CC BY
33
ISSN 0321-3005 IZVESTIYA VUZOV. SEVERO-KAVKAZSKII REGION. NATURAL SCIENCE. 2016. No. 4
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ BIOLOGICAL SCIENCES
УДК 58.085 DOI 10.18522/0321-3005-2016-4-40-44
ОСОБЕННОСТИ ЕСТЕСТВЕННОГО ВОСПРОИЗВЕДЕНИЯ И РЕАЛИЗАЦИИ ПРОЦЕССОВ РЕГЕНЕРАЦИИ У ПОПУЛЯЦИЙ HEDYSARUM DAGHESTANICUM
© 2016 г. З.М. Алиева, Ш.М. Зубаирова, В.К. Мартемьянова, А.Г. Юсуфов
FEATURES OF NATURAL REPRODUCTION AND REGENERATION PROCESSES IN THE IMPLEMENTATION OF HEDYSARUM DAGHESTANICUM POPULATIONS
Z.M. Alieva, Sh.M. Zubairova, V.K. Martemyanova, A.G. Yusufov
Алиева Зарина Магомедрасуловна - кандидат биологических наук, доцент, кафедра физиологии растений и теории эволюции, биологический факультет, Дагестанский государственный университет, ул. М. Гаджиева, 43а, г. Махачкала, 367000, e-mail: zalieva@mail.ru
Зубаирова Шумайзат Магомедовна - кандидат биологических наук, младший научный сотрудник, лаборатория флоры и растительных ресурсов, Горный ботанический сад ДНЦ РАН, ул. М. Гаджиева, 45, г. Махачкала, 367000, e-mail: zubairova08@mail. ru
Мартемьянова Вера Кадировна - аспирант, кафедра физиологии растений и теории эволюции, биологический факультет, Дагестанский государственный университет, ул. М. Гаджиева, 43а, г. Махачкала, 367000
Юсуфов Абдулмалик Гасамутдинович - доктор биологических наук, профессор, кафедра физиологии растений и теории эволюции, биологический факультет, Дагестанский государственный университет, ул. М. Гаджиева, 43а, г. Махачкала, 367000
Zarina M. Alieva - Candidate of Biology, Associate Professor, Department of Plant Physiology and Evolutionary Theory, Faculty of Biology, Dagestan State University, M. Gadzhiev St., 43a, Makhachkala, 367000, Russia, e-mail: zalieva@mail.ru
Shumajzat M. Zubairova - Candidate of Biology, Junior Researcher, Laboratory of Flora and Plant Resources, Mountain Botanical Garden, Dagestan Scientific Centre, Russian Academy of Science, M. Gadjiev St., 45, Makhachkala, 367000, Russia, e-mail: zubairova08@mail.ru
Vera K. Martemyanova - Postgraduate, Department of Plant Physiology and Evolutionary Theory, Faculty of Biology, Dagestan State University, M. Gadzhiev St., 43a, Makhachkala, 367000, Russia
Abdulmalik G. Yusufov - Doctor of Biology, Professor, Department of Plant Physiology and Evolutionary Theory, Faculty of Biology, Dagestan State University, M. Gadzhiev St., 43a, Makhachkala, 367000, Russia
Приведены результаты полевых, лабораторных и биотехнологических методов, анализ семенного и вегетативного размножения копеечника дагестанского (Hedysarum daghestanicum Rupr. еx Boiss.) - узколокального эндемика Красных книг РФ и Дагестан. Для популяций характерны различия во всхожести семян в полевых (с использованием УНУ «Система экспериментальных баз, расположенных вдоль высотного градиента» ГорБС ДНЦ РАН) и лабораторных условиях, в регене-рационной активности эксплантов разных структур. Определены оптимальные возможности микроразмножения с использованием узловых эксплантов in vitro.
Ключевые слова: Hedysarum daghestanicum, семенное размножение, регенерационная активность, экспланты in vitro, морфогенез, семена, микроразмножение.
The results of field, laboratory and biotechnological methods of analysis, seed and vegetative propagation of Hedysarum daghestanicum Rupr. ex Boiss. - narrow local endemic Red data books of Russia and Dagestan. For populations of characteristic differences in seed germination in the field (using the UNA «System experimental bases located along an altitudinal gradient» Garbs, Dagestan scientific center, Russian Academy of Sciences) and the laboratory of regenerative activity of explants of different structures, the optimal possibilities of micropropagation using nodal explants in vitro.
