Особенности клинической картины, состояния врожденного иммунитета на примере экспрессии толл-рецепторов на клетках периферической крови у пациентов с увеитами различного генеза

Гаврилова Наталья Александровна; Гаджиева Нурия Саниевна; Сапожников Александр Михайлович; Карамышева Елена Игоревна

УДК 617.7

DOI: 10.20310/1810-0198-2016-21-4-1482-1487

ОСОБЕННОСТИ КЛИНИЧЕСКОЙ КАРТИНЫ, СОСТОЯНИЯ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА НА ПРИМЕРЕ ЭКСПРЕССИИ ТОЛЛ-РЕЦЕПТОРОВ НА КЛЕТКАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У ПАЦИЕНТОВ С УВЕИТАМИ РАЗЛИЧНОГО ГЕНЕЗА

1) Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова Минздрава России

127473, Российская Федерация, ул. Делегатская, 20 E-mail: msmsu@msmsu.ru 2) Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН 117997, Российская Федерация, г. Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 E-mail: office@ibch.ru

Реализация специфичности врожденной иммунной системы ложится на семейство эволюционно консервативных рецепторов, известных как толл-подобные рецепторы (TLR), которые играют решающую роль в ранней защите организма от патогенных агентов.

Цель: изучить и провести сравнительную характеристику экспрессии различных видов толл-рецепторов на клетках периферической крови при увеитах различной этиологии.

Материал и методы: в исследовании участвовали 15 пациентов (7 мужчин и 8 женщин) в возрасте 25-54 лет, с диагнозом острого или обострения хронического увеита различной этиологии. Контрольную группу составили здоровые лица в возрасте 23-27 лет - 12 человек. Уровень экспрессии толл-подобных рецепторов оценивали с помощью проточно-цитометрического анализа лейкоцитов, окрашенных по стандартным протоколам флуорес-центномеченными антителами (HyCult Biotech, The Netherlands) к поверхностным (TLR2, TLR4, TLR6) или внутриклеточным (TLR3, TLR9) рецепторам.

Результаты: получены статистически достоверные результаты по снижению экспрессии TLR2 на В-лимфоцитах и моноцитах (р = 0,02 и 0,014 соответственно) более чем в 2 раза; TLR4 и TLR6 - на моноцитах (р = 0,01 и 0,047 соответственно) у пациентов с инфекционно-токсическим увеитом. У пациентов c прогреди-ентно протекающими увеитами с выраженным аутоиммунным компонентом экспрессия TLR отличалась полиморфизмом и имела тенденцию к повышению по сравнению с контролем.

Заключение: при инфекционно-токсическом увеите наибольшее патогенетическое значение имеет достоверное угнетение экспрессии TLR2, TLR4 и TLR6 на моноцитах периферической крови, что, возможно, связано с чрезмерной стимуляцией толл-рецепторов экзогенными лигандами до начала или в дебюте заболевания и развитием состояния гипочувствительности толл-рецепторов как защитной реакции сосудистой оболочки глаза от гипе-рэргического воспаления. Требуются дальнейшие исследования характера экспрессии толл-рецепторов в стадию ремиссии увеита с целью оценки влияния активности воспалительного процесса и медикаментозной терапии на характер экспрессии.

Ключевые слова: толл-рецепторы; увеит; клетки периферической крови; проточная цитометрия

В патогенезе увеитов играет роль иммунная реактивность организма, которая включает звенья врожденного и приобретенного иммунитета. Врожденная иммунная система образует первую линию защиты на пути патогенных агентов, проникающих в организм человека [1-6].

Врожденный иммунитет реализуется через клеточные и гуморальные факторы. К факторам неспецифической иммунной защиты относятся гуморальные -интерфероны, интерлейкины, хемокины, система комплемента, естественные антитела ^М и IgG и клеточные - толл-рецепторы (TLR), рецепторы цитокинов, естественные киллеры - Ж^-клетки, моноциты и макрофаги, дендритные клетки [1-3].

