CC BY
13экспериментальная и клиническая урология №2 2010 www.ecuro.ru
Особенности индукции апоптоза в культуре лимфоцитов периферической крови больных с различными формами острого пиелонефрита
Л.А. Ходырева, В.Н. Синюхин, Л.А. Харламова
ФГУ «НИИ урологии Росмедтехнологий», Москва
В прогнозе развития острого пиелонефрита и течения системной воспалительной реакции большое значение отведено изучению состояния иммунной системы макроорганизма - гуморального и клеточного иммунного ответа [1, 2].
Изучение разных субпопуляций лимфоцитов, провоспалительных и противовоспалительных цитокинов и апоптоза клеток крови может дать важную информацию для определения тактики ведения пациентов с острым пиелонефритом и системным воспалительным ответом [3, 4].
Известно, что сила и качество иммунного ответа макроорганизма зависят от соотношения процессов апоптоза и пролиферации клеток. Возникновение многих тяжелых заболеваний связывают с нарушением программированной клеточной гибели. В последние годы выделяют несколько ее типов: это апоптоз, ау-тофагическая гибель и запрограммированный некроз. Значительное усиление активационного апоптоза можно охарактеризовать как тенденцию к развитию иммунодефи-цитного состояния, являющегося следствием воспалительного процесса [5, 6]. В настоящее время счи-
тают, что тип дисрегуляции процесса смерти клеток крови предопределяет характер развития воспалительного процесса, его исход и терапевтическую тактику ведения больного [7]. Установлено, что ускорение процесса апоптоза лимфоцитов является основной причиной имму-носупрессии при септическом состоянии [8]. Апоптоз Т-лимфоцитов при септическом шоке превосходит таковой при сепсисе. Этот процесс сопровождается уменьшением синтеза интерлейкина-2 без изменения секреции гамма-интерферона и ТОТ-альфа. Скорость апоптоза коррелирует с уровнем интерлей-кина 6 и экспрессией на лимфоцитах каспазы 9 [9]. Считается, что усиление апоптоза связано с дисбалансом процесса ко-стимуляции Т-клеток, клеточной гипоксией, в результате возникает нарушение функции митохондрий, от которых зависит функция и жизнеспособность клетки [10]. Увеличивается содержание И1Б1-альфа (гипоксия индуцируемый фактор)-ядерного фактора транскрипции, что является отражением провоспалительного профиля и дисфункции лимфоцитов [11]. На основании этих данных можно сделать вывод о том, что необходимо изучение апоптоза □
Features of apoptosis induction in peripheral blood lymphocytes culture in patients with various forms of acute pyelonephritis L.A. Khodyreva, V.N. Sinyukhin, L.A. Kharlamova
A lot of attention has been paid to evaluation of host immune system status for prognosis of acute pyelonephritis and system inflammatory response. It is known that strength and quality of the host immune response depend on balance between apoptosis and cell proliferation processes. It is known from literature that in patients with purulent and septic diseases a rise of apoptotic readiness is observed in both fresh isolated and cultured lymphocytes. Absence of studies of peripheral blood lymphocytes apoptosis nature in patients with acute pyelonephritis was the reason for the present study. Assay of lymphocyte apoptosis dynamics in cell cultures of healthy
humans and patients with various
forms of acute pyelonephritis was performed. 28 patients with acute upper urinary tract infection were enrolled in the study. There were 12 patients with acute purulent destructive process and 16 patients with noncomplicated pyelonephritis. A control group consisted of 14 healthy donors. It was demonstrated that purulent complications are accompanied by significant increase in apoptotic cells among the fresh isolated lymphocytes. In vivo incubation detected significant difference in dynamics of lymphocyte apoptosis rising depending on severity of the disease: in case of purulent complications it was much higher than in healthy individuals, and reduction of activation apoptosis was observed in patients without complications. Therefore the assay of lymphocyte apoptosis may provide important information for prognosis determination and management of patients with acute pyelonephritis.
