CC BY
40
УДК 616.33-022-053.2+611.33: 611.018.73+575.116:577.112
Е. Г. ПОМОРГАЙЛО
Омская государственная медицинская академия
ОСОБЕННОСТИ КЛЕТОЧНОГО ОБНОВЛЕНИЯ ЭПИТЕЛИЯ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА У ПОДРОСТКОВ, ИНФИЦИРОВАННЫХ HELICOBACTER PYLORI, В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ_
Обследовано 106 подростков, инфицированных Helicobacter pylori. Пролиферацию и апоптоз изучали в биоптатах слизистой оболочки желудка с помощью стрептавидин-биотинового иммунопереоксидазного метода. Полиморфизм генов интерлейкин-^ (-511 C>T и +3953 C>T) и антагониста его рецептора (вариабельное число тандемных повторов во 2-м интроне) определяли с помощью полимеразной цепной реакции из периферической крови. Полученные данные указывают на отсутствие ассоциаций между параметрами клеточного обновления и полиморфизмом генов интерлейкин-^ и антагониста его рецептора у больных подростков, инфицированных Helicobacter pylori.
Ключевые слова: клеточное обновление, Helicobacter pylori, цитокины, генетический полиморфизм.
Согласно современным представлениям, инфицирование Helicobacter pylori (HP) приводит к нарушению процессов клеточного обновления в слизистой оболочке желудка. Доказано как in vitro, так и при изучении клинического материала, что НР стимулирует апоптоз клеток железистого эпителия желудка, что вызывает их ответную гиперпролиферацию [1 — 3].
Исследования разных авторов показали, что HP регулирует процессы клеточного обновления в эпите-лиоцитах как непосредственно за счет действия уре-азы и липополисахарида, так и опосредованно через индукцию секреции цитокинов клетками воспалительного инфильтрата [4 — 6]. Ряд исследований продемонстрировали положительную корреляционную связь между параметрами клеточного обновления и степенью воспаления в слизистой оболочке желудка [2, 5, 6], что косвенно подтверждает тот факт, что хроническое воспаление в слизистой оболочке желудка, вызванное HP, приводит к нарушению процессов клеточного обновления.
В популяции людей отмечается гетерогенность воспалительного ответа на НР инфекцию, которая согласно современным представлениям, обусловлена генетическими особенностями индивидуума, его аллельным полиморфизмом генов цитокинов, которые запускают и контролируют воспаление в слизистой оболочке желудка. Однако вопрос о влиянии полиморфизма генов цитокинов на клеточное обновление эпителия слизистой оболочки желудка при НР инфекции остается открытым.
Цель исследования — оценить уровень апоптоза и пролиферации в зависимости от полиморфизма
генов цитокинов у больных подростков, инфицированных НР.
Материал и методы исследования
Обследованы 106 русских детей, инфицированных НР, находившиеся на лечении в гастроэнтерологическом отделении ДКБ № 2 г. Омска, и контрольная группа — 44 неинфицированных НР ребенка, соответствующие по этнической принадлежности исследуемой группе. Средний возраст больных составил 14,3 года, средняя длительность заболевания 3,5 года, мальчиков — 45, девочек — 61. Средний возраст и соотношение мужчин и женщин в контрольной группе соответствовало основной. Исследование одобрено локальным комитетом по этике.
НР инфекция диагностирована на основании результатов гистобактериологического исследования (метод Гимзе), быстрого уреазного Не1рД-теста («Син-тана СМ», Россия) и метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) («Хеликопол» НПФ «Литех», Россия).
Всем подросткам проводилась фиброгастродуо-деноскопия с биопсией слизистой оболочки антраль-ного отдела желудка. Полученные фрагменты слизистой оболочки фиксировали в 10 %-ном растворе нейтрального формалина, заливали в парафин по общепринятой методике. Для морфологического исследования биоптатов использовали визуально-аналоговую шкалу на основе Сиднейской системы [7].
Для определения пролиферации (маркер Ю 67) и апоптоза (маркер СРР-32) проводили иммуногистохи-мическое исследование (сыворотки фирм DAKO,
Дания и Novocastra, Великобритания, соответственно) на парафиновых срезах с применением стреп-тавидин-биотинового метода (DAKO, Дания, LSAB2 Systems, HRP). В препаратах при 400-кратном увеличении микроскопа определяли индексы пролиферации и апоптоза как процент положительно окрашенных ядер эпителиоцитов слизистой оболочки желудка в пяти случайно выбранных полях зрения (>500 клеток).