TLR являются сигнальными патоген-распознаю-щими рецепторами и рассматриваются исследователями как ключевые рецепторы врожденного иммунитета [2-10]. TLR участвуют в распознавании микробных

компонентов и активации внутриклеточных сигнальных путей, в результате чего происходит экспрессия генов цитокинов (ФНОа, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12, ИФНа/р), костимуляторных молекул и некоторых других генов (рис. 1).

Исследования структуры, сигнальных путей, экспрессии и распределения толл-рецепторов направлены не только на понимание молекулярных и иммунологических основ инфекционных и аутоиммунных процессов, но и на разработку альтернативных терапевтических методов, модулирующих аллергические и иммунные реакции при этих процессах [1; 8].

Для создания быстрой и неспецифической защиты против патогенов возможно использование набора бактериальных антигенов, несущих панель патоген-ассоциированных молекулярных структур, которые являются лигандами для достаточно хорошо охарактеризованных девяти толл-подобных рецепторов: TLR1 -

Рис. 1. Толл-рецепторы, схема распределения в клетке, сигнальные пути и индукция синтеза провоспалительных факторов (Thte authors: Pamela A. Carpentier, D'Anne S. Duncan, Stephen D. Miller)

Таблица 1

Примеры развития неспецифической защиты при введении синтетических лиганд для TLR s мышам, зараженным бактериями, вирусами или простейшими

Лиганды Рецептор Патоген Эффект

Полиинозин цитозин* TLR3 Вирус гриппа Уменьшение титра вируса в легких

ЛипидА TLR4 Листерии Вирус гриппа Защита

CpG** TLR9 Листерии Францисселы Лейшмании Малярийные плазмодии M.tuberculosis Уменьшение тяжести и продолжительности инфекции Увеличение СПЖ***

Примечание: * - синтетический аналог ss РНК; ** - cytosine phosphate guanosine; *** - СПЖ - средняя продолжительность жизни.

TLR9. Весьма вероятно, что такая комбинация антигенов будет создавать быструю защиту не только против бактерий, но и против вирусов, поскольку некоторые бактериальные лиганды (ЛПС, CpG мотив бактериальной ДНК) распознаются 1ЪК2, TLR4 и TLR9, которые взаимодействуют с гликопротеинами вирусных оболочек и CpG молекулами [1; 8].

Ряд авторов опубликовал результаты экспериментов, в которых исследовали резистентность к патогенам после введения синтетических лиганд для кон-

кретных TLR [6]. В обобщенном виде эти результаты представлены в табл. 1.

Цель исследования: изучить уровень экспрессии различных видов толл-рецепторов на клетках периферической крови в контроле и при увеитах различной этиологии.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследовании участвовали 15 пациентов (7 мужчин и 8 женщин) в возрасте 25-54 лет, которые лечи-

лись по поводу острого или обострения хронического увеита различной этиологии в Межотраслевом научно-техническом комплексе «Микрохирургия глаза». Тщательно изучалась история заболевания, начало болезни, периоды обострения, результаты лечения. Пациентам проводили ИФА крови с целью оценки характера возбудителя, активности процесса и иммунологического статуса; офтальмологический статус оценивали стандартными (биомикроскопия, офтальмоскопия в прямом и обратном виде) и дополнительными методами исследования (В-сканирование глаза, оптическая когерентная томография сетчатки и зрительного нерва). Контрольную группу составили здоровые лица в возрасте 23-27 лет - 12 человек.

Уровень экспрессии толл-подобных рецепторов оценивали с помощью проточно-цитометрического анализа лейкоцитов, окрашенных по стандартным протоколам флуоресцентномеченными антителами (HyCult Biotech, The Netherlands) к поверхностным (TLR2, TLR4, TLR6) или внутриклеточным (TLR3, TLR9) рецепторам. Для идентификации популяций моноцитов и В-лимфоцитов в этих экспериментах использовали метод двойного иммунофлуоресцентного окрашивания с применением антител к CD14 и CD19 (Сорбент, Москва), соответственно. Измерения проводили на проточном цитофлуориметре FACScan (Becton Dickinson, США), анализировали не менее 10000 событий в образце.

