CC BY
43
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК: 618.19-006.6+576.8.077.3
ОСОБЕННОСТИ ИММУНОФЕНОТИПА КЛЕТОК РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПЬ СТАДИИ
Д.А. Енгай, И.В. Поддубная, Н.Н. Тупицын
Кафедра онкологии РМАПО, г. Москва РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, г. Москва
В работе изучен иммунофенотип опухолевых клеток больных молочной железы 11Ь стадии. Показано, что он характеризуется целым рядом неблагоприятных признаков, взаимосвязанных между собой. Дальнейшие, более углубленные, исследования иммунофенотипа рака молочной железы позволят в будущем более полно оценить прогностическое значение изученных иммунологических маркеров при раке молочной железы 11Ь стадии.
Ключевые слова: рак молочной железы, иммунофенотип.
IMMUNOPHENOTYPE OF STAGE IIB BREAST CANCER CELLS D.A. Engai, I.V Poddubnaya, N.N. Tupitsyn Oncology Department, Russian Medical Academy of Postgraduate Education, Moscow N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Moscow
Tumor cell immunophenotype of patients with stage Ilb breast cancer has been studied. It has been shown that it is characterized by the whole number of unfavorable interrelated factors. Further studies of breast cancer immunophenotype will allow a more complete assessment of prognostic significance of immunologic markers for stage II breast cancer.
Key words: breast cancer, immunophenotype.
Рак молочной железы (РМЖ) - одно из самых распространенных онкологических заболеваний у женщин. Статистические данные последних лет свидетельствуют о неуклонном, интенсивном росте заболеваемости и смертности от рака молочной железы, несмотря на значительные успехи в лечении заболевания, достигнутые в результате совершенствования хирургических и лекарственных методов [1]. Лечение данной категории пациенток очень сложно. В связи с этим не теряет своей актуальности разработка новых подходов к прогнозированию заболевания и выбору наиболее эффективных схем лечения для каждой больной. В последние годы большое внимание уделяется различным молекулярным и клеточным маркерам, характеризующим фундаментальные биологические свойства опухоли [2]. Тем не менее из-за большого числа потенциально значимых молекулярно-биологи-
ческих факторов и из-за больших расхождений представленных в литературе данных об их прогностической ценности выбор определенного типа терапии, основанный на биологических характеристиках опухоли, остается затруднительным для врача. Многие исследователи в целом довольно скептически относятся к возможностям практического использования этих параметров в настоящее время из-за существующей во многих западных странах тенденции к повсеместному применению адъювантной терапии. Тем не менее по крайней мере в трех ситуациях прогностические факторы могут быть полезны: во-первых, для выявления пациентов с очень хорошим прогнозом, для которых осложнения и стоимость лечения не будут оправданы имеющимся низким риском рецидива; во-вторых, для выявления группы больных с очень плохим прогнозом, которым требуется
более агрессивное адъювантное лечение, и, в-третьих, для определения чувствительности или резистентности больных к конкретным видам терапии. Кроме того, на основании исследования молекулярно-биологических особенностей опухоли может быть создана новая стратегия лечения, непосредственно влияющая на определенные молекулы и процессы [3]. Знание специфических биологических характеристик опухоли может помочь и в усовершенствовании существующих схем терапии, и в развитии новых подходов к лечению, основанных, например, на иммунотерапии, генной терапии или на модификации системы передачи регуляторных сигналов в клетке[2].
Целью данной работы было определение иммунофенотипических особенностей клеток больных РМЖ 11Ь стадии.
Материал и методы
Материалом для настоящего исследования послужили данные клинического, морфологического и иммуногистохимического обследования 51 больной РМЖ 11Ь стадии. Пациентки проходили лечение в различных отделениях РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН в период с января 2002 г. по март 2003 г. Диагноз рака молочной железы был доказан клинически, рентгенологически и морфологически у всех больных. Возраст больных находился в пределах 36-77 лет (медиана - 54 года). У большинства пациенток (32/51, 63 %) была сохранена менструальная функция, и только у 1/3 больных (19/51, 37 %) была менопауза длительностью больше 5 лет. На первом этапе всем больным проведено оперативное лечение.
