CC BY
21© Коллектив авторов, 2014 УДК 618.145-091.8
ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ РЕЦЕПТОРОВ ПОЛОВЫХ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ ПРИ НАРУЖНОМ ГЕНИТАЛЬНОМ ЭНДОМЕТРИОЗЕ
В.М. Денисова, М.И. Ярмолинская, доктор медицинских наук, В.О. Полякова, доктор биологических наук, В.В. Рулев, кандидат медицинских наук, А.О. Дурнова, кандидат биологических наук
НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН, Российская Федерация, 199034, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3 E-mail: [email protected]
Введение. В патогенезе наружного генитального эндометриоза (НГЭ) важное место отводится изменениям рецепторов стероидных гормонов. Данные литературы об эстрогеновыхрецепторах-а (ERa) при этом заболевании противоречивы.
Целью исследования явилось определение экспрессии ERa и прогестероновыхрецепторов (PR) в эндометриоидных гетерото-пиях и эутопическом эндометрии больных НГЭ.
Методы исследования. Обследование включало лапароскопию и гистероскопию, во время которых у больных эндометриозом иссекали эндометриоидные гетеротопии и выполняли биопсию эндометрия; у здоровых женщин проводили биопсию эндометрия для последующего гистологического и иммуногистохимического исследований.
Результаты. Основную группу составили 36 женщин с эндометриозом, контрольную — 12 здоровых женщин. Показано достоверное снижение экспрессии ERa и PR в эндометриоидных гетеротопиях по сравнению с показателями в эндометрии здоровых женщин.
Заключение. Снижение экспрессии ERa и PR в эндометриоидных гетеротопиях и эутопическом эндометрии женщин с НГЭ может служить механизмом резистентности заболевания к гормональным методам терапии и развития рецидивов.
Ключевые слова: эстрогеновые рецепторы-а, прогестероновые рецепторы, эндометриоз, иммуногистохимия
FEATURES OF EXPRESSION OF SEX STEROID HORMONES RECEPTORS IN PELVIC ENDOMETRIOSIS V.M. Denisova, M.I. Yarmolinskaya, V.O. Polyakova, V.V. Rulev, A.O. Durnova
D.O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, Mendeleevskaya Line, 3, Saint-Petersburg, Russian Federation, 199034
Introduction. Changes of steroid hormone receptors take an important place in the pathogenesis of endoemtriosis. Literature data about estrogen receptor-alpha (ERa) in this disease is contradictory.
The aim of our study was to determine the expression of ERa and progesterone receptors (PR) in endometrioid lesions and eutopic endometrium of women with endometriosis.
Methods. The examination included laparoscopy and hysteroscopy, during which endometrioid heterotopias were excised and endometrial biopsy was performed in women with endometriosis and endometrial biopsy was performed in healthy women for the following histological and immunohistochemical study.
Results. The main group in the study included 36 women with endometriosis, control group included 12 healthy women. The expression of ERa and PR were shown to be appreciably reduced in endometrioid heterotopias versus this characteristics in endometrium of healthy women.
Conclusion. the decreased expression of ERa and PR in endometrioid lesions and eutopic endometrium of women with endometriosis may serve as the mechanism of the resistance of the diseases to hormonal treatment and the recurrence of the disease.
Key words: estrogen receptors-a, progesterone receptors, endometriosis, immunohistochemical study
ВВЕДЕНИЕ
Наружный генитальный эндометриоз (НГЭ) является эстрогензависимым заболеванием. Важное место в патогенезе эндометриоза отводится изменениям рецепторов стероидных гормонов в эндометриоидных гетеротопиях и эутопическом эндометрии. Так, по мнению ряда авторов [1—4], эндометриоидные гетеротопии отличаются от окружающего эндометрия не только по морфологии, но и экспрессии эстрогеновых (ЕЯ), прогестероновых (РЯ) рецепторов и андрогеновых рецепторов. При оценке рецепторов
стероидных гормонов в эндометриоидных гетерото-пиях было показано, что изменения соотношения ЕЯ и РЯ в течение менструального цикла соответствуют изменениям в эндометрии здоровых женщин [5]. В литературе описаны 2 подтипа ЕЯ — а и в — белков с высокой аффинностью к эстрадиолу, которые кодируются разными генами. Классический ЕЯа у человека был идентифицирован в 1986 г., а эстроге-новый рецептор ЕЯр обнаружен в предстательной железе крысы и яичках человека в 1996 г. [2]. Хотя оба вида рецепторов присутствуют в эндометрии, ЕЯа
Молекулярная медицина
29
считается главным медиатором действия эстрогенов в этой ткани. ЕЯа имеют более высокую аффинность к эстрогенам и являются доминирующей формой рецепторов в нормальном эндометрии. В связи с тем, что наибольшее количество матричной РНК (мРНК) ЕЯр было обнаружено в яичниках и гранулезных клетках, предполагается, что ЕЯр играют роль преимущественно в процессе овуляции [6].
