CC BY
17УДК 542.973
О.В. Матвеева, Н.В. Лакина, В.Ю. Долуда, Э.М. Сульман
ОСОБЕННОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ ПЕРЕЭТЕРИФИКАЦИИ В СВЕРХКРИТИЧЕСКОМ ДИОКСИДЕ УГЛЕРОДА*
(Тверской государственный технический университет)
В статье приводится обзор применения различных видов липаз в среде сверхкритических растворителей для получения биотоплива и в реакции переэтерификации триглицеридов, этилацетата, этилбегената, бутилацетата, винилацетата, а также в реакции этерификации лауриновой кислоты, уксусной кислоты. Проанализировано влияние давления, температуры, концентрации фермента и субстрата в вышеуказанных процессах, проводимых в сверхкритических средах.
Матвеева Ольга Валентиновна -
аспирант кафедры биотехнологии и химии ТвГТУ. E-mail: olechkamatveeva@mail.ru
Лакина Наталия Валерьевна -
к.х.н., доц. кафедры биотехнологии и химии ТвГТУ. E-mail: lakina@yandex.ru
Датуда Валентин Юрьевич -
кх.н., доц. кафедры биотех-.
E-mail: doludav@yandex.ru
Сульман Эсфирь Михайловна -д.х.н., проф., директор Института нано- и биотехнологий ТвГТУ.
E-mail: sulman@online.tver.ru
Область научных интересов: катализ и биокатализ в процессах гидрирования и окисления органических субстратов Ключевые слова: липаза, переэтерификации, биодизель, сверхкритические среды
ВВЕДЕНИЕ
Одним из эффективных и экологически чистых способов получения биотоплива и ценных продуктов переэтерификации масел является применение липазокатализируемой реакции переэтерификации в сверхкритическом СО^. Как катализатор, обычно применяют алкоголяты щелочных металлов (метилат натрия, этилат натрия и др.), а также металлический натрий, сплав натрий-калий и др. Требуется среда инертного газа или под вакуумом при температуре 25-90 °С [1,2]. В настоящее время особенно актуальным стало применение ферментов в качестве катализаторов. Реакцию переэтерификации, как известно, способна катализировать липаза (КФ 3.1.1.3), которая является гидролитическим ферментом класса эстераз. Данный фермент содержит ионы кальция, которые являются необходимыми в гидролизе триглицеридов [3].
Сверхкритический СО2 является перспективной альтернативой обычных растворителей и обладает множеством полезных характеристик.
таких как нетоксичность, дешевизна, доступность в больших количествах. СО2 имеет умеренные критическую температуру и давление (31.1 °С и 7.38 Мпа) [4]. Схема механизма липазокатализируемой реакции переэтерификации [5] представлена на рис. 1.
O
Липаза
O
_ Ц R Липаза
С Rl ^^ /ч ,R2 + R1-0-
R SO R Л O R O
# R2
R2-O-
Рис. 1. Механизм липазокатализируемой реакции переэтерификации сложноэфирной связи Fig. 1. The mechanism of lipase-catalyzed transesterification of the ester bond
Реакция переэтерификации может быть описана следующим образом: карбонильный углерод сложного эфира подвергается нуклеофиль-ной атаке алкоксидного иона ди- и моноглицери-дов с образованием промежуточного метаста-бильного комплекса (рис. 1) и дальнейшим образованием конечного продукта.
* Обзорная статья
Влияние растворителя на процесс получения биодизеля с помощью реакции переэтерификации
Получению биодизеля и других ценных химических продуктов с помощью реакции этере-фикации, катализируемой ферментами, в присутствии определенного растворителя и без него посвящено достаточно много исследовательских работ (табл. 1). При проведении реакции переэтери-фикации без растворителя исключается токсичность и пожароопасность органических растворителей, отсутствует необходимая технологическая стадия испарения растворителя из конечного продукта реакции. В связи с этим, повышается технологичность и экономичность получения биодизеля и других ценных химических продуктов [6].