По гистологическому строению опухоли распределились следующим образом: инфильтрирующий протоковый рак - 31 больная (61 %) инфильтрирующий дольковый рак - 12 больных (23 %), другие гистологические формы составили 16 % (8 больных), из них: медуллярный рак - 3 больных (6 %), тубулярный рак - 3 больных (6 %), внутрипротоковый рак - 2 больных (4 %). Больные были прослежены в течение 42-54 мес (медиана 45 мес). За время наблюдения отдаленные метастазы возникли у 37 из них, от прогрессирования заболевания умерло 3 пациентки. Из всей группы исследованных больных у 27 %
(і 4/5 і) отмечено прогрессирование заболевания в сроки от 2 до 45 мес.
При иммунофенотипировании клеток первичной опухоли использованы следующие моноклональные антитела, полученные в лаборатории А.Ю. Барышникова и в лаборатории VB. Mechetner: HEA-i25 к панэпителиальному антигену, ICO-25 к HMFG-i, к антигенам главного комплекса гистосовместимости: ICO-53 к HLA- і и ICO- і к HLA-DR. К лейкоцитарным антигенам H-le і к СД 45, ICO-2Q к СД38. ICO-SS к трансферриновому рецептору СД 7i, ICO-16Q к рецептору апоптоза CD95, My-l3 к CD 54, UIC-2 к Pgp 17Q. При иммунофенотипировании опухолевых клеток результаты реакций учитывали полуколичественным методом. Клинические данные и результаты всех исследований были занесены в специально созданную базу данных. Математическая обработка данных проводилась на персональном компьютере с помощью пакета программ «Статистика для Windows» (StatSoft Inc., 199б, Version 5,Q).
Результаты
Чаще всего на опухолевых клетках рака молочной железы выявлялся панэпителиальный антиген Egp 34 - iQQ % мономорфная положительная реакция. Реже обнаруживалась экспрессия антигена мембран жировых шариков молока HMFG-l: в б5 % (33/51) случаев наблюдалась мономорфная реакция, в 29 % (15/5 і) случаев -мозаичная и отсутствие реакции отмечено только в б % (3/51) наблюдений. Для молекул HLA-I мономорфный тип реакции отмечен в 31 % (1б/51) случаев, мозаичный - в 12 % (б/5 і) случаев и отсутствие экспрессии антигена отмечено в 57 % (29/5 і) наблюдений. Для молекул HLA-II мономорфный тип реакции отмечен в 1Q % (5/51) случаев, мозаичный - в 14 % (7/51) случаев и отсутствие экспрессии антигена отмечено в 7б % (39/5 і) наблюдений. В большинстве случаев наблюдается взаимосвязь снижения уровней экспрессии молекул HLA-I с отсутствием на мембране опухолевых клеток HLA-DR антигенов, что может свидетельствовать о существовании особенностей регуляции молекул HLA при опухолях, что проявляется в подавлении экспрессии молекул обоих классов HLA [4]. Чаще всего в исследуемой группе встречался
иммунофенотип HLA-I- HLA-DR— 53 % (27 случаев из 51). Таким образом, более половины больных раком молочной железы IIb стадии ещё до начала лечения имеют довольно высокий процент HLA негативных опухолей. При исследовании экспрессии антигена CD 95, рецептора апоптоза, также называемого Fas/APO-1, моно-морфный тип реакции отмечен в небольшом проценте случаев - 22 % (11/51), отсутствие реакции наблюдалось в 78 % (40/51) случаев и мозаичная реакция отсутствовала. По мнению А.А. Ставровской, устойчивость опухолевых клеток к индукции апоптоза является одним из неблагоприятных прогностических признаков и может играть роль в развитии лекарственной резистентности опухолевых клеток [5]. Далее. только мозаичный тип реакции был отмечен в 41 % (21/51) случаев при рассмотрении экспрессии молекулы адгезии ICAM-1, моно-морфный тип реакции не наблюдался совсем и полностью отсутствовала экспрессия антигена в 59 % (30/51) наблюдений. lCAM-1 одновременно с ICAM-2 и VCAM-1 являются представителями суперсемейства иммуноглобулинов, экспрессируются на поверхности эндотелия, активированного цитокинами, и участвуют во взаимодействии эндотелия с