Изучению ЕЯ посвящено довольно много работ, однако данные о роли ЕЯа при эндометриозе противоречивы и немногочисленны. Описаны генетические полиморфизмы ЕЯр, которые приводят к повышенному риску развития эндометриоза [3, 7], а также мутации ЕЯа, способствующие развитию аденомиоза [6]. В некоторых исследованиях показано увеличение соотношения ЕЯр/ЕЯа [8], в других отмечено пониженное соотношение ЕЯа/ЕЯр [9], что может способствовать усилению воспалительного ответа окружающих тканей при эндометриозе. По одним данным, уровень ЕЯа в эндометриоидных гетерото-пиях повышен [10], по результатам другого исследования экспрессия этих рецепторов понижена [11]. РЯ человека имеет 2 изоформы: А, которая способна ин-гибировать активацию ЕЯ, и В, способную активировать ЕЯ [12]. В ряде исследований [2, 13] показана пониженная экспрессия РЯ в эндометриоидных гете-ротопиях и эндометрии больных НГЭ по сравнению с показателем в эндометрии здоровых женщин.
Таким образом, изучение экспрессии ЕЯа и РЯ при эндометриозе представляет несомненный интерес, так как уточнение молекулярных особенностей позволит расширить представление о патогенезе самого заболевания и его рецидивов, а также о причинах резистентности к ряду терапевтических воздействий.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Для исследования экспрессии ЕЯа у 36 женщин с НГЭ проведено иммуногистохимическое (ИГХ) исследование эндометриоидных гетеротопий и эндометрия. Больные были в возрасте от 24 до 38 лет (средний возраст — 30,8±0,6 года). Согласно пересмотренной классификации Американского общества фертильности (R-AFS), НГЭ I степени был выявлен у 4 (11,1%) больных, II степени — у 28 (77,8%), III степени — у 4 (11,1%) пациенток. Диагноз во всех случаях подтвержден во время лапароскопии, а также результатами гистологического исследования. Контрольную группу составили 12 женщин репродуктивного возраста, у которых при лапароскопическом исследовании не было выявлено гинекологической патологии. Женщины контрольной группы были в возрасте от 25 лет до 38 лет (в среднем — 30,1 + 1,1 года).
Во время лапароскопии, которая проводилась с 19-го по 23-й день менструального цикла, больным НГЭ выполняли иссечение эндометриоидных ге-теротопий и биопсию эндометрия, в контрольной группе — биопсию эндометрия. Оценка экспрессии
ERa и PR в эндометриоидных гетеротопиях, эндометрии больных НГЭ и эндометрии здоровых женщин проводилась с помощью ИГХ-исследования. Образцы гетеротопий и эндометрия фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине (рН 7,2), обезвоживали с помощью автоматической станции проводки материала Leica TP1020 и заливали в парафин. Для морфологического изучения срезы окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике. Затем для ИГХ-исследования парафиновые срезы толщиной 4—6 мкм помещали на предметные стекла, покрытые пленкой из поли-L-лизина (Sigma). Использовали первичные моно-клональные антитела к ERa, Clone 1D5 и PR, Clone PgR 636. В качестве 2 антител использовали антитела, конъюгированные с полимером, маркированным пероксидазой (универсальный набор Эдванс DAKO EnVision™+System). Визуализацию окраски проводили с помощью комплекса Liquid DAB+, состоящего из хромогена (диаминобензидин) и субстратного буфера. Для оценки результатов ИГХ-окрашивания выполняли морфометрическое исследование с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из микроскопа Nikon Eclipse E400, цифровой камеры Nikon DXM1200, персонального компьютера на базе Intel Pentium 4 и программного обеспечения Videotest Morphology 5.2. В каждом случае анализировали 5 полей зрения при увеличении ><400. Относительную площадь экспрессии рассчитывали как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными ядрами, к общей площади клеток в поле зрения и выражали в %. Оптическую плотность экспрессии выявленных продуктов измеряли в относительных единицах.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием методов параметрической и непараметрической статистики. Обработку материала выполняли на персональном компьютере с помощью статистических средств программы Microsoft Office Excel 2003, стандартного пакета программ прикладного статистического анализа (Statistica for Windows v. 10.0). Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы (об отсутствии значимых различий или факторных влияний) принимали равным 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При гистологическом исследовании полученных образцов эндометрия в основной и контрольной группах выявлено, что они соответствуют средней секреторной фазе менструального цикла.
