CC BY
20
УДК 616.2-06:616.9-022.7-053.31-078.33
ОСОБЕННОСТИ ИММУННОГО СТАТУСА НОВОРОЖДЕННЫХ С РЕСПИРАТОРНОЙ ПАТОЛОГИЕЙ, ПЕРИНАТАЛЬНЫМ ПОРАЖЕНИЕМ ЦНС
И НЕЙТРОПЕНИЕЙ
© 2006 г. Е.А. Ефанова
We studied the particularity immune status of neonates who suffer from in respiratory pathology and perinatal central nervous system damage. The differences of immune status in newborns depending on the presence neutropenia have been defined.
Известно, что высокой восприимчивости новорожденных к инфекциям способствует пониженный уровень клеток-предшественниц миелоидного ряда и циркулирующих нейтрофилов [1]. Нейтропения -частая патология, встречающаяся у новорожденных, является основным фактором риска, приводящим к бактериальным осложнениям и смертности у новорожденных с сепсисом. Развитие нейтропении при респираторной патологии у новорожденных детей является плохим прогностическим признаком [2-4]. Факторами, предрасполагающими к развитию ней-тропении, являются низкое количество и пролифера-тивная способность гранулоцитарно-макрофагальных колониеобразующих единиц, истощение костномозговых резервов зрелых нейтрофилов и ускоренная утилизация нейтрофилов в ходе инфекционного процесса, которая часто наблюдается при тяжелой респираторной патологии и перинатальном поражении ЦНС [4].
Показатель количества нейтрофилов крови у таких новорожденных детей, очевидно, не единственный параметр, от которого зависит состояние защитных механизмов организма от инфекции. Так, в иммуно-грамме у детей с осложненным течением раннего периода адаптации по сравнению со здоровыми детьми обычно отмечается достоверное снижение относительного и абсолютного количества Т-лимфоцитов, СБ4+ хелперов-индукторов, СБ8+ цитотоксических Т-лимфоцитов, иммунорегуляторного индекса и достоверное уменьшение абсолютного содержания В-лимфоцитов, а также изменение уровней цитокинов, что неблагоприятным образом влияет на ход основного заболевания [5, 6].
Учитывая, что имеющаяся в научной литературе информация о динамике иммунного статуса у новорожденных детей при физиологическом и осложненном течении неонатального периода, в том числе о влиянии провоспалительных цитокинов на функциональные свойства неонатальных нейтрофилов и лимфоцитов недостаточна и не всегда однозначна [3, 4, 7-9], представляет интерес изучение состояния иммунной системы у новорожденных с нейтропенией, имеющих респираторную патологию и перинатальное поражение ЦНС, что и явилось целью настоящей работы.
Материалы и методы исследования
Для решения поставленных задач на базе реанимационного отделения Ростовского НИИ акушерства и педиатрии был проведен анализ показателей иммунной системы 56 новорожденных с респираторным дистресс-синдромом (РДС), родившихся в сроке гес-тации 39,1±1,1 недели, с массой тела 3500±250 г, с оценкой по Апгар 4,1±1,2 балла, поступивших в отделение реанимации без признаков инфицирования. Учитывая тяжесть состояния, обусловленную дыхательной недостаточностью (гипоксемия рО2<50, ги-перкапния рСО2>45, выраженный ацидоз (рН капиллярной крови < 7,25), все дети были переведены на ИВЛ в родильном зале и транспортированы в отделение реанимации, где им была назначена стандартная интенсивная терапия. Все пациенты поступили в отделение в первые 48 часов жизни в тяжелом и крайне тяжелом состоянии, с выраженными нарушениями деятельности дыхательной, сердечно-сосудистой, нервной системы, с глубокими метаболическими расстройствами.
Акушерский и материнский анамнез пациентов, вошедших в исследование, не выявил значительных различий. Наличие соматической патологии матерей пациентов, патологическое течение беременности и родов в значительной мере определили тяжесть состояния новорожденных. Так, у 56 % матерей пациентов до беременности отмечались различные заболевания (гипертоническая болезнь, ожирение, бронхиальная астма, нейроциркуляторная дистония, хронический пиелонефрит), что не могло не сказаться на патологическом течении беременности (90 %) и родов (46 %). В 58 % случаев беременность у женщин протекала на фоне сочетанной патологии. Наиболее часто течение беременности осложняли фетоплацентарная недостаточность, хроническая гипоксия плода и соче-танный гестоз.
Пациенты, вошедшие в исследование, были распределены на 2 группы: в первую (I) вошли новорожденные при поступлении с нейтропенией (п = 26), вторую группу (II) составили новорожденные группы контроля (п = 30), имевшие ту же патологию, но без нейтропении. Учитывая то обстоятельство, что возрастная норма абсолютного числа нейтрофилов у доношенных новорожденных в пределах 6-24x10 /л
клеток группа детей с нейтропенией имела в общем анализе крови менее 5х 10 /л клеток.