Т-клетками, что обеспечивает накопление мононуклеарных клеток в васкулярной зоне [7]. В нашей работе наблюдался довольно высокий уровень экспрессии ICAM-1 на опухолевых клетках. Возможно, дальнейшие исследования экспрессии молекул адгезии при раке молочной железы позволят более полно оценить его прогностическое значение. Достоверно установлено, что прогностическая роль рецептора трансферрина реализуется в тех случаях, когда длительность послеоперационного периода, в течение которого у больных не отмечено признаков наличия болезни в организме, превышает 1 год [7]. При изучении уровня экспрессии рецептора транс-феррина CD 71 мономорфный тип реакции отмечен в 53 % (27/51) случаев, мозаичный тип реакции - в 16 % (8/51) случаев и отсутствие реакции - в 31 % (16/51) наблюдений. По мнению большинства авторов, низкая степень лейкоцитарной инфильтрации опухолевой ткани расценивается как ослабление местного иммунитета, определяющее, в конечном счете,
менее благоприятный прогноз заболевания [8]. Нами был оценен общий уровень лейкоцитарной (общелейкоцитарный антиген CD 45) и степень CD 38+ инфильтрации опухолевой ткани на основании количества присутствующих в срезах клеток. В случае с CD 45 преобладала минимальная реакция туморинфильтрирую-щих лимфоцитов с наличием лишь единичных клеток в срезах - 45 % (23/51), в 39 % (20/51) отмечалась выраженная инфильтрация, реже всего наблюдалась умеренная инфильтрация -16 % (8/51). Количество CD 38+ клеток в срезах рака молочной железы в большинстве случаев (72 %, 37/51) было умеренным, в 20 % (10 случаев из 51) - выраженным и в 8 % (4/51) случаев - минимальным. Анализируя полученные данные, можно отметить довольно умеренную активность туморинфильтрирующих лимфоцитов в опухолях больных РМЖ. Для оценки корреляции между иммунофенотипическими маркерами РМЖ и инфильтрацией ткани опухоли лимфоцитами и плазмоцитами уровни экспрессии антигенов на опухоли и уровни местных иммунных реакций были оценены в баллах. По данным мировой литературы, в большинстве случаев наблюдается достоверная взаимосвязь снижения уровней экспрессии молекул HLA-I с отсутствием на мембране раковых клеток HLA-II - антигенов [9]. В нашей работе экспрессия молекул HLA-DR наблюдалась только при наличии на мембране клеток рака молочной железы антигенов HLA-I (р=0,0003, метод Спирмена, г=0,46). Экспрессия молекул HLA-I на опухолевых клетках была достоверно связана (положительная умеренная ассоциация) с уровнями лейкоцитарной инфильтрации рака молочной железы (CD 45): при отсутствии экспрессии молекул HLA-I выраженная лейкоцитарная инфильтрация (CD 45+) обнаруживается в 41% случаев, а при мономорфной экспрессии антигена HLA-I пропорция CD 45 - позитивных клеток возрастает в 1,7 раза и составляет 69 % (р=0,003, метод Спирмена, г=0,39). Аналогичная ситуация отмечена для CD 38+ клеток: при отсутствии экспрессии HLA-I выраженная инфильтрация CD 38+ клеток обнаружена в 7 % случаев, а при мономорфной реакции HLA-I доля CD 38 позитивных клеток возрастает до 44 %, т.е. более чем в 6 раз. Таким образом,
наблюдается достоверная ассоциация HLA-I с уровнем инфильтрации опухоли CD 38+ клетками (р=0,017, х2=11,95). По-видимому, для иммунофенотипа РМЖ ПЬ стадии характерна тесная взаимосвязь антигенов гистосовместимости с различными типами иммунологических реакций в ткани опухоли. Наблюдалась достоверная ассоциация между лейкоцитарной (CD 45+) инфильтрацией и CD 38+ инфильтрацией (р=0,0009, х2 =18,54). Обнаружена достоверная корреляция экспрессии антигена HLA-II с уровнем инфильтрации CD 38+ клеток (р=0,001, %2 =18,22). Обнаружена достоверная взаимосвязь лейкоцитарной инфильтрации (CD 45+) с экспрессией молекулы адгезии ГСАМ 1: по мере нарастания инфильтрации CD 45+ клеток в опухоли