CC BY
65
УДК 616-006:612.13
ОСОБЕННОСТИ КЛОНАЛЬНОЙ ЭВОЛЮЦИИ ПРИ ОНКОГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ
С.Н. Колюбаева, А.В. Новицкий, В.В. Тыренко, Н.А. Викторова, О.Р Краснова,
А.М. Иванов, Д.А. Горностаев
Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург, Россия
CANCER CLONES EVOLUTION IN SOME FORMS OF HAEMOBLASTOSIS
S.N. Kolubaeva, A.V. Novitsky, V.V. Tyrenko, N.A. Victorova, O.P Krasnova,
A.M. Ivanov, D.A. Gornostayev Military Medical Academy, St. Petersburg, Russia
© Коллектив авторов, 2011
Показано, что эволюция опухолевых клонов при гемобластозах идет в двух основных направлениях. Первое - это независимое один от другого развитие клонов, заключающееся в накоплении повреждений, которые не повторяются в других клонах. И второе - в котором появившийся первичный клон постепенно усложняется добавлением новых повреждений. Возможное объяснение заключается в высокой генетической нестабильности клеток, которая реализуется появлением множественных аберраций Иерархически гематологическая опухоль может происходить как из стволовых нормальных клеток, так и из нормальных клеток-предшественников, как это уже показано для некоторых форм лейкозов
Ключевые слова: клональная эволюция, лимфопролефиративные заболевания, лимфоциты периферической крови, повреждения хромосом.
The process of cancer clones evolution in haemoblastosis is going in two directions. The first direction comprises development of independent clones each of them accumulating specific injuries not find in other clones. The second direction consists in one initial clone becoming more complex by addition of new injuries. Both directions may be explained by high genetic unstability of the cells. Haematological cancer may have origin in normal stem cells and in normal precursor cells as it was shown for some forms of leucosis.
Key words: clones evolution, lymphoproliferative diseases, peripheral blood lymphocytes, chromosome injuries.
Стволовые раковые клетки, подобно нормальным, обладают способностью к самообновлению и репродукции гетерогенных опухолевых клеток. В отличие от нормальных тканевых клеток, они характеризуются достаточно продолжительным сроком жизни и высокой способностью к обновлению свойствами, которые позволяют клеткам аккумулировть мутации и передавать их по наследству, формируя при этом опухолевые клоны [11-
Обновление тканей, как полагают сейчас, жестко регулируемый процесс, представляющий собой иерархию медленно пролиферирующих стволовых клеток, быстро пролиферирующих транзитных клеток и терминально дифференцированных клеток со специфичными функциями определенного органа. Клиническое и патоморфологическое выделение различных субтипов рака является следствием выбора мишени и профиля мутаций в клеточных популяциях [2].
Серия мутаций, которые возникают в течение многих лет в стволовых клетках, по мнению многих исследователей, является причиной возникновения рака. Доказательством этому могут служить данные по раку молочной железы у выживших при бомбардировках Хиросимы и Нагасаки [3]. Через 30 лет после радиационного воздействия выявлено повышенное число случаев рака молочной железы. Мутации, обнаруженные в опухолях молочной железы этих женщин, соответствовали тем, которые выявляются при радиационном поражении. Более того, женщины, облученные в юном возрасте, имели более высокий уровень предрасположенности к раку, что, видимо, связано с более высоким содержанием стволовых клеток в молочной железе в этом возрастном периоде.
Определенные доказательства существования стволовых клеток рака молочной железы получены [3,4]. С помощью проточного цитофлуо-риметра опухолевые клетки были разделены по
экспрессии их поверхностных маркеров CD24-CD44 с высокой способностью к опухолеобразо-ванию. Около 200 таких клеток требовалось для формирования опухоли у мышей линии NOD/ SCID. При этом инъекция нескольких тысяч клеток с различными опухолевыми маркерами не способна была сформировать опухоль у этих же животных. Таким образом, данные подтверждают модель канцерогенеза из стволовых клеток, в которой предполагается существование небольшой популяции опухолевых клеток с определенным фенотипом, способной дать рост опухоли и популяции клеток, не способной к опухолеобразованию.