РЕЗУЛЬТАТЫ

По локализации воспалительного процесса в сосудистой оболочке глаза пациенты распределились следующим образом: в 10 случаях (11 глазах) наблюдали передний увеит или иридоциклит; в 5 случаях (10 глаз) имел место панувеит, на трех глазах осложнившийся тракционной отслойкой сетчатки, 3 глазах - нейроре-тинитом, на одном глазу - перипапиллярной экссуда-тивной отслойкой сетчатки. На 2 глазах двух пациентов увеит завершился субатрофией глаза. В 5 случаях воспалительный процесс наблюдали на обоих глазах.

Результаты исследования показали, что при увеитах различной локализации имела место тенденция к значительному снижению экспрессии всех типов TLR [24; 7; 10] на лимфоцитах, моноцитах и нейтрофилах по сравнению с контролем. Статистически достоверные результаты получены по снижению экспрессии TLR2 на В-лимфоцитах и моноцитах (р = 0,02 и 0,014 соответственно) более чем в 2 раза; TLR4 и TLR6 - на моноцитах (р = 0,01 и 0,047 соответственно). Выявлена тенденция к большему снижению экспрессии TLR 2, 4, 6, более чем в 2 раза, и менее выраженное снижение TLR 3 и 9 (менее чем в 2 раза) на клетках периферической крови (табл. 2-6).

Учитывая полиморфизм клинических проявлений, этиологических факторов и результатов проточной цитометрии, результаты исследования образцов крови 6 пациентов были представлены отдельно.

Таблица 2

Сравнительная характеристика экспрессии TLR2 на клетках периферической крови в контроле и при увеите

Параметры Контроль (N = 13) (M ± ф (m)) Увеит (N = 9) (M ± ф (m)) Критерий Манна-Уитни, Р

Лимфоциты (CD19) 0,72 ± 0,57 (0,16) 0,3 ± 0,3 (0,09) 0,02*

Моноциты (CD14) 137,2 ± 58,2 (16,1) 71,62 ± 35,15 (11,72) 0,014*

Нейтрофилы 20,93 ± 31,7 (8,8) 8,2 ± 6,8 (2,3) 0,9

Таблица 3

Сравнительная характеристика экспрессии ТLR4 на клетках периферической крови в контроле и при увеите

Параметры Контроль (N= 13) Увеит (N = 9) Критерий Манна-Уитни, Р

Лимфоциты (CD19) 1,33 ± 1,19 (0,33) 0,74 ± 0,73 (0,24) 0,39

Моноциты (CD14) 165,5 ± 158,3 (43,9) 54,12 ± 27,54 (9,18) 0,01*

Нейтрофилы 18,75 ± 21,49 (5,96) 10,84 ± 6,7 (2,23) 0,56

Таблица 4

Сравнительная характеристика экспрессии ТLR6 на клетках периферической крови в контроле и при увеите

Параметры Контроль (N= 13) Увеит (N = 9) Критерий Манна-Уитни, Р

Лимфоциты (CD19) 0,57 ± 0,61 (0,17) 0,21 ± 0,17 (0,06) 0,09

Моноциты (CD14) 21,2 ± 16,96 (4,7) 9,37 ± 9 (3) 0,047*

Нейтрофилы 5,9 ± 10,2 (2,8) 1,84 ± 1,38 (0,46) 0,32

Таблица 5

Сравнительная характеристика экспрессии ТLR3 на клетках периферической крови в контроле и при увеите

Параметры Контроль (N= 13) Увеит (N = 9) Критерий Манна-Уитни, р

Лимфоциты (CD19) 14,1 ± 10,26 (2,8) 9,4 ± 6,36 (2,12) 0,5

Моноциты (CD14) 43,33 ± 26,3 (7,3) 39,77 ± 24,46 (8,15) 0,97

Нейтрофилы 346,6 ± 186 (51,6) 279,2 ± 143 (47,68) 0,69

Таблица 6

Сравнительная характеристика экспрессии ТLR9 на клетках периферической крови в контроле и при увеите