Keywords: Hedysarum daghestanicum, seed reproduction, regeneration activity, eхplants in vitro, morphogenesis, seeds, microreproduction.
ISSN 0321-3005 IZVESTIYA VUZOV. SEVERO-KAVKAZSKII REGION.
Виды рода копеечник (Hedysarum L.) представляют интерес в связи с их ограниченным воспроизведением в природе, редкостью, особенностями химического состава, использованием в медицине, индикационной значимостью в редких ценозах [1-3]. Копеечник дагестанский (Hedysarum daghestanicum Rupr. еx Boiss.) - узколокальный эндемик Дагестана. Распространен прерывисто, встречается на известняковых склонах (от 500 до 1200 м н. у. м.) в пределах предгорного и внутрен-негорного Дагестана [4]. По имеющимся сведениям [5-7] и гербарным образцам (DAG, LENUD, LE, MHA, MW, MOSP, ERE, BAK, TBI), известны 15 местонахождений [8]. Вид внесен в Красные книги РФ (2008) и Дагестана (2009) [9, 10].
В местах поселения растения способствуют закреплению склонов и вступают в симбиоз с клубеньковыми азотфиксирующими бактериями. Растения декоративны: имеют массу ярких цветов, а после отцветания до заморозков остаются с серебристо-опушенными листьями.
В задачи исследования входит анализ популяций данного эндемика Дагестана с точки зрения семенного и вегетативного размножения. Поскольку сведения о размножении H. daghestanicum черенками ограниченны, а его семенное воспроизведение происходит плохо, интерес представляет выяснение возможности введения его в культуру in vitro и клонального микроразмножения. Такой подход уже используется для сохранения редких и ценных видов растений; некоторые виды хранятся в коллекциях ботанических садов именно в культуре in vitro [1, 11-14].
Методика
Работа выполнена с использованием полевых, лабораторных и биотехнологических методов.
Лабораторные анализы всхожести семян проводили как классическим способом (путем проращивания в чашках Петри на фильтровальной бумаге при комнатной температуре (21±2 °С)), так и посевом семян осенью и весной в грунт на глубину 0,5^1,0 см в 6-кратной повторности по 100 шт.
В опытах in vitro использовали стандартную методику [15]. У стерильных проростков из семян, обработанных поочередно 70%-м этанолом (1 мин) и 10%-й перекисью водорода (10 мин), изолировали узловые, листовые и корневые экспланты, которые культивировали на среде Мурасиге - Скуга (МС) с добавлением фитогормонов ИМК и БАП в условиях климатической камеры (SANYO MLR-352H, Japan, t - 21^23 °C, освещенность - 3000 лк). Состояние эксплантов оценивали по выживаемости (% жизнеспособных эксплантов от их общего числа
NATURAL SCIENCE. 2016. No. 4
в варианте), росту (% эксплантов, у которых отмечены процессы роста, от их общего числа в варианте), каллусообразованию (% эксплантов, у которых наблюдали каллусогенез, от их общего числа в варианте) и морфогенезу. Интенсивность роста эксплан-та и закладки каллуса оценивали по 3-балльной системе (0 — признак отсутствует; 1-3 - слабая, средняя и сильная выраженность признака), а морфогенеза - по количеству эксплантов, у которых наблюдали закладку корней, почек и побегов (в процентах от их общего числа в варианте), и по количеству образовавшихся корней, почек, побегов. Опыты проводили 2—3-кратно, каждый вариант включал 10^15 биологических повторностей.
Результаты
Семенное размножение H. daghestanicum происходит не каждый год. Всходы в природе были обнаружены только в благоприятные по увлажнению периоды вегетации. Прочная кожура и оболочка боба препятствуют проникновению влаги в семя. При этом семена сохраняют свою жизнеспособность в течение нескольких лет. Твердосемянность может быть нарушена температурными воздействиями.