Для генетического исследования проводился забор венозной крови. Изучали полиморфизм гена интер-лейкин-1 бета (ИЛ-1 ß) -511 C>T и +3953 C>T и гена антагониста его рецептора (HA-1RN) вариабельное число тандемных повторов (VNTR) во 2-м интроне. Исследование осуществляли с помощью метода ПЦР на амплификаторе «Терцик» («ДНК-Технология», Россия). Метод выделения ДНК, структура прай-меров, программы амплификации описаны в работе [8]. Анализ полученных результатов проводили с помощью электрофореза в 3 %-ном агарозном геле с бромистым этидием.
Статистическую обработку данных проводили при помощи углового преобразования Фишера и х2 и непараметрического критерия Манна-Уитни. Статистически достоверными считали различия при р < 0,05. Распределение частот встречаемости аллелей генов ИЛ-1в и ИЛ-1RN соответствовало закону Харди-Вайнберга.
Результаты исследования
При анализе показателей клеточного обновления в слизистой оболочке желудка у носителей НР инфекции по сравнению с неинфицированными подростками индекс пролиферации составил 28,6 и 20,3 % соответственно (р<0,05), а индекс апоптоза — 14,4 и 6,4 % соответственно (р<0,05).
У не инфицированных НР подростков метка Ki 67 определялась в зоне перешейка желез в подавляющем большинстве случаев, тогда как у детей, инфицированных НР, экспрессия Ki 67 обнаруживалась в клетках генеративной зоной желез и ямочного эпителия. В мононуклеарном воспалительном инфильтрате собственной пластинки слизистой оболочки желудка экспрессия Ki 67 отмечалась преимущественно в центре лимфоидных фолликулов при минимальном количестве в составе диффузного инфильтрата.
СРР-32 — позитивные клетки встречались у не-инфицированных НР подростков в зоне шеечных отделов желез, на верхушке валиков и единичные — в глубине желез. У больных подростков, инфицированных НР, СРР-32 отмечалась не только на верхушке валиков, но и в ямочном эпителии, а также занимала 1/4 часть клеток генеративной зоны желез. Метка СРР-32 определялась и в клетках диффузного воспалительного инфильтрата, а также в лимфоидных фолликулах.
Исследование полиморфного локуса С -511 Т гена ИЛ-1 ß выявило статистически достоверное увеличение частоты встречаемости генотипа Т/Т (х2 = 6,923; р = 0,009) и аллеля Т (х2 =14,006; р = 0,001) у больных с НР-инфекцией (21 и 46 % соответственно) по сравнению с контрольной группой (8 и 29 % соответственно).
Генетическое исследование полиморфизма генов ИЛ-ф (С +3953 Т) и HA.-1RN (VNTR в интроне 2) показало, что распределение генотипов и аллелей этих генов не отличалось в исследуемой и контрольной группах. В обеих группах значительно преобладал аллель С гена ИЛ-ф (С +3953 Т) (71 и 78 % соответственно). Среди генотипов чаще определялся С/С
(51 и 61 % соответственно) и С/Т (34 и 40 % соответственно). У большинства пациентов выявлялся аллель с 4 повторами гена ИЛ-Ш^ аллель с 2 повторами обнаруживался примерно у 25 % больных. Другие аллели с 3, 5, 6 повторами встречались менее чем у 5 % подростков. Наиболее частым был генотип 4Я/4Я, который наблюдался у почти половины пациентов. Генотип 2Я/4Я определялся у 35 — 40 % пациентов, а генотип 2Я/2Я — только у 5 — 7 % больных.
Ассоциаций между параметрами клеточного обновления и полиморфизмом генов цитокинов у больных подростков, инфицированных НР, не выявлено.
Обсуждение полученных данных
Хроническое воспаление в слизистой оболочке желудка, вызванное HP, приводит к нарушению процессов клеточного обновления [4 — 6]. Разнообразные факторы бактерии и хозяина повреждают слизистую оболочку желудка и приводят, в конечном счете, к нарушению клеточной дифференцировки.