Параметры Контроль (N= 13) Увеит (N = 9) Критерий Манна-Уитни, р

Лимфоциты (CD19) 5,9 ± 4,5 (1,25) 3,39 ± 2,39 (0,8) 0,37

Моноциты (CD14) 28,9 ± 12,9 (3,6) 23,66 ± 17,26 (5,75) 0,33

Нейтрофилы 211,1 ± 135,7 (37,6) 206,1 ± 206,7 (68,9) 0,64

Примечание: * -p < 0,05.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обобщая представленные данные, можно заключить, что из всех изученных толл-рецепторов наибольшее патогенетическое значение при увеитах имеет достоверное угнетение экспрессии TLR2, TLR4 и TLR6 -на моноцитах периферической крови. В основной группе, где имело место угнетение экспрессии TLR2, TLR4 и TLR6, наблюдали увеит инфекционно-токсического рецидивирующего характера (в 8 случаях из 9). Кроме того, пациенты получали активную стероидную противовоспалительную терапию. Угнетение экспрессии TLR2, TLR4 и TLR6, возможно, связано с чрезмерной стимуляцией толл-рецепторов экзогенными лигандами до начала или в дебюте заболевания и развитием состояния рефрактерности или гипочувстви-тельности толл-рецепторов в дальнейшем развитии заболевания на фоне проводимой терапии стероидными противовоспалительными препаратами.

В случаях прогредиентного или гиперактивного течения панувеита (у 2 пациентов) мы наблюдали рост экспрессии TLR2, 6 на лимфоцитах, моноцитах и ней-трофилах, TLR3 - на лимфоцитах, TLR4 - на лимфоцитах и нейтрофилах, что, возможно, свидетельствует о гиперэргической воспалительной реакции с вовлечением в процесс всего сосудистого тракта. При аутоиммунном иридоциклите на фоне сахарного диабета также имело место активное прогредиентное воспаление с повышением экспрессии на В-лимфоцитах всех типов TLR (2, 4, 3, 6, 9); увеличение экспрессии TLR (6, 3, 9) на моноцитах и нейтрофилах. Экспрессия TLR2 и 4 была снижена на моноцитах и нейтрофилах. По нашему мнению, угнетение экспрессии TLR2 и 4 связано в данном клиническом случае с состоянием рефрактер-ности, как защитной реакции переднего отрезка сосудистой оболочки глаза от гиперэргического воспаления. А рост экспрессии всех толл-рецепторов на лимфоцитах свидетельствует об активности самого аутоиммунного процесса.

ВЫВОДЫ

1. При инфекционно-токсическом увеите выявлено достоверное угнетение экспрессии TLR2, TLR4 и TLR6 - на моноцитах и TLR2 на В-лимфоцитах периферической крови. Наибольшее патогенетическое значение в развитии инфекционно-токсического увеита имеет динамическое изменение экспрессии TLR2, TLR4, TLR6 на моноцитах периферической крови.

2. При аутоиммунном увеите, характеризующимся прогредиентным течением, выявлена тенденция к повышению экспрессии TLR2, TLR4, TLR6, TLR3 на В-лимфоцитах.

3. Требуются дальнейшие исследования экспрессии различных видов толл-рецепторов в активной и неактивной стадии увеита с целью оценки влияния активности воспалительного процесса и медикаментозной терапии на характер экспрессии.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Титов Л.П. Иммунология. Терминологический словарь. Минск: Беларуская навука, 2004. 352 с.

2. Титов Л.П., Карпов И.А. Противовирусный иммунитет: молеку-лярно-клеточные механизмы, закономерности развития и иммунопатология // БМЖ. 2007. Т. 1 (19). С. 1-19.

3. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. М.: Медицина, 2002. 536 с.

4. Kenneth L.R., Hearn R.A., Chen C.-J. et al. Natural endogenousadju-vants // Springer Semin. Immunol. 2005. V. 26. P. 231-246.