экспериментальная и клиническая урология
№2 2010 www.ecuro.ru
лимфоцитов в клеточных культурах без влияния различных факторов макроорганизма. Это позволит оценить их жизнеспособность на фоне различной выраженности воспалительного процесса.
Отсутствие исследований апоп-тоза лимфоцитов периферической крови больных с острыми формами пиелонефрита послужило причиной к проведению научных исследований в этом направлении [3, 5].
Мы поставили перед собой задачу исследовать апоптоз лимфоцитов в культурах клеток здоровых и больных с различными формами острого пиелонефрита.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В исследование было включено 28 пациентов с острым инфекционно-воспалительным процессом верхних мочевых путей. С острым гнойно-деструктивным процессом было 12 больных и с неосложненным пиелонефритом - 16 . Контрольную группу составили 14 здоровых доноров. Средний возраст во всех группах составлял 45 ± 5,4 лет. Пациентам, включенным в исследование, проведена оценка апоптоза лимфоцитов в культуре клеток. Выделение лимфоцитов крови проводили по стандартной методике в градиенте плотности фиколл-верографина. Клетки культивировали в среде RPMI 1640 c добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 ммоля L-глютамина и бактериостатической концентрации гентамицина(20 мг) в СО2 инкубаторе при 370С. Процент апоптоза оценивали через 24, 48 и 72 часа инкубации. Все культуры клеток исследовали в 4 вариантах: контрольная культура, культура с ФГА (фитогемагглютинином), дек-саметазоном, с ФГА и дексаметазо-ном. Индуктором апоптоза служил дексаметазон (Sigma США) в концентрации 10-3 моль. В качестве активатора лимфоцитов использовался ФГА (Difco США) в концентрации 10 мкг/мл. Апоптоз оценивали на проточном цитофлюориметре
«Coulter EPICS XL» по программе «Simulset», используя двойное окрашивание клеток аннексином Y-FITZ и пропидий йодидом. Такой метод позволяет различать 3 категории клеток:
1) связывающих только аннек-син (А+П-), что соответствует ранней стадии апоптоза, когда не нарушена клеточная мембрана;
2) меченые анексином и про-пидием (А+П+) - поздняя стадия, которая наступает при дефекте клеточной мембраны;
3) живые неокрашенные клетки (А-П-).
Статистический анализ полученных результатов проводили с помощью компьютерной программы Statistica 5.11.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ апоптоза лимфоцитов в культурах клеток здоровых доноров (ЗД), I группа. В свежевы-деленной популяции лимфоцитов апоптоз А+ П- составлял 5%. В процессе инкубации этот показатель возрастал со скоростью, которая зависела от варианта культивирования. Данные приведены на рисунке 1-А, из которого видно, что в контрольной культуре процентное содержание клеток А+П- после небольшого подъема до 11% оставался стабильным до 72 часов.
Добавление в культуру ФГА вызывало в течение 24-48 часов значительный подъем уровня апоптоза, втрое превышающий контроль.
В культурах с дексаметазоном индукция апоптоза была выражена не столь значительно, достигая к 48 часам 15%.
Уровень клеток А+П- занимал промежуточное значение в культуре, содержащей оба индуктора.
Анализ лимфоцитов в культурах больных гнойно-деструктивным пиелонефритом (ОГП), II группа. Уровень апоптоза свежевыде-ленных лимфоцитов этой группы
Часы
конг фга декс о фга+декс
1Б. Пациенты с острым гнойным
Часы
конт -•-фга -*-декс о фга+декс
1В. Пациенты с острым неосложненным пиелонефритом
Часы
• конт фга декс фга+декс
Рисунок 1. Изменение содержания лимфоцитов на ранней стадии апоптоза в культуре клеток.