В работах [7,8] представлены данные об ингибирующем действии воды и глицерина, образующихся в ходе реакции переэтерификации, на активность липазы. В работе [9] предлагается применять мембранные реакторы для отвода образующихся продуктов.
Таблица 1
Влияние растворителя на выход продукта Table 1. Effect of solvent on the product yield
Применение липаз в сверхкритических растворителях
В статье [13] изучалась реакция переэтерификации между этилацетатом и этиленгликолем в присутствии липазы Ыоуо/ут 435. Исследования показали, что равновесная концентрация эти-ленгликоля достигается в течение 60 минут. Конверсия субстрата выше при проведении реакции в сверхкритическом СО: (65% в СО:. 60% без растворителя). Показано, что селективность реакции
переэтерификации также выше в сверхкритических условиях, однако, обнаружено ее уменьшение с увеличением времени реакции. Была выбрана оптимальная концентрация фермента.
Влияние давления СО2 на конверсию и селективность реакции было изучено в интервале 820 МПа. Конверсия этиленгликоля увеличивается при увеличении давления до 10 МПа, дальнейшее увеличение давления СО2 приводит к значительному снижению степени конверсии. Селективность реакции переэтерификации с образованием этиленгликолямоноацетата увеличивается и селективность реакции переэтерификации с образованием этиленгликолядиацетата уменьшается с увеличением давления. Повышение температуры сверхкритического диоксида углерода с 30 до 70 °С приводит к незначительному увеличению конверсии с 58% до 64-65%. При этом селективность процесса по этиленгликольацетату остается практически неизменной.
Описано [14] влияние концентрации фермента, температуры и давления СО2 на скорость реакции переэтерификации триолеина и этиленбе-гената в скС02 в присутствии иммобилизованной липазы Lipozym IM. Реакция проходит с образованием 1,3-дибегеноил-2-олеоилглицерола. Реакция достигала равновесия через 3 часа. В ходе экспериментального изучения влияния давления на гидролитическую и трансэтерификационную активность фермента было выявлено, что наибольшая активность липазы проявляется при Р=15 МПа. Полученные результаты представлены на рис. 2.
140 к Гидролитическ
I 120 §1 аяактивность
< 100 § so
I 60
I -g 20 s о -k
s
= 10 15 20 25 30
<
P, МПа
Рис. 2. Влияние давления сверхкритического диоксида углерода на активность липазы в процессе переэтерификации этиленбегенататриолином. (Температура реакции 50 время реакции 30 мин, начальные концентрации этилбехената и
триолина 5.65 мМ и 22.6 мМ) Fig. 2. The effect of pressure of the supercritical carbon dioxide in a lipase activity in the transesterification etilbehenatatriolinom.
C-reaction temperature, reaction time is 30 minutes, and the initial concentrations of ethylbehenate triolein are 5.65 mM and 22.6 mM)
При увеличении давления сверхкритического диоксида углерода с 10 до 30 МПа наблюдается максимум трансэтерифицирующей активно-
Вид липазы Субстрат Растворитель Выход, % Ссылка
Mucor miehei Сало, метанол Гексан 94.8 [10]
Mucor miehei Сало, метанол - 19.4 [10]
Candida antarctica Хлопковое масло, метанол - 92 [11]
Mucor miehei Сало, этанол Гексан 98 [10]
Mucor miehei Сало, этанол - 65.5 [10]
Thermomyces lanuginose (immobilized) Ресторанный жир, пропанол - 87 [12]
Thermomyces lanuginose, (immobilized) Ресторанный жир, бутанол - 90 [12]
Candida antarctica, (immobilized) Ресторанный жир, бутанол - 56 [12]
сти при давлении 15 МПа, в то время как максимум гидролитической активности наблюдается в диапазоне 20-25 МПа.