В то же время установлено, что для образования лейкоза у этих же животных достаточно одной лейкозной клетки. Таким образом, при лейкозах, по-видимому, любую клетку можно рассматривать как стволовую опухолевую клетку. Возможно, эти кардинальные отличия от солидных опухолей кроются в природной способности гематологических предшественников к миграции, что, в свою, очередь, определяется различным микроокружением этих двух видов опухолевых клеток [5, 6]. Уменьшение р катенина приводит к нарушению развития индуцированного у мышей хронического миелоидного лейкоза. Кроме того, установлено, что мутации в гене GSK3 р, продуценте ингибитора р катенина, часто выявляются в бластном кризе при хроническом миелоидном лейкозе. Изменения в сигнальной нише, включая инактивацию процессов пролиферации, могут также влиять на самообновление стволовых клеток и опухо-леобразование. Установлено, что миелопроли-феративные заболевания могут быть вызваны дефицитом микроокружения у-рецепторов для ретиноловой кислоты.
В соответствии с теорией клональной эволюции [7, 8] в солидных опухолях только незначительная часть популяции клеток обладает способностью к метастазированию. Предполагают, что этот потенциал приобретается клеткой в результате соматических мутаций, которые позволяют клеткам диссеминировать и пролиферировать на большие расстояния от основной опухоли. Если бы это происходило на поздних стадиях канцерогенеза, то спектр аберраций в метастазах был бы сходен с теми, которыми характеризуется первичная опухоль. Однако это не всегда так, что подтверждено молекулярногенетическим и хромосомным анализом, которые выявляют независимую параллельную эволюцию происхождения метастазов и опухоли.
Более того, в работах [8, 9] произведено сравнение повреждений в геноме первичной опухоли молочной железы и микрометастазов в костном мозге, что также подтверждает концепцию независимой диссеминации и эволюции от первичной опухоли. В этом также состоят отличия поведения солидных и гематологических опухолей, так как последние, как правило, имеют идентичные нарушения как в костном мозге и лимфатических узлах, так и в периферической крови, месте диссеминации.
Ответ на вопрос о том, какие молекулярные механизмы определяют судьбу стволовой клетки, по-видимому, тесно связан с вопросом об утрате стволовыми клетками клеточной полярности во время деления, при которой одна дочерняя клетка идет по пути дифференциров-ки, а другая сохраняет свойства материнской стволовой клетки. В работах [4, 10] показано, что супрессор роста опухоли протеин Brat выполняет функцию, которая определяет судьбу клетки, позволяя ей в определенный момент при делении идти либо по пути дифференци-ровки, либо снова делиться для поддержания популяции.
Целью настоящего исследования было изучить появление аберраций в опухолевых клонах при различных гематологических заболеваниях.
Материалы и методы. Была исследована периферическая кровь больных до начала лечения с различными формами гемобластозов, которую подвергли в культуре ФГА-стимуляции в полной питательной среде (ППС), содержащей среду RPMI-1640 с добавлением 20% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота. За два часа до фиксации добавляли колхицин 0,04 мкг/мл. Через 72 часа от начала культивирования клетки помещали в гипотонический раствор и затем фиксировали в смеси метанол-уксусной кислоты (3:1). Готовили препараты по методу, принятому в лаборатории [11]. В нескольких случаях был проведен анализ клеток лимфатического узла. Для этого часть лимфатического узла помещали в полную питательную среду, измельчали и переносили в ППС с добавлением митогена интерлейкин-2. Культивирование осуществляли в течение 6 суток. Получение препаратов производили по той же методике, что и клетки периферической крови. Повреждения в хромосомах анализировали с учетом номенклатуры ISCN [12]. У каждого больного анализировали от 100 до 300 клеток, в зависимости от количества выявленных клональных клеток, число которых должно быть не менее 2.