экспериментальная и клиническая урология №2 2010 www.ecuro.ru
таблица 1. соотношение содержания в культурах лимфоцитов поздней и ранней стадии апоптоза (индекс п+/п-)
вид культуры зд огп оп
время М ± m 5 М ± m 5 М ± m 5
0 часов 0,79 ± 0,19 0,33 0.37 ± 0,04 0,08 0,47 ± 0,07 0,25 |
КОНТ. |
24ч. 1,31 ± 0,57 1,001 0,29 ± 0,04 0,09 0,88 ± 0,13 0,49
48ч. 1,88 ± 0,81 1,39 0,57 ± 0,06 0,13 1,42 ± 0,24 0,95
72ч. 1,90±0,47 0,814 0,62 ± 0,06 0,13 1,37±0,19 0,75
ФГА |
24ч. 0,76 ± 0,31 0,53 1,01 ±0,03 0,06 0,91 ± 0,18 0,67
48ч. 0,91 ± 0,12 0,21 0,59 ± 0,02 0,05 1,28 ± 0,25 0,97
72ч. 0,91 ± 0,07 0,104 0,73 ± 0,03 0,06 0,98 ± 0,21 0,78
1 ДЕК. |
24ч. 3,89 ± 0,29 0,46 0,63 ± 0.05 0,12 0,99 ± 0,12 0,46
48ч. 2,52 ± 0,15 0,27 1,14 ± 0,07 0,15 1,13 ± 0,12 0,45
72ч. 3,23 ± 0,46 0,799 0,73 ± 0,05 0,06 0,98 ± 0,21 0,78
| ФГА+ДЕК |
24ч. К 1,54 ± 0,09 0,165 1,46 ± 46 0,09 1,09 ± 0,15 0,58
48ч. 1,54 ± 0,15 0,263 0,68 ± 0,02 0,05 1,51 ± 0,24 0,93
72ч. 1,28 ± 0,04 0,071 1,03 ± 0,04 0,09 1,09 ± 0,12 0,47
таблица 2. достоверность различия по непараметрическому критерию манна-уитни между коэффициентом накопления некротических клеток разных групп исследуемых пациентов
зд и огп зд и оп огп и оп
| Контр. |
24 час. 0,025* 0,51 0,012*
48 час. 0,025* 0,441 0,016*
72 час. 0,023* 0,109 0,02*
| ФГА |
24 час. 0,45 0,952 0,649
48 час. 0,024* 0,950 0,016*
72 час. 0,025* 0,952 0,57
1 ДЕКС. |
24 час. 0,023* 0,015* 0,073
48 час. 0,025* 0,007* 0,82
72 час 0,024* 0,02* 0,106
| ФГА+ДЕКС. |
24 час. 0,368 0,313 0,359
48 час 0, 025* 0,138 0,01*
72 час. 0,025* 0,685 0,965
больных составлял 18%. В процессе инкубации наблюдался значительный рост количества вступающих в апоптоз клеток в контрольных культурах, т.е. без индукторов апоп-тоза. В культуре с ФГА наблюдалось очень резкое повышение процентного содержания клеток периферической крови, вступивших в апоп-тоз, который достигал 50% к концу культивирования.
Добавление дексаметазона не привело к дополнительному росту апоптоза клеток крови по сравнению с лимфоцитами контрольной культуры.
Культура ФГА + дексаметазон практически не отличалась от культуры с ФГА (рисунок 1Б).
Анализ культур больных острым неосложненным пиелонефритом (ОП), III группа. Данные, приведенные на рисунке 1В, свидетельствуют, что культуры клеток больных этой группы, в частности контрольная и с дексаметазоном, полностью повторяют данные, полученные на клетках здоровых людей. В культурах с добавлением ФГА существенного подъема уровня апоптоза не наблюдалось, по крайней мере, до 48 часов.