Субпопуляционный состав лимфоцитов крови оценивали при поступлении в отделение реанимации методом однопараметрического иммунофенотипиро-вания, используя реагенты фирмы IQProducts (Нидерланды), а также Beckman Coulter (США): фитц-меченные CD3, CD4, CD8, CD14, CD19, CD34, CD56, CD69, CD71, CD95, HLA-DR моноклональные антитела. Результаты учитывали на проточном цитометре Beckman Coulter Epics XL (США), используя стандартные протоколы. Выделение пула лейкоцитов из крови новорожденных производили с использованием лизирующего раствора «OptiLyse C» Beckman Coulter (США) по прилагаемому протоколу.
Уровень интерлейкинов плазмы (ИЛ) ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8 и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (ГКСФ) оценивали методом иммунофер-ментного анализа (ИФА), используя тест-системы фирмы Cytimmune Sciences Inc.(США) по прилагаемой к набору инструкции на многофункциональном программируемом счетчике для иммунологических исследований с компьютером и программным обеспечением - 1420 Multilabel Counter Victor (Финляндия). Уровень ИЛ-4, ИЛ-10, ФНО с использованием тест-систем Bender MedSystems GmbH (Австрия, Вена). Во избежание выброса цитокинов лейкоцитами крови ex vivo использовали специально разработанную методику забора материала [10, 11]. У новорожденных набирали 1 мл венозной крови в пробирку Vacutainer для получения плазмы с разделительным гелем и ЭД-ТА в качестве антикоагулянта (Becton Dickinson, США), центрифугировали 3 минуты при 5 000 об/мин при 4 °С и 100 мкл полученной плазмы использовали для анализа. Анализ результатов проводился автоматически с помощью программы "Viktor- Wallak».
Статистические методы
Результаты исследования оценивались методом вариационной статистики с использованием выборочного среднего, стандартного отклонения, средней квадратичной ошибки, доверительных интервалов, медианы и ошибки медианы. Достоверность различия отдельных выборок определялась с использованием непараметрического критерия Вилкинсона (W-критерий для несвязанных групп). Критическим уровнем значимости, ниже которого результаты исследования считались статистически значимыми, было принято значение á <0,05. Статистическая мощность исследования составила 80 %. Проведена оценка точности прогностического метода путем расчета его операционных характеристик. В исследовании использовались следующие пакеты прикладных программ: Excel-2000, «Мегастат», Statistica-6.
Результаты и обсуждение
Анализ полученных результатов средних значений показателей развернутой гемограммы пациентов обеих групп показал, что при поступлении статистически достоверное снижение лейкоцитов (наличие лейкопении) в развернутой гемограмме сочеталось со снижением абсолютного числа нейтрофилов, падением уровня гемоглобина и сниженным содержанием моноцитов. Кроме того, у пациентов контрольной группы отмечался сдвиг лейкоцитарной формулы до юных клеток. Различия по остальным показателям общего анализа крови между пациентами обеих групп статистически не были достоверны (табл.1).
Показатели общего анализа крови (ОАК) пациентов сравниваемых групп, достоверно отличающиеся между собой, представлены на рис.1. Хорошо видно, что лейкопения у детей первой группы обусловлена, главным образом, нейтропенией, хотя имеет место и умеренная моноцитопения.
Таблица 1
Сравнительный анализ некоторых показателей развернутой гемограммы при поступлении в отделение у новорожденных обеих групп
Показатель Нейтропения n=26 M±m Без нейтропении n=30 M±m Р
Гематокрит, % 0,41± 0,01 0,43±0,01 0,119351
Гемоглобин, г/л 143,35±2,54 149,7±3,09 0,049585
Эритроциты, х1012/л 4,35±0,09 4,51±0,10 0,105163
Лейкоциты, х109/л 6,07±0,33 11,72±0,93 0,016700
Эозинофилы, % 1,85±0,34 2,20±0,25 0,078521
Миелоциты, % 0,0±0,0 0,10±0,07 0,096298
Юные, % 0,19±0,08 1,00±0,24 0,001765
Палочкоядерные, % 9,81±0,76 11,40±1,34 0,450734
Сегменты, % 54,69±2,42 51,10±2,83 0,12469
Лимфоциты, % 25,35±1,64 25,67±2,3 0,386736
Моноциты, % 6,5±0,45 8,5±0,61 0,004973
Тромбоциты, х109/л 213,9±5,66 212,03±8,33 0,415357
АЧН, х109/л 4,39±0,36 7,81±0,75 0,000797
11,72
50
□ - с нейропатией
□ - контрольная
группа
Лейкоцитых10 /л АЧПх10 /л Моноциты, %
Рис.1 Величины некоторых показателей ОАК в обеих группах на 1-е сут
Результаты фенотипирования лейкоцитов методом проточной цитометрии показали, что у новорожденных с нейтропенией было достоверно повышено процентное содержание и абсолютное количество Т-цитотоксических лимфоцитов (СБ8), статистически достоверно понижено содержание B-лимфоцитов (CD19) и кроветворных стволовых клеток-предшественниц (CD34) (табл.2). Очевидно, что на момент поступления в отделение реанимации состояние иммунной системы новорожденных с РДС и развившейся нейтропенией характеризовалось некоторой компенсаторной активацией Т-лимфоцитарного звена с одной стороны, супрессией В-лимфоцитарного звена и истощением костно-мозговых резервов зрелых нейтрофилов - с другой. Вероятно, описанные изменения иммунного статуса лежали в основе патофизиологических механизмов наибольшей уязвимости этого контингента больных в плане развития тяжелых бактериальных осложнений.