Безусловно, пролиферативный статус пациентов с НР инфекцией привлекает пристальное внимание исследователей в связи с потенциальной возможностью реализации программы канцерогенеза в условиях гиперпролиферации. При ускоренной пролиферации возникает большая вероятность накопления клеток с поврежденной ДНК, что является ключевым моментом в процессе канцерогенеза [9].
Согласно данным нашего исследования, у больных, инфицированных НР, отмечается увеличение уровня пролиферации эпителиоцитов в слизистой оболочке желудка, что согласуется с данными других авторов [1, 2, 10]. Однако исследования, проведенные in vitro, продемонстрировали ингибирование клеточного роста бактерией [3]. Таким образом, в процесс нарушения пролиферации эпителиоцитов под действием НР кроме бактерии задействованы другие факторы. Дальнейшие исследования показали, что регуляция пролиферации осуществляется в слизистой оболочке желудка клетками воспалительного инфильтрата, о чем косвенно свидетельствует положительная корреляционная связь между этими параметрами [2]. Кроме того, в пользу этих данных говорят факты о том, что нормализация пролиферации после эрадикации НР в антральном отделе наступает быстрее, а в теле желудка затягивается на более длительный срок и сопровождается персистенцией воспалительного инфильтрата в этом отделе [10].
В нашем исследовании и другими авторами показано, что у инфицированных НР пациентов определяется также большее количество эпителиоцитов, подвергшихся апоптозу [1, 2]. Кроме того, НР вызывает апоптоз и в культуре клеток [3]. Установлены сроки стимуляции пролиферации и апоптоза в организме мышей и монгольских песчанок после их заражения инфектом. Оказалось, что первичным является индукция апоптоза в слизистой оболочке желудка, а увеличение пролиферации наступает позднее [3].
Однако значение индекса апоптоза сильно варьирует как у лиц с различными НР-ассоциированными заболеваниями, так и внутри популяции с одной и той же клинической формой. Вопрос о том являются ли различия индекса апоптоза результатом действия различных штаммов НР или особенностями иммунного ответа макроорганизма остается открытым до сих пор. При этом в нескольких работах при оценке роли воспаления как пускового фактора апоптоза эпителия слизистой оболочки желудка воспаление
рассматривалось как дополнительный путь реализации апоптоза [5, 6].
Известно, что воспалительная реакция в слизистой оболочке желудка регулируется различными цитокинами. Ключевую роль в таком цитокиновом каскаде играет ИЛ-1 в [11]. E. M. El-Omar и соавторы описали полиморфизмы гена ИЛ-1в -511 C>T и +3953 C>T, которые связаны с повышенной продукцией этого цитокина [12]. В регуляции воспалительного ответа немало важную роль играет и HA-1RN. Он конкурентно связывается с рецептором к ИЛ-1 в и тем самым регулирует действие цитокина. В его гене также обнаружен полиморфизм во 2-м интроне. Вероятно, различные уровни синтеза ИЛ-1 в и ИЛ-1RN в слизистой оболочке желудка могут по-разному влиять на клеточное обновление эпителиоцитов под действием HP. Однако в нашем исследовании мы не обнаружили ассоциаций между параметрами клеточного обновления в слизистой оболочке желудка и полиморфизмом этих генов у больных подростков, инфицированных НР.
Заключение
Таким образом, у больных подростков, инфицированных НР, отмечалось значительное увеличение темпов пролиферации и апоптоза в слизистой оболочке желудка по сравнению с не инфицированными НР детьми. При этом ассоциаций между параметрами клеточного обновления и полиморфизмом генов цитокинов у больных с НР-инфекцией не выявлено.
3. Regulation of gastric epithelial cell growth by Helicobacter pylori : Evidence for a major role of apoptosis / S. Wagner [et al.] // Gastroenterology. - 1997. - Vol. 113. - P. 1836- 1847.
4. Gastric mucosal cytokine and epithelial cell responses to Helicobacter pylori infection in Mongolian gerbils / J. E. Crabtree [et al.] // J. Pathol. - 2004. - Vol. 202 (2). - P. 197-207.