Итак, при исследовании крови здоровых доноров и больных пиелонефритом было выявлено:
1) гнойные осложнения сопровождались достоверным повышением содержания апоптотических клеток среди свежевыделенных лимфоцитов периферической крови;
2) культивирование лимфоцитов выявило существенные отличия в нарастании количества апопто-тических клеток, определяемое как условиями культивирования, так и тяжестью заболевания. При гнойных осложнениях уровень их был намного выше, чем у здоровых людей. Это наблюдалось при всех вариантах культивирования. У больных с острым пиелонефритом с неослож-ненным течением инфекционно-воспалительного процесса уровень апоптоза лимфоцитов в культурах достоверно не отличался от нормы.
В литературе можно найти немало сообщений, посвященных изменению чувствительности к апоптозу лимфоцитов в культуре in vitro при различной патологии. Так, в работе Е.Р. Черных [3] исследовали апоптоз периферических Т-лимфоцитов у хирургических больных с гнойно-септическими заболеваниями. Было обнаружено повышение апоптоза как среди свежевыделенных лимфоцитов, так и среди культивированных 24 часа мононуклеарных клеток крови в контрольной культуре без стимуляции апоптоза. То же самое наблюдали и в присутствии анти СД3 моноклональных антител.
В.Д. Шаповалов [2] сообщает о повышении чувствительности к индукции апоптоза лимфоидных клеток при хронических поражениях пародонта.
В отечественной и зарубежной литературе имеются сообщения о повышении апоптогенной готовности лимфоцитов периферической крови больных системной красной волчанкой при культивировании in vitro [4].
P. Мeier [5] обнаружил резкую активацию апоптоза в культуре Т лимфоцитов крови больных с □
экспериментальная и клиническая урология
№2 2010 www.ecuro.ru
хронической почечной недостаточностью как в присутствии ФГА, так и без стимуляции в контрольных культурах.
Таким образом, данные об изменении чувствительности к апоптозу лимфоцитов, выявляемые при культивировании, при различных заболеваниях подтверждаются многими исследователями.
В работах, посвященных изучению апоптоза в клинической практике, как правило, учитывается только стадия раннего апоптоза А+П-, поскольку, используя проточную цитометрию, лишь на этой стадии можно отличить апоптоти-ческие клетки от некротических. Известно, что in vivo апоптозные клетки распадаются на апоптозные тельца, минуя фазу повреждения клеточной оболочки, и весь процесс длится не более 3 часов. В культуре процесс дезинтеграции апоптоз-ных клеток длится, видимо, дольше, включает фазу нарушения проницаемости клеточной мембраны, называемую поздней стадией апоптоза А+П+. В культуре таких клеток будет тем больше, чем дольше длится их полный распад. Кроме того, несомненно, что часть лимфоцитов крови в культуре гибнет путем некроза. При этом отек и нарушение проницаемости клеточной оболочки - достаточно ранние события, влекущие за собой проникновение в клетку пропидия и анексина, что дает возможность количественно оценивать наличие некротических клеток А+П+. Относительно названия, информативной ценности и источника клеток А+П+ в культуре у исследователей нет единого мнения. В ряде работ эти клетки считают поздней стадией апоптоза. В других называют некротическими, полагая, что дезинтеграция клеток после нарушения целостности клеточной мембраны при апоптозе и некрозе in vitro мало чем отличаются, и оценить вклад того и другого процесса на этой стадии методом проточной цитометрии невозможно.