Определено достоверное снижение экспрессии ERa и PR как в эндометриоидных гетеротопиях (рис. 1), так и в эутопическом эндометрии (рис. 2) у больных НГЭ (по сравнению с эндометрием здоровых женщин) (рис. 3). Кроме того, в ряде образцов экспрессия ERa в эндометриоидных гетеротопиях и в эутопическом эндометрии больных эндометриозом отсутствовала. Минимальная относительная площадь
экспрессии ЕЯа наблюдалась в эндометриоидных ге-теротопиях (значения находились в пределах от 0 до 3,8%) и в среднем составляла 0,7+0,2%, что было достоверно (р=0,0005) ниже, чем в контрольной группе (от 0 до 12,3%, в среднем 4,9+1,5%). В эндометрии больных НГЭ относительная площадь экспрессии ЕЯа также была резко понижена и варьировала от 0 до 8,1% (в среднем 0,9+0,3%), что достоверно (р=0,0002) отличалось от показателя в контрольной группе.
Относительная площадь экспрессии РЯ была минимальной в эндометриоидных гетеротопиях (варьировала от 0,02 до 16,7%); в среднем — 4,8+0,9%), что достоверно (р=0,009) ниже, чем у здоровых женщин (от 2,1 до 30,6%; в среднем — 10,2+2,2%). В эутопи-ческом эндометрии больных НГЭ относительная площадь экспрессии РЯ была также понижена (колебалась от 0 до 47,2%; в среднем 8,6+1,7%), однако отличия недостоверны.
При изучении оптической плотности ЕЯа и РЯ в эндометриоидных гетеротопиях, эутопическом эндометрии больных НГЭ и эндометрии здоровых женщин не выявлено статистически значимых отличий. Эти данные позволяют сделать вывод, что для исследования экспрессии рецепторов стероидных гормонов оптическая плотность экспрессии не является информативным показателем.
В литературе описаны изменения соотношения ЕЯа/ЕЯр в эндометрии и эндометриоидных гетеро-топиях. Так, Q. Хие и соавт. [11] показали, что уровень мРНК ЕЯа был значительно ниже (примерно в 34 раза) в эндометриоидных стромальных клетках, чем в эндометриальных [11]. Одним из возможных механизмов, объясняющих изменение соотношения изформ эстрогеновых рецепторов при эндометрио-зе, может быть патологическое гипометилирование промотора гена ЕЯр, что приводит к повышению его активности и последующему подавлению экспрессии ЕЯа [2]. В исследовании предположено [2], что следствием увеличения соотношения ЕЯр/ЕЯа в эндоме-триоидных гетеротопиях может являться изменение воздействия эстрадиола на эндометрий и эндометри-оидные гетеротопии, а именно ингибирование экспрессии РЯ. Эти данные согласуются с результатами других исследователей, которые выявили значительное увеличение соотношения ЕЯр/ЕЯа в эндомет-риоидных гетеротопиях, что, по мнению авторов, подавляет экспрессию рецепторов прогестерона [8]. В одной из работ обнаружены относительное повышение уровня экспрессии ЕЯр в строме и эпителии эндометриоидных гетеротопий, а также снижение уровня экспрессии в эпителии РЯ, что, в свою очередь, приводит к функциональной прогестероноре-зистентности в очаге эндометриоза [14].
При описании функциональных взаимодействий 2 изоформ ЕЯ Е. ТгикЬаеИеуа и соавт. [8] сообщают, что высокий уровень ЕЯр подавляет экспрессию ЕЯа в ответ на воздействие эстрадиола в стромальных клетках эндометриоидной ткани, а также что ЕЯр регулируют клеточный цикл и могут усиливать проли-
ферацию эндометриоидных клеток. Авторы данного исследования предполагают, что нарушенная экспрессия рецепторов половых стероидных гормонов при эндометриозе может приводить к недостаточной функции яичников и таким образом влиять на фер-тильность. Схожие результаты продемонстрированы М. КагНа и соавт. [15]: показана более высокая экспрессия генов РЯ-А и ЕЯа в гранулезных клетках пациенток с эндометриозом по сравнению с таковой у пациентов с трубным фактором бесплодия, что, в свою очередь, может быть ведущей причиной нарушения функции яичников при эндометриозе. М. МеИаББеЪ и соавт. [4] полагают, что обнаруженная ими повышенная экспрессия ЕЯр и пониженная — РЯ связана с развитием и (или) прогрессированием аденомиоза; кроме того, следствием измененной экспрессии рецепторов половых стероидных гормонов является недостаточная эффективность прогестаге-нов при лечении данного заболевания.