Исследование влияния концентрации фермента на скорость реакции переэтерификации триолеина и этилбегената в скС02 осуществлялось при оптимальной температуре реакции 50 °С, давлении 15 МПа. Она составила 2-3 % его водного раствора.
Yadu В. Tewari и др. [4] исследовали липа-зокатализируемую реакцию переэтерификации между бензиловым спиртом и бутилацетатом в присутствии липазы Novozyme 435, в среде сверхкритического СОг, гексана, толуола и без растворителя при Т=30 "С, Р=10 МПа. Равновесная концентрация достигается через 3 часа после начала реакции. Показано, что скорость реакции выше при проведении переэтерификации в сверхкритическом СОг, тогда как константа скорости реакции в среде сверхкритического диоксида углерода меньше на 30% по сравнению с константами, полученными в аналогичных условиях в среде толуола и гексана.
В статье [15] изучалась активность иммобилизованной липазы, выделенной из Pseudomonas серасеа в среде сверхкритического С02 и, для сравнения, в среде гексафторида серы (SF6), в реакции переэтерификации между фенилэтанолом и винилацетатом. Исследовалось влияние температуры и давления 6-25 МПа на активность фермента (табл. 2).
Таблица 2
Зависимость остаточной активности липазы от давления сверхкритического растворителя и его плотности
Table 2. The dependence of the residual lipase activity on the pressure of the supercritical solvent and its density
Примечания: *Условия проведения реакции - 50 °С, время осуществления процесса 6 ч
Note: * Reaction conditions: - 50 °С, the process time is 6 h
Определено, что плотность гексафторида серы в сверхкритических условиях изменяется более значительно, по сравнению с диоксидом углерода (табл.2) при изменении давления в системе, что, в свою очередь, может быть использовано для выбора более выгодных условий прове-
дения процесса переэтерификации. Также, необходимо отметить, что остаточная активность липазы составляет 84-87% как для проведения реакции в среде сверхкритического диоксида углерода, так и для гексафторида серы. Наибольшая активность фермента наблюдается при Р=15 МПа и
В работе [16] приведены результаты исследования липазокатализируемой реакции переэтерификации между лауриновой кислотой и 1-пропанолом в среде сверхкритического СОг и изооктана. Липаза была выделена из Candida antarctica и Mucor miehei и инкапсулирована в матрицу органогелей. Реакцию проводили при Т=35 °С, при Р=11, 15, 20, 75 МПа. Изучена зависимость скорости конверсии субстрата от давления. Показано, что при Р=11 МПа скорость конверсии наибольшая. Исследованы также зависимости начальных скоростей липазокатализируе-
мых реакций от концентраций субстратсостав-
-
пропанола. Полученные значения начальных скоростей реакции переэтерификации позволили определить оптимальное соотношение лауриновой кислоты и 1-пропанола как 103 мМ:53 мМ. Результаты показывают, что начальная скорость реакции этерификации выше при проведении реакции в сверхкритическом СОг, чем в среде изооктана.
В работе [17] изучалась возможность получения компонентов биодизеля с помощью реакции переэтерификации соевого масла и метанола в присутствии иммобилизованной липазы, полученной выделением из смеси Rhizopus oryzae+ Candida rugosa (ROL+CRL) в сверкритическом СОг. Была изучена зависимость степени конверсии от температуры, давления СОг, концентрации фермента и соотношения липаз, выделенных из Rhizopus oryzae и Candida rugosa. Определены оптимальные условия проведения реакции переэтерификации в сверкритическом С02: Т=45 °С, Р=13 МПа, концентрация иммобилизованных ферментов ROL+CRL (1:1) - 20%. Максимальная конверсия субстрата достигала 99% за 3 часа реакции переэтерификации при одновременной загрузке компонентов реакции и 99% — при постепенной загрузке компонентов реакции.
Как известно [17], концентрация воды является одним из наиважнейших факторов, определяющих активность липазы в среде сверхкритического диоксида углерода, поэтому в работе была исследована степень конверсии от содержания воды в реакционной смеси (рис. 3).