80 70 60 50 40 30 20 10 0
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
60 50
24 48 72 Контроль
24 48 72 ФГА
24 48 72 ДЕКС
24 48 72 ФГА + ДЕКС
2Б. Пациенты с острым гнойным обструктивным пиелонефритом
24 48 72 Контроль
24 48 72 ФГА
24 48 72 ДЕКС
24 48 72 ФГА + ДЕКС
2В. Пациенты с острым неосложненным пиелонефритом
24 48 72 Контроль
24
48 ФГА
72
24 48 72 ДЕКС
24 48 72 ФГА + ДЕКС
Рисунок 2. Суммарное содержание % лимфоцитов на ранней и поздней стадии апоп-тоза ( А+П- нижняя часть , А+П+ верхняя часть каждого столбца) в культуре клеток
Учитывая вышесказанное, мы попытались проанализировать накопление в культурах клеток А+П+. Отмечена некая закономерность: часто культуры с низким уровнем клеток А+П- имели высокий процент А+П+ и наоборот (рисунок 2А, 2Б, 2В). Для сравнения и анализа
этих данных для всех культур было вычислено соотношение А+П+/ А+П- (индекс П+/П-) в культуре клеток здоровых людей, культуре клеток больных острым гнойным пиелонефритом и культуре клеток больных острым неосложненным пиелонефритом (таблица 1).
экспериментальная и клиническая урология №2 2010 www.ecuro.ru
Культуры клеток здоровых людей. Из данных, представленных на рисунке 2А и в таблице 1, видно, что в контрольных культурах здоровых людей уже к окончанию первых суток превалируют клетки на стадии А+П+, (П+/П-=1,3), далее их количество продолжает нарастать, превышая фазу А+П- в полтора-два раза (П+/П- = 2,0 и 1,6 к 48 и 72 час. инкубации).
При добавлении в культуры ФГА наблюдалась иная ситуация: быстро нарастало количество клеток ранней фазы А+П-, к 48 часам их было более 40%, а количество клеток в поздней фазе А+П+ отставало на протяжении всего периода инкубации (П+/П- везде меньше 1.)
В культурах с дексаметазоном при умеренной активации апоптоза (10-11%) наблюдалось значительное накопление клеток на стадии А+П+, их количество к исходу 72 часов почти вчетверо превышало процентное содержание апоптоз-ных клеток крови в ранней стадии (П+/П- к 24 часам = 2; к 72час. = 3,8.) А в культурах, содержащих и ФГА, и дексаметазон, эти показатели имели промежуточные значения.
Культуры лимфоцитов больных гнойно-деструктиным пиелонефритом. В контрольных культурах лимфоцитов этих больных, как было отмечено выше, во все
сроки инкубации уровень раннего апоптоза А+П- был повышенным. По сравнению с ним содержание клеток поздней фазы было гораздо ниже: индекс П+/П- составлял 0,3- 0,6 (рисунок 2Б и таблица 1). В культурах с ФГА наблюдалась аналогичная картина: высокая активация апоптоза (А+П- более 40 %) в сочетании с умеренным увеличением А+П+; индекс П+/П- составлял 0,6-0,7.
В культурах с дексаметазоном активация апоптоза клеток крови такая же, как в контрольных культурах больных этой группы, а уровень А+П+ был выше: индекс П+/П- в поздние сроки составлял 1,5. В соответствующей культуре здоровых доноров этот показатель достигал величины 3,8.
Культуры клеток больных острым неосложненным пиелонефритом. Уровень ранней фазы апоптоза (А+П-) в целом по всем культурам не отличался от соответствующих значений у здоровых людей (10-11%), но наблюдалась явная тенденция снижения содержания клеток А+П+ и, соответственно, показателя П+/П- по сравнению с культурами клеток здоровых людей. Из таблицы 2 видно, что это снижение достоверно для культур с дексаметазоном. Подтверждение тому, что добавление дексметазо-
на в культуру лимфоцитов крови здоровых людей вызывает накопление клеток в стадии А+П+, мы обнаружили в работе Vermes (1995). В ней приведены гистограммы с данными обо всех категориях клеток, определяемых при подсчете на проточном цитометре, из которых видно, что в контрольных культурах лимфоцитов здоровых людей через 72 часа апоптоз А+П- = 5,5%, а А+П+ = 7,5%, т.е. П+/П- = 1,3. При добавлении дексаметазона в культурах того же срока А+П- = 7,0, а А+П+ = 18, т.е. П+/П- = 2,6 данные близки к нашим.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
При инкубировании лимфоцитов периферической крови здоровых людей и больных пиелонефритом были обнаружены отличия не только по критерию уровня апопто-за клеток стадии А+П-, общепринятому в работах такого рода, но и по уровню А+П+.