В полевых условиях посев проводился на Цудахарской экспериментальной базе Горного ботанического сада ДНЦ РАН (1100 м н.у.м.) весной и осенью. Как и в лаборатории, всхожесть скарифицированных семян оказалась выше, чем нескарифицированных. Наибольшая всхожесть во всех вариантах отмечена для популяции Годобери в случае преодоления твердосемянности; самая низкая - для семян популяции Цудахар (табл. 1).
В лабораторных условиях проращивание семян (при температуре 18-20 °С) было произведено после 6 мес. хранения; 10 % скарифицированных семян начинали прорастать на третьи сутки; в течение 10 дней всхожесть достигла 75 %. Всхожесть нескарифицированных семян более растянута: за 20 дней она составила только 18 %. Наибольшие показатели отмечены для семян популяции Годобери, низкие - Цудахар (табл. 1).
Всхожесть семян копеечника различалась у растений разных популяций и в культуре in vitro. Так, у популяций Губден и Цудахар прорастало только 20 30, Чиркей - 78 % семян. В варианте с добавлением в среду ИМК и БАП этот показатель у семян растений популяции Дубки возрос до 92 %. На 10-е сут у всех проростков семян популяции Дубки на среде с БАП (0,5 мг/л) наблюдалось образование семядольных листьев, в варианте МС+БАП и ИМК они появлялись на седьмые сутки (табл. 2).
ISSN 0321-3005 IZVESTIYA VUZOV. SEVERO-KAVKAZSKII REGION.
NATURAL SCIENCE.
2016. No. 4
Всхожесть семян H. daghestanicum / H. daghestanicum seed germination
Таблица 1
Популяция В лаб. условиях, % В полевых условиях, %
Посев
осенний весенний
Скариф. Нескариф. Скариф. Нескариф. Скариф. Нескариф.
Цудахар 70 28 36 18 28 7
Годобери 75 35 48 32 38 30
Губден 68 27 45 26 35 24
Таблица 2
Влияние гормонального состава среды на прорастание семян H. daghestanicum разных популяций / Influence of hormonal composition of the medium in the seed germination of H. daghestanicum different populations
Вариант Популяция Прорастание, % Рост Морфогенез, %
% Балл Корни Почки Побеги
% Кол-во % Кол-во % Кол-во
1 Дубки 50 100 3±0 100 1,2±0,1 100 1±0 100 3,2±0,2
Губден 30 100 2,5±0,1 100 3,8±0,1 100 1±0 100 1,2±0,1
Цудахар 20 100 2,1±0,1 100 2,8±0,1 100 1±0 100 1,1±0,1
Чиркей 78 100 2,7±0,2 43 1±0 100 3,1±0,2 100 2,1±0,4
2 Дубки 92 100 3±0 100 3,5±0,2 100 1±0 100 4,2±0,3
Чиркей 67 100 2,2±0,2 100 1±0 100 1,5±0,2 100 1,2±0,5
3 Дубки 20 100 3±0 100 4,2±0,2 100 1±0 100 2,2±0,1
Чиркей 52 100 2,4±0,2 100 1±0 100 1,2±0,2 100 1,1±0,4
Примечание. Варианты культивирования: среда МС (1); МС+ ИМК + БАП (0,5:2,5 мг/л) (2); МС+ БАП (0,5 мг/л) (3).
В связи с низкой семенной продуктивностью и слабым вегетативным воспроизведением H. daghestanicum in vitro оценивали регенерационный потенциал эксплантов узлов, пластинок листа и корней проростков из стерильных семян на среде МС с ИМК и БАП (0,5: 2,5 мг/л). Опыты показали, что все экспланты в течение 4 недель проявляли высокую выживаемость (80^100 %). У всех эксплантов, за исключением корней, отмечен заметный рост. Каллус закладывался у всех узловых эксплантов и пластинок листа. Если последние
брали в опыт без черешка, то каллус формировался у всех эксплантов в различных участках по всей поверхности, у черешковых - у 85 % и только на базальной их части. У 80 % узловых эксплантов наблюдали рост пазушных почек и формирование из них от 4 до 11 побегов, несущих по 6^8 листьев, без закладки корней (табл. 3). На этой стадии (через 30^35 сут культивирования) побеги-регенеранты использовали для дальнейшего микрочеренкования, выделяя узловые экспланты; для пассирования (табл. 4).