Результаты и обсуждение. В таблице 1 представлены больные с различными формами гемобластозов, (в основном лимфопролиферативные заболевания), у которых выявлены в периферической крови 2 клона с различными цитогенетическими повреждениями. Количество клональных клеток составляет от 2 до 4%, и у одного больного (ХЛЛ) достигает 10. Не во всех случаях можно установить, какой клон является первичным, так как цитогенетический анализ проводился один раз до начала лечения. Однако очевидно, что появление этих двух клонов происходило, скорее всего, независимо один от другого. У больного № 3 кроме периферической крови анализировали клетки лимфатического узла, при этом выявлены идентичные повреждения в обоих случаях. Это свидетельствует о том, что диссеминация опухоли из лимфатического узла в периферическую кровь происходит без появления дополнительных или других каких-либо независимых повреждений, по крайней мере, у этого больного. В какой момент происходит выход опухолевых клеток из первичного
очага, сказать трудно. Имеются работы, в которых диссеминация опухолевых клеток при лимфомах происходит уже на первых стадиях заболевания [13]. Возможно, начало диссеми-нации зависит от типа опухоли, что связано с особенностями ее тканевого происхождения и степени злокачественности. Однако совершенно очевидно, что при гемобластозах происходит это по-другому, чем при метастазировании солидных опухолей, так как способность гематологических клеток циркулировать в организме является физиологической особенностью этих клеток. Именно поэтому для образования солидных опухолей необходима инъекция не менее 50 предполагаемых раковых клеток [1]. Что касается образования гемобластозов, то в литературе приводятся данные о большей полипо-тентности опухолеобразующих клеток. Так, при исследовании лейкозов было показано, что для развития этого заболевания у грызунов достаточно одной опухолевой клетки [8], т.е. при лейкозах, в отличие от солидных опухолей, любая клетка может рассматриваться как стволовая.
Таблица 1
Лимфопролиферативные заболевания, при которых сформировались два независимых клона
N п/п Диагноз Возраст Кариотип атипичных клеток Количество клональных клеток, %
1 Лимфома кожи* 23 del (1) (p32-33) 3
46 XY, del (20) (q12) 2
2 ХЛЛ 48 46XY,del (6)q(25) 4
46,XY, del (7)(q31) 3
3 Диффузная В-клеточная 68 46,Xy,t(3;5) (q24;q14) 2
крупноклеточная лимфома , IV В ст.* 47,XY,+ mar (9) (p) 2
4 Множественная миелома 62 46,XX, del(6)(q25) 4
46,XX, del(1)(q43) 2
5 Хронический лимфоцитарный лейкоз, 46,XY, t(14;15) 10
IV В ст. (q32;q15) 2
46,XY,fra(3)(q13.2)
6 Лимфома Ходжкина 65 47,XX, +X 2
47,XX, +18 2
7 Хронический лимфоцитарный лейкоз 48 46,del(6)(q25) 4
46,XY,del(7)(q31) 3
Примечание: * - был проведен анализ клеток лимфотического узла.
В таблице 2 представлены больные с гемо-бластозами, у которых в периферической крови выявлено несколько клонов, эволюция которых происходила в результате постепенного добавления или потери хромосомного материала. По номенклатуре 1БСМ (2005) [12] такие клоны называются субклонами. Так, у больного № 4 клон с дополнительной хромосомой Х встречается еще в двух вариантах, один из которых только в сочетании с трисомией хромосомы 12 и один с трисомией хромосомы 4. Так как хорошо известно, что основным цитогенетическим нарушением при ХЛЛ является трисомия хромосомы 12, то, вероятнее всего, появление дополнительной хромосомы Х произошло позднее. В то же время самостоятельный клон с дополнительной хромосомой Х может свидетельствовать о параллельной эволюции этих клонов. У больного № 2 изменение повреждений в клонах идет параллельно и, возможно, независимо друг от друга. У больного № 3 эволюция клонов идет в двух направлениях. Каждый из вариантов содержит трисомию хромосомы 7 и делецию (6) (ц23). По всей вероятности, это первичные хромосомные
нарушения, на основе которых формируются новые три субклона, в двух из которых прибавляется трисомия хромосомы 8 и маркерная хромосома, а в одном из них трисомия хромосомы 21 и делеция хромосомы 3.