Оказалось, что содержание в культуре клеток на стадии А+П+ и их соотношение с ранней фазой апоптоза подчиняется определенным закономерностям, которые, по нашим данным, определялись, с одной стороны, индуктором апоп-тоза, а с другой - тяжестью воспалительного процесса обследованных больных. □
Ключевые слова: острый пиелонефрит, острый гнойный пиелонефрит, апоптоз лимфоцитов. Keywords: acute pyelonephritis, acute purulent pyelonephritis, lymphocyte apoptosis.
ЛИТЕРАТУРА
1. Боровкова И.В., Хватов В.Б., Александрова И.В., Рей С.И., Линский М.Е., Авакумов ММ. Апоптоз мононуклеарных клеток и мертвых лейкоцитов в венозной крови септических больных // Вестник российской академии медицинских наук. 2009. № 8. С. 33-36.
2. Шаповалов В.Д. Апоптоз в патогенезе хронических воспалительных заболеваний пародонта // Иммунология. 2001. №.5. С.50-51.
3. Черных Е.Р., Норкин М.Н., Леплина О.Ю., Тихонова М.Л., Хонина Н.А., Останин А.Л. Апоптоз и анергия периферических Т-лимфоцитов при гнойно-септической патологии //Медицинская иммунология. 1999. Т.1, № 5. С.45-51.
4. Забежинская О.М. Повреждение структуры ДНК лейкоцитов периферической крови у больных системной красной волчанкой и другими аутоиммунными заболеваниями как маркер апоптогенной готовности // Вопросы биол. медицины и фармац. химии. 2002. № 3. С. 24-28.
5. Meier P., Dayer E., Blanc E., Wauters J.P. Early T cell activation correlates with expression of apoptosis markers in patients with end- stage renal desease //J. Am. Soc. Nephrol. 2002. Vol.13. № 1. P. 204-212.
6. Vermes I., Haanen C., Steffens-Nakken H., Reutelingsperger C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphotidylserine expression on early
apoptosis cell using fluorescein labeled Annexin Y // J. Immunological methods. 1995, Vol. 184. P. 39-51.
7. Bantel H., Shultze-Osthoff K. Cell death in sepsis matter of how, when, where// Critical care. 2009. Vol. 13, № 4. P.173-174.
8. Hotchkiss R.S., Coopersmith C.M , Karl I.T. Prevention of lymphocytes apopto-sis-a potential treatment of sepsis? // Clin. Inf. Dis. 2005. Vol.15. № 41, Suppl. 7. P 465-464.
9. Delogue G., Famulako G., Tellan G., Mandozola M., Antomecci F., Signore M.,Marcellini S., Moretti S. Lymphocyte apoptosis, caspase activation and inflammatory response in septic shock // Infection. 2008. Vol. 36, № 5. P.485-487.
10. Roger P.M., Hyvernat H., Breitmayer T.P., Dellamonica J., Bernardin J., Bernard A. Enchanced T-cell apoptosis in human septic shock is associated with alteration of costimulatory pathways // Eur. J.Clin. Inf. Dis. 2010. Vol. 28, № 6. P. 575-578.
11. Roguiera T., Andersen M., Dajafarezadeh S. Vitochondrial desfunction during sepsis, impact and possible regulating role of hypoxia inducible factor 1-alfa // Med. Intensive. 2009. Vol. 33. № 8. P.385-392.
12. Darzynkiewicz Z., Juan G., Li X., Gorczyca W., Murakami T., Traganos F. Cytometry in Cell Necrobiology: Analysis of Apoptosis and Accidental cell Death (Necrosis) // Cytometry. 1997. Vol. 27, № 1. P.1-20.