Таблица 3
Жизнеспособность эксплантов зеленых побегов H. daghestanicum (популяция Дубки) в варианте МС + ИМК + БАП (0,5: 2,5 мг/л) / The viability of the explants green shoots H. daghestanicum (population Oaks)
in the MS + ISB + BAP (0.5: 2.5 mg/l)
Тип экспланта Выживаемость, % Рост Каллусогенез Морфогенез, %
% Балл % Балл Почки Листья
% Кол-во % Кол-во
А 100 100 3±0 100 2±0,2 80 9,7±0,2 80 7,2±0,3
Б 80 100 2,5±0,2 85 1±0,1 0 0 0 0
В 80 100 2,6±0,3 100 2±0,3 0 0 0 0
Г 100 0 0 0 0 0 0 0 0
Примечание. А - экспланты узлов; Б - экспланты пластинок листа с черешком; В - экспланты пластинок листа без черешка; Г - экспланты корней.
ISSN 0321-3005 IZVESTIYA VUZOV. SEVERO-KAVKAZSKII REGION. NATURAL SCIENCE. 2016. No. 4
Таблица 4
Состояние экплантов H. daghestanicum популяции Дубки при последовательном пассировании / Status of H. daghestanicum explants population Oaks sequential passaging
Пассаж Вариант Количество дней Выживаемость, % Рост Каллус Морфогенез, %
% Балл % Балл Кор эни Почки Побеги
% Кол-во % Кол-во % Кол-во
I 1 35 100 100 2,8±0,1 100 1,2±0,1 0 0 100 8,8±0,5 100 7,0±0,2
II 1 35 100 90 2,5±0,2 60 1,1±0,1 0 0 100 6,2±0,3 100 4,4±0,2
II 2 45 67 100 2,6±0,2 80 1,0±0,2 0 0 100 7,6±1,6 80 4,8±0,9
II 3 70 100 100 2,7±0,2 0 0 0 0 25 5,0±2,4 25 1,5±0,2
II 4 70 100 100 2,8±0,1 33 1,3±0,2 33 3±0,3 0 0 0 0
III 5 40 100 100 2,6±0,2 56 1,6±0,2 0 0 100 7,7±1,4 100 3,2±0,5
III 1 35 80 75 1,7±0,1 50 0,8±0,1 0 0 75 4,0±0,4 100 2,5±0,2
III 6 50 90 100 2,5±0,1 25 1,5±0,3 0 0 100 4,75±0,2 100 2,3±0,2
Примечание. Варианты: среда МС + БАП (0,5 и 2,5 мг/л) (1, 2); МС + ИМК (1 и 0,5 мг/л) (3, 4); МС + ИМК + БАП (0,5:2,5 мг/л) (5); МС + +ИМК + БАП (0,5:0,5 мг/л) (6).
У эксплантов побегов в варианте МС+БАП (0,5 мг/л) на 35-40-е сут культивирования при их пассировании обнаружены различия в росте, формировании каллуса и морфогенезе. При увеличении числа пассажей у узловых эксплантов побегов на 35-е сут культивирования отмечено снижение жизнеспособности, роста, каллусо- и морфогенеза, в то время как при первом пассировании эти показатели достигали 100 %. Так, в первом пассаже в среднем на каждый эксплант закладывалось 7^10 почек с последующим формированием 5^8 листьев на развивающихся из них побегах.
При втором пассировании высокой выживаемостью (100 %) характеризовались экспланты в вариантах МС+БАП (0,5 мг/л), МС+ИМК (1 и 0,5 мг/л), тогда как в варианте с повышенным содержанием БАП (2,5 мг/л) наблюдали ее снижение (67 %). Самые высокие показатели закладки каллуса у экс-плантов (80 %) наблюдали в варианте МС+БАП (2,5 мг/л), низкие - МС+ИМК (0,5 мг/л). Увеличение концентрации ИМК в два раза полностью ин-гибировало каллусогенез.