5. Medzhitov R., Janeway C. Jr. Innate immune recognition: mechanisms and pathways // Immunol. Rev. 2000. V. 173. P. 89-97.

6. Micera A., Stampachiacchiere B., Aronni S., dos Santos M.S., Lambiase A. Toll-like receptors and the eye // Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 2005. V. 5. P. 451-458.

7. Хаитов Р.М., Пащенков М.В., Пинегин Б.В. Биология рецепторов врожденной иммунной системы // Физиология и патология иммунной системы. 2008. Т. 12. № 6. С. 3-28.

8. Hackett C.J. Innate immune activation as a broad - spectrum biode-fence strategy: prospects and research challenges // J. Allerrgy Clin. Immunol. 2003. V. 112. P. 686-694.

9. Chang J.H., McCluskey P.J., Wakenfield D. Toll-like receptors in ocular and immunopathogenesis of inflammatory eye disease // Br. Jour. Of Ophthalmology. 2006. V. 90 (1). P. 103-108.

10. Kelly Mai, Chui Jeanie J.Y., Girolamo N.D., McCluskey P.J., Wakefield Denis. Role of toll-like receptors in human iris pigment epithelial cells and their response to pathogen-associated molecular patterns // J.

Inflamm 2014. v. 11. Поступила в редакцию 28 апреля 2016 г.

UDC 617.7

DOI: 10.20310/1810-0198-2016-21-4-1482-1487

PECULIARITIES OF CLINICAL PICTURE, OF INNATE IMMUNITY STATUS ON THE EXAMPLE OF TOLL RECEPTOR EXPRESSION ON PERIPHERAL BLOOD CELLS IN PATIENTS WITH UVEITIS OF DIFFERENT GENESIS

^ Moscow State University of Medicine and Dentistry named after A.I. Evdokimov of Ministry of Health of Russia 20 Delegatskaya St., Moscow, Russian Federation, 127473 E-mail: msmsu@msmsu.ru 2) Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the RAS 16/10 Miklukho-Maklay St., Moscow, Russian Federation, 117997 E-mail: office@ibch.ru

Implementation specificity innate immune system falls into a family of evolutionarily conserved receptors, known as Toll-like receptors (TLR), which play a crucial role in the early protection of the organism against pathogens.

Purpose: to study and carry out comparative characteristics of different types of expression of Toll receptors on peripheral blood cells in the control and uveitis of various etiologies.

Material and Methods: the study involved 15 patients (7 men and 8 women) aged 25-54 years, with a diagnosis of acute or exacerbation of chronic uveitis of various etiologies. The control group consisted of healthy persons aged 23-27 years - 12 people. The level of expression of Toll-like receptor was evaluated by flow-cytometric analysis of leukocytes stained according to standard protocols fluorescently-labeled antibody (HyCult Biotech, The Netherlands) to the surface (TLR2, TLR4, TLR6) or intracellular (TLR3, TLR9) receptors.

Results: the results obtained were statistically significant reduction TLR2 expression on B lymphocytes and monocytes (p = 0.02 and 0.014, respectively) than two-times; TLR4 and TLR6 - on monocytes (p = 0.01 and 0.047, respectively) in patients with infectious-toxic uveitis. Patients with severe autoimmune uveitis (6 persons) was there polymorphisms of expression different TLR and tended to increase compared to the control. Conclusion: in infectious uveitis most toxic pathogenetic importance is significant inhibition of the expression of TLR2, TLR4 and TLR6 on peripheral blood monocytes, which is possible due to the excessive stimulation of Toll receptors by exogenous ligands prior to or at the onset of the disease, and the development of state hyposensitivities Toll receptors, as a defensive reaction the uvea from hyperinflammation. Further studies of character expression Toll-receptors in uveitis remission is necessary in order to assess the influence of inflammatory activity and drug therapy on the expression TLR. Key words: Toll-like receptors; uveitis; peripheral blood cells; flow-cytometry

REFERENCES

1. Titov L.P. Immunologiya. Terminologicheskiy slovar'. Minsk: Belaruskaya navuka Publ., 2004. 352 p.

2. Titov L.P., Karpov I.A. Protivovirusnyy immunitet: molekulyarno-kletochnye mekhanizmy, zakonomernosti razvitiya i immunopa-tologiya. Belorusskiy meditsinskiy zhurnal — Belarusian Medical Journal, 2007, vol. 1 (19), pp. 1-19.