пропорция ГСАМ 1 позитивных случаев возрастает с 26 до 45 %, непараметрическая оценка х2 =16,17 (р=0,04). Отмечена статистически значимая корреляция экспрессии рецептора трансферрина CD 71 с молекулой адгезии ГСАМ 1: по мере нарастания числа CD 71 анти-генпозитивных клеток увеличивается частота экспрессии ГСАМ 1 более чем в два раза - с 26 до 56 % (р=0,007, метод Спирмена, г=0,36). Полученные результаты позволяют говорить о наличии тенденции к нарастанию экспрессии рецептора трансферрина при сохранной экспрессии ГСАМ 1 на опухолевых клетках. Коэкспрессия рецепторов на мембране может быть основой для создания высокопролифели-рующего клеточного пула и являться причиной неблагоприятного прогноза у данной группы исследованных больных. Косвенным подтверждением вышесказанного может служить и тот факт, что обнаружена статистически достоверная обратная взаимосвязь молекулы апоп-тоза (CD 95) с рецептором адгезии (ГСАМ 1): утрата экспрессии ГСАМ 1 по мере увеличения экспрессии CD 95 с 37 до 55 % (р=0,001, X2=10,45). Таким образом, исследованная группа больных раком молочной железы ПЬ стадии по совокупности описанных иммунофенотипи-
ческих характеристик обладает целым рядом прогностически неблагоприятных признаков: низкий уровень экспрессии молекул HLA I и II классов, молекулы апоптоза CD 95, довольно высокий уровень экспрессии молекул ICAM 1 и CD 71, а также низкая активность туморинфиль-трирующих лимфоцитов. Впервые обнаружена достоверная корреляция экспрессий молекул СD 45, CD 71 и CD 95 с экспрессией молекулы ICAM 1.
ЛИТЕРАТУРА
1. АртамоноваЕ.В. Иммунологическая микрогетерогенность рака молочной железы: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. М., 1992.
2. Артамонова Е.В., Кадагидзе З.Г., Летягин В.П. и др. Экспрессия рецептора трансферрина (CD 71) клетками рака молочной железы // Медицинская иммунология. 2003. Т. 1-2. С. 143-148.
3. Артамонова Е.В., Тупицын Н.Н., Огнерубов Н.А. Кадагидзе З.Г. Экспрессия мономорфных детерминант молекул главного комплекса гистосовместимости I и II классов клетками рака молочной железы // Иммунология. 2005. № 5. С. 284-287.
4. Барышников А.Ю., Тоневицкий А.Г. Моноклональные антитела в лаборатории и в клинике. М., 1997.С. 99-105.
5. Барышников А.Ю., Степанова Е.В. // Материалы III ежегодной Российской онкологической конференции. СПб.,
1999.
6. Барышников А.Ю. Взаимоотношение опухоли и иммунной системы организма // Вестник онкологии. 2003. № 5. С. 13-17.
7. Володько Н.А. Местные клеточные иммунные реакции при раке молочной железы (клинико-иммуноморфологическое исследование): Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Киев, 1988.
8. Рак молочной железы / Под ред. Н.Е. Кушлинского, С.М. Портного, К.П. Лактионова. М.: Изд-во РАМН, 2005. 180 с.
9. Ставровская А.А. Клеточные механизмы множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток // Биохимия.
2000. Т. 65, вып. 1. С. 112-126.
10. Трапезников Н.Н., Аксель Е.М. Заболеваемость злокачественными новообразованиями и смертность от них населения стран СНГ в 1998 г. М., 2000.
11. Тупицын Н.Н., Кадагидзе З.Г., Блохина Н.Г. Экспрессия лейкоцитарных и родственных им антигенов на клетках рака молочной железы человека // Экспер. онкол. 1990. Т. 12, № 2. С. 54-58.
12. ВrooksP.C. Cell adhesion molecules in angiogenesis // Cancer Metastasis Rev. 1996. Vol. 15. P. 187-194.
13. Parkin D., Pisani P., Ferley J. Global cancer statistics // CA Cancer J. Clin., 1999. Vol. 49. P. 33-64.
14. Moller P., Mattfeldt T., Gross C. et al. Expression of HLA-A, -B, -C, -DR, -DP, -DQ, and of HLA-D-associated invariant chain (Ii) in non-neoplastic mammary epithelium, fibroadenoma, adenoma, and carcinoma of the breast // Am. J. Pathol. 1989. Vol. 135, № 1. P. 73-83.
Поступила 31.05.07