Заключение
В природе семена копеечника дагестанского после осыпания не прорастают ввиду вынужденного покоя. Повышению их всхожести в лабораторных условиях способствуют меры по преодолению твердосемянности. Поэтому всхожесть нескарифи-цированных семян в полевых и лабораторных условиях остается невысокой у разных популяций. У популяций Цудахар и Губден она варьирует в диапазоне 20-40 %. В условиях in vitro более высокая всхожесть семян отмечена у популяций Дубки (50 %) и Чиркей (78 %). При этом в большинстве случаев она повышалась на гормональной питательной среде. Культивированием разных типов
эксплантов выявлена в целом высокая регенераци-онная активность, что позволяет использовать их при клональном микроразмножении H. Daghestanicum.
Материалы сообщения свидетельствуют о наличии у популяций как общих особенностей, обусловленных единством их происхождения, так и специфических, связанных с условиями обитания. Природа последних еще нуждается в изучении в связи с анализом процессов роста и морфогенеза в типичных условиях обитания. Это способствовало бы познанию их роли в приспособлении популяций, вопроса, еще мало изученного для растений.
Литература
1. Генофонд растений Красной книги Российской Федерации, сохраняемый в коллекциях ботанических садов и дендрариев / отв. ред. А.С. Демидов. М., 2012. 220 с.
2. Ильина В.Н. О биоэкологических особенностях копеечника крупноцветкового (Hedysarum grandi-florum Pall., Fabaceae) в Самарской области // Самарский науч. вестн. 2013. № 4. С. 78-80.
3. Супрун Н.А. Онтогенез и структура популяций Hedysarum cretaceum Fisch. на территории Волгоградской области // Вестн. Удмуртского ун-та. 2013. № 6-1. С. 33-39.
4. Муртазалиев Р.А. Конспект флоры Дагестана. Т. II : Euphorbiaceae - Dipsacaceae / отв. ред. Р.В. Камелин. Махачкала, 2009. 248 с.
5. Гроссгейм А.А. Флора Кавказа. Т. 5. М.; Л. 1952. 454 с.
6. Галушко А.И. Флора Северного Кавказа. Определитель. Ростов н/Д., 1980. Т. 2. С. 280.
7. Литвинская С.А., Муртазалиев Р.А. Кавказский элемент во флоре российского Кавказа: география, соозология, экология. Краснодар, 2009. 439 с.
ISSN 0321-3005 IZVESTIYA VUZOV. SEVERO-KAVKAZSKII REGION. NATURAL SCIENCE. 2016. No. 4
8. Зубаирова Ш.М., Анатов Д.М. Изменчивость морфологических признаков в ценопопуляциях Hedysarum daghestanicum Rupr. ex Boiss // Изв. Самарского науч. центра РАН. 2012. Т. 14, № 1(7). С. 1735-1737.
9. Красная книга РФ (Растения) / сост. Р.В. Камелин [и др.] М., 2008. 850 с.
10. Красная книга Республики Дагестан. Ч. 1. : Растения / сост. Р.А. Муртазалиев, А.А. Теймуров. Махачкала, 2009. 552 с.
11. Вечернина Н.А. Методы биотехнологии в селекции, размножении и сохранении генофонда растений. Барнаул, 2004. 265 с.
12. Новикова Т.И., Набиева А.Ю., Полубоярова Т.В. Сохранение редких растений в коллекции in vitro Центрального Сибирского ботанического сада // Вестн. ВОГиС. 2008. Т. 12, № 4. С. 564 —571.
13. Sivanesan Y., Lim M.Y., Jeong B.R. Micropropagation and greenhouse cultivation of Scrophularia take-simensis Nakai, a rare endemic medicinal plant // Pak. J. Bot. 2012. Vol. 44, № 5. P. 1657 — 1662.
14. Akin B., Kocacaliskan I., Guleryuz G. Micropro-pogation of Erodium sibthorpianum subsp. sibthorpianum, an endemic threatened species of Uludag Mountain (Bursa-Turkey) // Turkish J. of Botany. 2014. № 38. P. 148—155.
15. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры изолированных тканей в физиологии и биохимии растений. Киев, 1980. 489 с.
References
1. Genofond rastenii Krasnoi knigi Rossiiskoi Federatsii, sokhranyaemyi v kollektsiyakh botanicheskikh sadov i dendrariev [The gene pool of the plant Red Book of the Russian Federation, stored in the collections of botanical gardens and arboreta]. Ed. A.S. Demidov. Moscow, 2012, 220 p.