Из рисунка видно, что при концентрации воды 10 мае. % наблюдается наибольшая конверсия соевого масла 98%, при этом дальнейшее увеличение концентрации воды способствует инги-бированию активности липазы.
Давление, МПа PCKSF6, г/мл Остаточная активность, % PckCO2, г/мл Остаточная активность, %
4.5 0.843 87 - -
10 1.43 88 - -
15 1.553 88 0.786 89
20 - - 0.845 86
25 - - 0.883 84
100 90
SO
S 70
I 60
и
a. 50
О)
° 40
S 30 20 10
0 V
0 5 10 15 20 25
Содержание воды, вес %
Рис. 3. Влияние содержания воды на активность липазы ( Т= 45°С, Р (скС02) =130 атм, V(CKC02)=100 мл, количество соевого масла 100 ммоль, количество метанола 240 ммоль) Fig. 3. Effect of water content on the lipase activity (T= 45 °C, P (skSO2)= 130 Bar, V (skSO2) = 100 ml, soybean oil is 100 mmol, 240 mmol of methanol)
Изучение стабильности иммобилизованной липазы в реакции переэтерификации показало, что максимальное число рециклов 20 со степенью конверсии 85% при постепенной загрузке компонентов реакции и 13 рециклов — со степенью конверсии 80% при одновременной загрузке компонентов.
В статье [18] исследована липазокатализи-руемая реакция переэтерификации а-терпинеола и уксусного ангидрида в сверкритическом ССЬ в зависимости от вида липазы: выделенная из Candida rugosa type VII, Amano PS, Amano AP-6, Amano G и Lipozym RM IM. В работе отмечена наибольшая активность липазы, выделенной из Candida rugosa type VII. Авторами исследовано влияние температуры на выход терпинеолацетата. Максимальный выход продукта реакции терпинеолацетата 53% при Т=50 °С, Р=10 МПа, время реакции 1.5 ч.
В работе было также установлено, что оптимальное молярное соотношение компонентов реакции переэтерификации а-терпинеола и уксусного ангидрида равно 3.0, увеличение концентрации уксусного ангидрида приводило к ингибиро-ванию фермента в результате ацетилирования его поверхности.
Roseni D., Santos [19] изучали липазоката-лизируемый синтез поликапролактона в сверхкритическом С(Х В работе использовали иммобилизованную липазу Novozym 435. Наилучший результат в синтезе полимера был достигнут при давлении 14.5 МПа, температуре 65 "С, концентрация фермента 10 %.
В работе [20] исследовали реакцию переэтерификации кукурузного масла и метанола для получения метилового эфира жирной кислоты (МЭЖК) в сверхкритическом С02. Реакция про-
водилась в присутствии иммобилизованной липазы Novozym 435 на макропористой акриловой смоле с максимальным выходом МЭЖК 95 %. Оптимальные условия проведения такой реакции: Р=19.4 МПа, Т=63 "С.
Zeljko KnezH и др. [21] проводили реакцию этерификации молочной кислоты и бутанола в сверхкритическом СО2 (с гексаном и без гексана) в реакторе периодического действия. Для проведения реакции использовалась иммобилизованная липаза Novozym 435. Максимальная конверсия субстрата 99 % была достигнута через 26 ч при Р=40 МПа и Т=55 °С в среде С02/гексан. В среде сверхкритического СО2 максимальная конверсия молочной кислоты 75.7 % была получена при Т=55 °С и Р=30 МПа.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Липазы в качестве катализаторов применяются для ряда важных реакций переэтерификации. Большинство из этих реакций проводится в органических растворителях. При проведении таких реакций возникает необходимость удаления остаточного количества растворителя и повышается пожароопасность, что усложняет технологию процесса получения компонентов биотоплива и других ценных продуктов. Для решения данной проблемы в качестве растворителя предложен сверхкритический СО2, его использование также позволяет варьировать условия реакции и получать 100% конверсию субстрата, кроме того, фермент используется многократно. Это обусловливает актуальность исследований оптимальных условий для применения липаз в реакции переэтерификации растительных масел и спиртов, этерификации органических кислот в среде сверхкритического оксида углерода для получения компонентов биотоплива и других ценных продуктов химического синтеза.