У больного № 4, скорее всего, происходит постепенное нарастание повреждений: сначала появляется клон с дополнительной хромосомой Х и затем добавляется трисомия хромосомы 12 , а затем хромосомы 4.
В таблице 3 представлены примеры клональных и неклональных цитогенетических повреждений, выявленных в периферической крови у больных с гематологическими заболеваниями.
У больного (№ 1, табл. 3) с ХЛЛ выявлен клон с ^8;11) и клон с делецией (1) (ц32), кроме того, в этом же локусе выявлен клональный разрыв.
У больного № 2 с тем же заболеванием выявлены клональные ломкие сайты в хромосомах
4, 5 и 11. Больной № 3 содержит наиболее часто встречающуюся трисомию по хромосоме 12, де-лецию ц-плеча хромосомы 7, а также разрывы в хромосомах Х и 1.
Таблица 2
Лимфопролиферативные заболевания, при которых выявлен основной клон и субклоны, которые образовались в процессе эволюции основного
N п/п Диагноз Возраст Кариотип атипичных клеток Количество клональных клеток, %
1 Множественная миелома 71 48,XX, +X,+ mar 2
48, XX, +X,+X 2
47,XX,+ X 3
2 Хронический 25 47, XX, +20 2
лимфоцитарный лейкоз 48,XX,+9,+20 2
47, XX,+X 2
49,XX,+X,+X,+X 2
3 Т-клеточная лимфома 46 48,XY,-+8,-10,+7,+20,+ mar 2
46,XY, del(6)(q23) 2
48,XY,+7,+21, del(3)(q23), del(6)(q23) 2
50,XY, +7,+8,+21,+mar, del(6)(q23) 2
4 Хронический 55 47,XX,+X 2
лимфоцитарный лейкоз 48,XX,+X,+12 1
49,XX,+X,+4,+12 1
5 Острый лимфобластный 20 92,XXYY,del(7)(q32), del(6)(q23) 2
лейкоз 92,XXYY,del(7)(q32) 2
46,XY, del(6)(q23) 2
Клональные и неклональные хромосомные повреждения, выявленные у с различными гематологическими заболеваниями
Таблица 3
больных
N п/п Диагноз Возраст Кариотип атипичных клеток Количество клональных клеток, %
1 Хронический 38 46,ХХ, t(8;11)(p12;q12),del(5)(p12) 2
лимфоцитарный лейкоз 46,XX,del (1)(q32) 2
46,XX, fra (1)(q32) 2
2 Хронический 53 46,XY,fra(4)(q24) 2
лимфоцитарный лейкоз 46,XY,fra(5)(q23) 2
46,XY,fra(11)(q32] 3
3 Хронический 61 47,XY,+12 4
лимфоцитарный лейкоз 46,XY,del (7)(q31) 2
46,XY,fra(1)(p32) 1
46,XY,fra(X)(q11.1) 1
4 Неходжкинская лимфома 63 46,XY,t(7;14)(q32;q13) 2
46,XY, del(1)(42) 1
46,XY, fra(1)(42) 1
46,XY,fra(1)(32) 2
5 Сублейкемический миелоз 82 46,XY,t(9;15)(p13;q11.2) 2
46,XY, del6(q23) 2
46,XY,fra (4)(p12] 2
46,XY,fra(11)(p13) 1
6 Эритроцитоз неясного 37 46,XY,del(4)(q34) 1
генеза 46,XY,fra (4)(q34) 1
46,XY,del(6)(q23) 1
46,XY,fra(6)(q23) 1
Больной № 4 с НЛ имеет клональную транслокацию между 7 и 14 хромосомами. Кроме того, в локусе 1ц42 выявлена делеция выявлена деле-ция и разрыв в этом же локусе. Возможно, что эти два повреждения связаны между собой и появление одного (делеции) обусловлено наличием другого (ломкого сайта). Подобный вариант цитогенетических повреждений наблюдается и у больного № 6. Делеции 4 и 6 хромосом сопровождаются фрагильными сайтами в тех же хромосомах.