На рис.2 представлена экпрессия CD рецепторов на лейкоцитах новорожденных при поступлении, числовые значения которых статистически достоверно отличались в сравниваемых группах.
Изучение содержания цитокинов крови у новорожденных с нейтропенией выявило статистически достоверное увеличение уровня провоспалительного ИЛ-8
(рис.3) является наиболее чувствительным и специфичным параметром развития системной воспалительной реакции. У детей этой группы отмечалось
Таблица 2.
Сравнительный анализ субпопуляционного состава лимфоцитов у новорожденных с нейтропенией и без нее, имевших респираторную патологию и перинатальное поражение ЦНС при поступлении.
Показатель, % Нейтропения n=26 М±т Без нейтропении n=30 М±т Р
CD 3 81,83± 2,13 80,95± 1,04 0,097137
CD 4 59,91± 2,27 56,74± 1,68 0,06959
CD 8 19,63±1,06 17,24± 0,65 0,0196
ИРИ 3,38± 0,3 3,30± 0,1 0,219642
CD 14 6,58± 0,72 7,1± 0,39 0,116616
CD 19 3,6± 0,39 6,08± 0,71 0,019186
CD 56 2,62 ±0,28 2,26± 0,25 0,142561
CD 34 0,16± 0,03 0,20± 0,05 0,00528
CD 69 0,78± 0,31 0,76± 0,14 0,136932
CD 71 2,96± 0,36 2,49± 0,25 0,194059
20.00
18 00
16 .00
14 00
12 .00
10 00
8 00
6 00
4 .00
2 00
0 00
А
Ш
□
□
с неиропатиеи
- контрольная группа
СД-8 СД-19 СД-34
Рис.2 Числовые значения некоторых СБ-маркеров у пациентов сравниваемых групп при поступлении, %
также снижение уровня ГКСФ. Это подтверждает утверждение, что одним из факторов, предрасполагающим к развитию нейтропении при РДС, является низкое количество и пролиферативная способность гранулоцитарно-макрофагальных колониеобразую-щих единиц не только вследствие истощения костномозговых резервов организма, но и в результате снижения синтеза эндогенного ГКСФ.
Следует отметить, что различие в уровне других цитокинов (ИЛ6, ИЛ4, ИЛ1Р и ФНОа) были статистически недостоверными .
Таким образом, наши исследования выявили различия иммунного статуса между новорожденными с тяжелой респираторной патологией и перинатальным поражением ЦНС в зависимости от наличия или отсутствия у них нейтропении. Представленные в работе результаты свидетельствуют, что нейтропения отягощает состояние таких пациентов, нуждающих в иммунокоррекции препаратами КГСФ, одним из критериев назначения которых является снижение уровня эндогенного ГКСФ у новорожденных.
Контроль
ГКОФ
Рис.3. Уровни некоторых интерлейкинов плазмы в сравниваемых группах на 1-е сут пг/ил
Литература
Вельтищев Ю. Е. // Рос. вестн. перинатол. и педиатр. 1997. Прил. С. 18.
Таболин В.А. и др. // Int. J. on Immunorehabilitation.
1999. № 11. C. 82-91.
Володин Н.Н. и др. // Int. J. on Immunorehabilitation.
2000. Vol.2. № 1. C. 175-185.
Дегтярева М.В. Функциональное состояние иммунной системы новорожденных детей при физиологическом и осложненном течении неона-тального периода: природа иммунной адаптации: Автореф. дис. ... д-ра. мед. наук- М., 2000. С.46. Шалина Р. И. // Пробл. беременности. 2000. № 2.
10.
11.
C. 34-40.
Bessler H. et al. // Biology of the Neonate. 1999. Vol. 75. № 4. P.225-233.
TaöoMUH B.A. u dp. // Int. J. on Immunorehabilitation. 1997. № 6. C. 112-122.
Bessler H. et al. // Clin. Exp. Immunol. 1987. Vol. 68. P. 655-661.
Bessler H. et al. // Clin. Exp. Immunol. 1993. Vol. 91. №2. P. 320-324.
Griffith D.E., Miller E., Gray L.D. // Amer. J. Resp. Cell, Molec. Biol. 1994. Vol.10. № 3. P.245-252. Redl H. et al. // Clin. Chem. 1992. Vol.38. № 5. P.764 -765.
Ростовский НИИ акушерства и педиатрии
10 октября 2005 г.