3. Khaitov P.M., Ignat'eva G.A., Sidorovich I.G. Immunologiya. Moscow, Meditsina Publ., 2002. 536 p.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

4. Kenneth L.R., Hearn R.A., Chen C.-J. et al. Natural endogenousadjuvants. SpringerSemin. Immunol., 2005, vol. 26, pp. 231-246.

5. Medzhitov R., Janeway C. Jr. Innate immune recognition: mechanisms and pathways. Immunol. Rev., 2000, vol. 173, pp. 89-97.

6. Micera A., Stampachiacchiere B., Aronni S., dos Santos M.S., Lambiase A. Toll-like receptors and the eye. Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol., 2005, vol. 5, pp. 451-458.

7. Khaitov R.M., Pashchenkov M.V., Pinegin B.V. Biologiya retseptorov vrozhdennoy immunnoy sistemy. Fiziologiya i patologiya im-munnoy sistemy — Physiology and Pathology of Immune System, 2008, vol. 12, no. 6, pp. 3-28.

8. Hackett C.J. Innate immune activation as a broad - spectrum biodefence strategy: prospects and research challenges. J. Allerrgy Clin. Immunol., 2003, vol. 112, pp. 686-694.

9. Chang J.H., McCluskey P.J., Wakenfield D. Toll-like receptors in ocular and immunopathogenesis of inflammatory eye disease. Br. J. Ophthalmology, 2006, vol. 90 (1), pp. 103-108.

10. Kelly Mai, Chui Jeanie J.Y., Girolamo N.D., McCluskey P.J., Wakefield D. Role of toll-like receptors in human iris pigment epithelial cells and their response to pathogen-associated molecular patterns. J. Inflamm., 2014, vol. 11.

Received 28 April 2016

Гаврилова Наталья Александровна, Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова, г. Москва, Российская Федерация, доктор медицинских наук, профессор, зав. кафедрой глазных болезней, e-mail: n.gavrilova@mail.ru

Gavrilova Natalya Aleksandrovna, Моscow State University of Medicine and Dentistry named after A.I. Evdokimov, Moscow, Russian Federation, Doctor of Medicine, Professor, Head of Eye Diseases Department, e-mail: n.gavrilova@mail.ru

Гаджиева Нурия Саниевна, Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова, г. Москва, Российская Федерация, кандидат медицинских наук, доцент кафедры глазных болезней, e-mail: gazel65@mail.ru

Gadzhieva Nuriya Sanievna, Моscow State University of Medicine and Dentistry named after A.I. Evdokimov, Moscow, Russian Federation, Candidate of Medicine, Associate Professor of Eye Diseases Department, e-mail: gazel65@mail.ru

Сапожников Александр Михайлович, Институт биоорганической химии им. Академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, г. Москва, Российская Федерация, доктор биологических наук, профессор, зав. лабораторией клеточных взаимодействий, e-mail: gazel65@mail.ru

Sapozhnikov Aleksander Mikhaylovich, Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the RAS, Moscow, Russian Federation, Doctor of Biology, Professor, Head of Cell Interactions Laboratory, e-mail: gazel65@mail.ru

Карамышева Елена Игоревна, Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова, г. Москва, Российская Федерация, доктор медицинских наук, профессор кафедры фармакологии, e-mail: gazel65@mail.ru

Karamysheva Elena Igorevna, Моscow State University of Medicine and Dentistry named after A.I. Evdokimov, Moscow, Russian Federation, Doctor of Medicine, Professor of Pharmacology Department, e-mail: gazel65@mail.ru

Peculiarities of clinical picture, of innate immunity status on the example of toll receptor expression on peripheral blood cells in patients with uveitis of different genesis