5. Histopathology and expression of Ki-67 and cyclooxygenase-2 in childhood Helicobacter pylori gastritis / K. M. Kim [et al.] // J. Gastroenterol. - 2004. - Vol. 39 (3). - P. 231-238.
6. Correlation between epithelial cell proliferation and histological grading in gastric mucosa / D. A. F. Lynch [et al.] // J. Clin. Pathol. - 1999. - Vol. 52. - P. 367-371.
7. Аруин, Л. И. Морфологическая диагностика болезней желудка и кишечника / Л. И. Аруин, Л. Л. Капуллер, В. А. Исаков. -М. : Триада-Х, 1998. - 490 с.
8. Полиморфизм генов il-1e, антагониста его рецепторов и фенотип воспалительной реакции слизистой оболочки желудка при хеликобактерной инфекции / А. В. Кононов [и др.] // Молекулярная медицина. - 2010. - №. 1 - С. 42-45.
9. Correa, P. The biological model of gastric carcinogenesis / P. Correa // IARC Sci. Publ. - 2004. - Vol. 157. - P. 301-311.
10. Helicobacter pylori infection accelerates human gastric muco-sal cell proliferation / K. Murakami [et al.] // J. Gastroenterol. -1997. - Vol. 32. - P. 184- 188.
11. Helicobacter pylori induces an array of pro-inflammatory cytokines in human gastric epithelial cells : quantification of mRNA for interleukins-8, -1 alpha/beta, granulocyte/macrophage colony-stimulating factor, monocyte chemoattractant protein-1 and tumour necrosis factor-alpha / H. C. Jung [et al.] // J. Gastroenterol. Hepatol. -1997. - Vol. 12. - P. 473-480.
12. Interleukin-1 polymorphisms associated with increased risk of cancer / E. M. El-Omar [et al.] // Nature. - 2000. - Vol. 404. -P. 398-402.
Библиографический список
1. Морфология поверхностного и атрофического гастрита В при эрадикации Helicobacter pylori / А. В. Кононов [и др.] // Архив патологии - 2005. - Вып. 3. - С. 17-21.
2. Потрохова, Е. А Клеточное обновление слизистой оболочки желудка у детей с Helicobacter pylori-ассоциированным гастритом / Е. А Потрохова // Вестник НГУ. - 2004. - Т. 2. - С. 50-55.
ПОМОРГАЙЛО Елена Геннадьевна, кандидат биологических наук, доцент кафедры патологической анатомии с курсом клинической патологии. Адрес для переписки: 644099, г. Омск, ул. Партизанская, 20.
Статья поступила в редакцию 18.08.2010 г. © Е. Г. Поморгайло
Книжная полка
Кохен, М. Детская неврология : пер. с англ. / М. Кохен, П. Даффнер. - М. : ГЭОТАР-Медиа, 2010. -345 с. : ил.
В карманном руководстве представлена наиболее актуальная и современная информация по диагностике и лечению болезней нервной системы у детей и подростков. Четкое структурирование, диагностические и лечебные алгоритмы, а также прекрасный вспомогательный аппарат помогают быстро отыскать ответы на практически значимые вопросы, что делает издание особенно полезным врачу-клиницисту. В книге освещены основные проблемы детской неврологии: от нейроанатомии, сбора анамнеза и неврологического обследования до наиболее важных неврологических синдромов и самостоятельных нозологий. Предназначено педиатрам, неврологам, врачам общей практики, ординаторам и интернам, студентам старших курсов медицинских вузов.
Лечение и рациональная фармакотерапия заболеваний органов пищеварения у детей / ред. А. М. За-пруднов. - М. : МИКЛОШ, 2010. - 320 с. : ил. - (Библиотека практического врача). - (Актуальные вопросы современной педиатрии).
В книге излагаются актуальные аспекты лечения и рациональной фармакотерапии как наиболее распространенных, так и относительно редко встречающихся заболеваний органов пищеварения в детском возрасте. Приведены сведения об антацидных, антисекторных, антибактериальных средствах, регуляторах моторики желудочно-кишечного тракта, ферментных, желчегонных препаратах, пробиотиках, энтеросорбентах и др. Дается перечень основных лекарственных средств, используемых в детской гастроэнтерологии. Издание предназначено для врачей-педиатров, детских гастроэнтерологов и хирургов.