Анализируя повреждения, представленные в таблице 3, можно предположить, что появившиеся клональные повреждения постоянно пополняются новыми, часть из которых возникает из предшествующих или вновь сформированных ломких сайтов.
Заключение. Таким образом, эволюция клонов при гематологических злокачественных заболеваниях может идти в двух основных направлениях. Первое - это независимое развитие
клонов, заключающееся в накоплении повреждений, которые не повторяются в других клонах. И второе, в котором появившийся первичный клон постепенно усложняется добавлением новых повреждений. Возможное объяснение заключается в высокой генетической нестабильности клеток, которая реализуется появлением множественных аберраций. Иерархически гематологическая опухоль может происходить как из стволовых нормальных клеток, так и из нормальных клеток-предшественников, как это уже показано для некоторых форм лейкозов [8].
Литература
1. Kakarala, M. Cancer stem cells: Implications for cancer treatment and prevention. / M. Kakarala, M.S. Wicha // Cancer J. - 2007. - Vol. 13, N 5. -P. 271-274.
2. Holden, C. Stem cells. Reprogramming, take two / C. Holden // Sience. - 2007. N 316. -P. 1404.
3. Dontu, G. Stem cells in mammary development and carcinogenesis. Implications for prevention and treatment / G. Dontu, S. Liu, M.S. Wicha // Stem Cell Rev. - 2005. - Vol. 1. - P. 207-214.
4. Wodarz, A. Connecting cancer to asymmetryc division of stem cells / A. Wodarz, C. Gonsales // Cell. - 2006. - Vol. 124, N 24. - P. 1121-1123.
5. Ting, X. Stem cells and their niche: an inseparable relationship / X. Ting, L. Li // Development. - 2007. -N 134. -P. 2001-2006.
6. Li, L. Stem cells niche: structure and function. / L . Li, T. Xie // Ann. Rev. Cell. Dev. Biol. - 2005. N 21. - P. 605-621.
7. Burkert, J. Stem cells and cancer: an intimate relationship / J. Burkert, N. Wright, M. Alison // J. Pathol. - 2006. - N 209. - P. 287-297.
8. Wang, J.C., Cancer stem cells: lessons from leukemia./ J.C. Wang, J.E. Dick // Trends Cell Biol. - 2005. - N 15. - P. 494-501.
9. Delerba, P. Cancer stem cells: models and concepts. / P. Delerba, R.W. Cho, M.F. Clarke // Ann. Rev. Med. - 2007. - N 58. - P. 267-284.
10. Polyak, R. Roots and stems: Stem cells in cancer / R. Polyak, W.C. Hahn// Nat. Med. -2006. - N 12. - P. 296-300.
11. Богданов, А.Н., Саржевский В.О., Колю-баева С.Н., Малахова С.Н., Никитин В.Ю., Викторова Н.А., Краснова О.Р, Титова А.А. Случай острого лимфобластного лейкоза с транслокацией t(9;22) и несколькими дополнительным и перестройками / А.Н. Богданов, В.О. Саржевский, С.Н. Колюбаева и [др.] // Гематол. и трансфузиол. - 2008. - Т. 53, № 3. - С. 35-38.
12. An International System for Human Cytogenetic Nomenclature (2005) // Recommendations of International Standing Commitee on Human Cytogenetic Nomenclature / Eds. L. Shaffer, N. Tommerup. - Basel: S. Karger, 2005.
13. Lambrechts, A.C. Translocation (14; 18)-positive cells are present in the circulation of the majority of patients with localized (stage I and II) follicular non-Hodgkin’s lymphoma / A.C. Lambrechts, P.E. Hupkes, L.C. Dorssers, M.B. van’t Veer // Blood. - 1993. - Vol. 82, N 8. - P. 2510-2516.
Контактная информация в редакции
