГДГ, мкмоль НАДФ/мин/мг Активность АСТ, мкмоль/г/ч Активность АСТ, мкмоль/г/ч Активность глутаминазы, нмоль/мин/мг
Контрольная 6,56 ± 0,71 12,89 ± 0,61 215,5 ± 18,0 15,9 ±0,88 25,16 ±2,65
Опытная 9,26 ± 1,03* 15,42 ±0,89* 317,0 ± 27,2** 22,05 ± 1,9* 34,39 ±2,33*
Примечание. Достоверность различий между контрольной и опытной подгруппами: * - р < 0,05, ** - р < 0,01 Таблица 2. Содержание микроэлементов в головном мозге новорожденных крысят
Элемент, мкг/г Первая группа Вторая группа Третья группа
Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль Опыт
Са 21 643 ± 407 29 423 ± 467* 25 227 ± 670 22 057 ± 89* 23 996 ± 1460 29 815 ± 1 820*
Мд 2 601 ± 106 1 457 ± 370* 2 254 ± 37 1 715 ±69* 1 921,4 ± 143 2 275 ± 97**
Примечание. Достоверность различий между контрольной и опытной подгруппами в каждой группе: * - р < 0,001, Таблица 3. Показатели метаболизма оксида азота (II) в головном мозге новорожденных крысят
Показатель, ммоль/л Первая группа Вторая группа Третья группа
Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль Опыт
Нитрит- и нитрат-ионы 23,89 ±5,7 44,8 ±4,1* 81,13 ± 9,1 86,8 ±11,7 92,3 ± 16,2 101,5 ±26,4
Цитруллин 0,85 ±0,06 0,74 ± 0,05* 0,83 ± 0,07 0,88 ±0,05 1,38 ± 0,06 1,4 ±0,09
Примечание. Достоверность различий между контрольной и опытной подгруппами каждой группы: * - р < 0,001
Применение Магне В6 не вызвало изменений метаболизма оксида азота у опытных крысят второй и третьей групп по сравнению с данными контрольных подгрупп, однако по сравнению с показателями первой группы отмечалось значительное увеличение содержания его метаболитов (табл. 3).
Как известно, значение проявляемых N0 метаболических эффектов неоднозначно. С одной стороны, N0 является мощным вазодилататором, что способствует улучшению кровоснабжения тканей. Известны и антиоксидантные свойства оксида азота, которые препятствуют протеканию перекисного окисления липидов [4]. С другой стороны, в последние годы установлено, что N0 играет важную роль в гибели клеток при гипоксии, поскольку он реагирует с липофильными перок-сидными радикалами, приводя к генерации значительно более стабильных алкилпероксинитри-тов (ЮОЫО) [13]. Кроме того, имеются данные, что N0 может опосредовать эксайтотоксичность глутамата [9], и, напротив, накопление глутама-та может снижать активность ЫО-синтазы в коре мозга [4]. Косвенным подтверждением является высокий уровень положительной корреляции между содержанием нитрат- и нитрит-ионов и концентрацией Са2+и Мд2+ в нашем исследовании (г=0,9иг = 0,7 соответственно).
ЛИТЕРАТУРА
1. Барашнев Ю. И. Гипоксическая энцефалопатия: гипотезы патогенеза церебральных расстройств и поиск методов лекарственной терапии//Рос. вестн. пе-ринатологии и педиатрии. - 2002. - № 1. - С. 6-13.
2. Болдырев А. А. Взаимодействия между глутаматны-ми рецепторами // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2000. - Т. 130, № 9. - С. 244-251.
3. Вартанова М. М. Патогенез и профилактика синдрома отставания в развитии плода при плацентарной недостаточности и его отдаленные последствия : дис. ... д-ра мед. наук. - П., 1984.
4. Васильева Е. М, Баканов М. И. Биохимические изменения при неврологической патологии // Биомедицинская химия. - 2005. - Т. 51, вып. 6. - С. 581-602.
5. Фармаколазерная профилактика перинатальных осложнений фетоплацентарной недостаточности / О. В. Васильева [и др.] // Педиатрия. - 2007. - Т. 86, № 1. - С. 119-126.
6. Гомазков О. А. Системы нейрохимической регуляции при патологии мозга // Биомедицинская химия. -2004. - Т. 50, № 4. - С. 321-343.
7. Ещенко Н. Д. Определение количества глутаминовой кислоты в тканях // Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен) : учеб. пособие / под ред. М. И. Прохоровой. - П., 1982. -С. 244-246.
8. Влияние пиридоксальфосфата на метаболизм глутамина в субклеточных фракциях мозга / Р. Г. Ка-малян [и др.] // Нейрохимия. -1999. - Т. 16, №3. -С. 227-229.
ВЫВОДЫ
В патогенезе повреждений головного мозга новорожденных крысят, развивавшихся в условиях нарушенного МПК, играет роль эксайтотоксичность глутамата, реализуемая посредством увеличения концентрации кальция и уменьшения содержания магния. В то же время метаболический пул глутамата в условиях гипоксии истощается, по-ви-димому, обеспечивая энергией и пластическими ресурсами процессы синтеза белка, нуклеиновых кислот, фосфолипидов и других компонентов клеток головного мозга.
Применение Магне В6 оказывает положительный эффект на состояние метаболизма глутаминовой кислоты, т. к. увеличение концентрации магния снижает проявления эксайтотоксичности повышенного уровня глутамата.
Гиперпродукцию N0 можно рассматривать как компенсаторно-приспособительную реакцию в условиях гипоксии при нарушении МПК и применении Магне В6, направленную на усиление кровотока в ишемизированной ткани мозга, поскольку N0 является мощным вазодилататором и антиоксидантом. Однако необходимо принимать во внимание неоднозначность роли N0: с нарастанием его концентрации в тканях цитопротективный эффект сменяется цитотоксическим.
9. Квривишвили Г. И., Митагвария Н. П. Современные представления о роли глутамата в ишемических повреждениях ткани головного мозга //Рос. физиол. журн. им. И. М. Сеченова. - 1999. - Т. 85, № 12. -С. 1489-1495.
10. Клюева Н. Н. Определение активности глутамат-дегидрогеназы в митохондриях тканей животных // Вопр. мед. химии. - 1978. - № 1. - С. 49-51.
11. Кудрин А. В., Громова О. А. Микроэлементы в неврологии. - М., 2006.
12. Лебедева 3. И., Березов Т. Т., Орехович В. Н. Глутамин(аспарагин)аза из Pseudomonas Aurantia-са ИЛЬИ-548 // Биохимия. - 1981. - Т. 46, вып. 1. -С. 85-88.
13. Раевский К. С. Роль оксида азота в глутаматерги-ческой патологии мозга // Вестн. РАМН. - 2000. -№4. -С. 11-15.
14. Спасов А. А. Магний в медицинской практике. - Волгоград, 2000.
15. Beal М. F. Mechanism excitotoxicity in neurological disease // FAS ЕВ J. - 1992. - Vol. 6, № 15. -P. 3338-3344.
16. Colorimetric determination of citrulline residues in proteins / K. Sugavara [et al.] // Analytical biochemistry. -1998.-№ 265.-P. 92-96.
17. Способ определения содержания нитрит-ионов как конечного метаболита оксида азота II // Р. Дж. Фланаган [и др.] // Основы аналитической токсикологии. - Женева, 1997.