2. Il'ina V.N. O bioekologicheskikh osobennostyakh kopeechnika krupnotsvetkovogo (Hedysarum grandi-florum Pall., Fabaceae) v Samarskoi oblasti [About Hedysarum grandiflorum (Hedysarum grandi-florum Pall., Fabaceae) bioecological features in the Samara Region]. Samarskii nauch. vestn. 2013, no. 4, pp. 78-80.
3. Suprun N.A. Ontogenez i struktura populyatsii Hedysarum cretaceum Fisch. na territorii Volgogradskoi oblasti [The Hedysarum cretaceum Fisch. ontogeny and population structure in the Volgograd Region]. Vestn. Udmurtskogo un-ta. 2013, no. 6-1, pp. 33-39.
4. Murtazaliev R.A. Konspektflory Dagestana. T. II: Euphorbiaceae - Dipsacaceae [Synopsis of the flora of
Поступила в редакцию /Received
Dagestan. T. II: Euphorbiaceae - Dipsacaceae]. Ed. R.V. Kamelin. Makhachkala, 2009, 248 p.
5. Grossgeim A.A. Flora Kavkaza [Flora of the Caucasus]. Moscow; Leningrad, 1952, vol. 5, 454 p.
6. Galushko A.I. Flora Severnogo Kavkaza. Oprede-litel' [Flora of the North Caucasus. Determinant]. Rostov-on-Don, 1980, vol. 2, p. 280.
7. Litvinskaya S.A., Murtazaliev R.A. Kavkazskii element vo flore rossiiskogo Kavkaza: geografiya, sozolo-giya, ekologiya [Caucasian element in the flora of the Russian Caucasus: geography, sozology, ecology]. Krasnodar, 2009, 439 p.
8. Zubairova Sh.M., Anatov D.M. Izmenchivost' morfologicheskikh priznakov v tsenopopulyatsiyakh Hedysarum daghestanicum Rupr. ex Boiss [Variability of morphological traits in Hedysarum daghestanicum Rupr. ex Boiss populations]. Izv. Samarskogo nauch. tsentra RAN. 2012, vol. 14, no. 1(7), pp. 1735-1737.
9. Krasnaya kniga RF (Rasteniya) [The Red Book of the Russian Federation (Plants)]. Comp. R.V. Kamelin et al. Moscow, 2008, 850 p.
10. Krasnaya kniga Respubliki Dagestan. Ch. 1. : Rasteniya [Red Data Book of the Republic of Dagestan. Part 1: Plants]. Comp. R.A. Murtazaliev, A.A. Teimurov. Makhachkala, 2009, 552 p.
11. Vechernina N.A. Metody biotekhnologii v selektsii, razmnozhenii i sokhranenii genofonda rastenii [The methods of biotechnology in selection, breeding and conservation of the gene pool of plants]. Barnaul, 2004, 265 p.
12. Novikova T.I., Nabieva A.Yu., Poluboyarova T.V. Sokhranenie redkikh rastenii v kollektsii in vitro Tsentral'nogo Sibirskogo botanicheskogo sada [Conservation of rare plants in in vitro collections of the Central Siberian Botanical Garden]. Vestn. VOGiS. 2008, vol. 12, no. 4, pp. 564-571.
13. Sivanesan Y., Lim M.Y., Jeong B.R. Micropropagation and greenhouse cultivation of Scrophularia takesimensis Nakai, a rare endemic medicinal plant. Pak. J. Bot. 2012, vol. 44, no. 5, pp. 1657-1662.
14. Akin B., Kocacaliskan I., Guleryuz G. Micropro-pogation of Erodium sibthorpianum subsp. sibthorpianum, an endemic threatened species of Uludag Mountain (Bursa-Turkey). Turkish J. of Botany. 2014, no. 38, pp. 148-155.
15. Kalinin F.L., Sarnatskaya V.V., Polishchuk V.E.
Metody kul'tury izolirovannykh tkanei v fiziologii i biokhimii rastenii [Methods of isolated tissues culture in plant physiology and biochemistry]. Kyiv, 1980, 489 p.
5 июля 2016 г. / July 5, 2016