ЛИТЕРАТУРА
1. Olsen T.,Kerton F., Marriott R., Grogan G.// Enzyme and Microbial Technology. 2006. 39. P. 621-625.
2. Blattner С., Zoumpanioti M., Kröner J., Schmeer G., Xenakis A., Kunz W. // J. Supercritical Fluids. 2006. V. 36. P. 182-193.
3. Carriere F.C., Withers-Martinez H., van Tilbeurgh A., Roussel C., Cambillau, Verger R. // Biochim Biophys Acta. 1998. P. 417-432.
4. Tewari Y.B., Ihara T., Phinney K.W., Mayhew M.P. // J.
Mol. Catalysis B: Enzymatic. 2004. V. 30. P 131-136.
5. Bisen P.S., Sanodiya B.S., Thakur G.S., Baghel R.K. //
Biotechnol Lett. 2010. V. 32. P. 1019-1030.
6. Fjerbaek L., Knud V., Norddahl C.B. // Biotechnology and Bioengineering. 2009. V. 102. N 5. P. 1298 - 1315.
7. Nelson L.A, Foglia A., Marman W.N. // J. Am Oil Chem.
Soc. 1996. N73. P. 1191-1195.
8. Hsu A., Jones K., Foglia T., Marmer W. // Biotechnol Appl Biochem. 2002. N 36. 181 - 186.
9. Shah S., Sharma S., Cupta M.N. // Indian J. Biochem. Biophys.. 2003. V. 40. P. 392-399.
10. Mittelbach M. // J. Am Oil Chem. Soc. 1990. V. 67. P. 53-58.
11. Antolin G., Tinaut F.V., Briceno Y., Castano V., Perez C., Ramirez A.I. // Bioresour Technol. 2002. V. 83. P. 111-114.
12. De B. K., Bhattacharya P. K., Dandhu C. // J Am Oil Chem Soc. 1999. V. 76. P. 451 -453.
13. Yasmin T., Jiang T., Han B., Zhang J., Ma X.// J. Mol. Catalysis B: Enzymatic. 2006. V. 41. N 1-2. P. 27-31.
14. Yoon S.-H., Miyawaki O., Park K.-H., Nakamura K // J. Ferment. Bioeng. 1996. V. 82. Issue 4. P. 334-340.
15. Celia E., Cernia E., Palocci C., Soro S., Tuning T.T. // J. Supercrit. Fluids. 2005. V. 33. Issue 2. P. 193-199.
16. Blattner C., Zoumpanioti M., Kröner J., Schmeer G., Xenakis A., Kunz W. // J.ournal Supercrit. l Fluids. 2006. V. 36. P. 182-193.
17. Lee J.H., Kim S.B., Kang S.W., Song Y.S., Park C., Han S.O., Kim S.W.// Bioresource Technology. 2011. V. 102. Issue 2. P. 2105-2108.
18. Liaw E.-T., Liu K.-J. // Bioresource Technology. 2010. V. 101. Issue 10. P. 3320-3324.
19. Santos R.D., Rosso S.R., de Oliveira C.D., Treichel H., DiLuccio M., Ferreira S.R.S., Oliveira J.V. // Biocatalysis and Agricultural Biotechnology. 2012. N. 1. P. 280-283.
20. Ciftci O.N., Temelli F. // Biomass and Bioenergy. 2013. N 54. P. 140 -146.
21. Knez Z., Kavcic S., Gubicza L., Belafi-Bako K., Nemeth G., Primozic M., Habulin M. / J. Supercrit. Fluids. 2012. V. 66. P. 192- 197.