На модели животных продемонстрирована эффективность препаратов, влияющих на ЕЯр, для уменьшения площади эндометриоидных гетеротопий
Ь0
и -
и ■ *
: г* -и V''.;--' 1' ' I
Л*
? о - - • '«я?*
Рис. 1. Экспрессия ЕВа (а) и РВ (б) в эндометриоидных гетеротопиях (ИГХ, х400)
Рис. 2. Экспрессия ЕВа (а) и РВ (б) в эутопическом эндометрии больных НГЭ (ИГХ, х400)
Рис. 3. Экспрессия ЕВа (а) и РВ (б) в эндометрии женщины контрольной группы (ИГХ, х400)
Молекулярная медицина №5, 2014
31
[16]. Терапевтический потенциал различных селективных агонистов или антагонистов ERp может стать основой весьма многообещающего направления терапии эндометриоза [16]. Недавно F. Minutolo и соавт.
[17] опубликовали современный обзор лигандов ER для клинического применения. По их мнению, препараты из группы новых селективных стероидных и нестероидных агонистов ERp обладают остаточными лиганд-связывающими свойствами ERa, что ограничивает их применение в практической деятельности. S. Bulun и соавт. предложили применять селективные антагонисты ERp для терапии болевого синдрома при эндометриозе [18].
Известно, что PR, взаимодействуя с семейством провоспалительных факторов транскрипции, способствуют противовоспалительной активности прогестерона [19]. В неизмененном эндометрии прогестерон индуцирует секрецию паракринных факторов, которые стимулируют в эпителиальных клетках эндометрия экспрессию фермента 17р- ги-дроксистероиддегидрогеназы (17P-HSD) 2-го типа. В эндометриодной гетеротопии прогестерон не способен индуцировать экспрессию 17P-HSD 2-го типа в эпителиальных клетках вследствие дефекта клеток стромы, что приводит к изменению метаболизма эстрадиола при эндометриозе и повышению локаль-
ной концентрации этого митогена [20]. Прогесте-ронорезистентность может нарушать экспрессию индуцируемых прогестероном белков, необходимых для имплантации и рецептивности эндометрия, а также негативно влиять на функцию яичников и маточных труб и быть причиной бесплодия, ассоциированного с эндометриозом.
ВЫВОДЫ
У больных эндометриозом достоверно понижена экспрессия ERa и PR в эндометриоидных гетерото-пиях и эутопическом эндометрии в среднюю секреторную фазу менструального цикла по сравнению с эндометрием здоровых женщин. Пониженная экспрессия рецепторов стероидных гормонов в эндо-метриоидных гетеротопиях и эутопическом эндометрии больных НГЭ может служить патогенетическим механизмом резистентности данного заболевания к гормональным методам терапии и развития рецидивов. Прогестеронорезистентность принято считать одной из причин нарушения фертильности при эн-дометриозе и рецидивирующего характера заболевания. Кроме того, изменения соотношения ERa/ERß при эндометриозе могут являться перспективной мишенью для новых терапевтических методов лечения заболевания.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Пальцев М.А., Кветной И.М. Руководство по нейроиммуноэндокринологии. М.: Издательство «Медицина»; 2008. [Paltsev M.A., Kvetnoy I.M. Guide on neuroimmunoendocrinology. M.: Publishing house «Medicine»; 2008 (in Russian)]
2. Bulun S.E., Cheng Y.H., Pavone M.E., Xue Q., Attar E., Trukhacheva E., Tokunaga H., Utsunomiya H., Yin P., Luo X., Lin Z., Imir G., Thung S., Su E.J., Kim J.J. Estrogen Receptor-р, Estrogen Receptor-a, and Progesterone Resistance in Endometriosis. Semin. Reprod. Med. 2010; 28 (1): 36-43.
3. Christofolini D.M., Vilarino F.L., Mafra
F.A., André G.M., Bianco B., Barbosa C.P. Combination of polymorphisms in luteinizing hormone p, estrogen receptor p and progesterone receptor and susceptibility to infertility and endometriosis. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 2011; 158 (2): 260-4.
4. Mehasseb M.K., Panchal R., Taylor A.H., Brown L., Bell S.C., Habiba M. Estrogen and progesterone receptor isoform distribution through the menstrual cycle in uteri with and without adenomyosis. Fertil. Steril. 2011; 95 (7): 2228-35.
5. Leyendecker G., Herbertz M., Kunz G., Mall
G. Endometriosis results from the dislocation of basal endometrium. Hum. Reprod. 2002; 17 (10): 2725-36.
6. Oehler M.K., Greschik H., Fischer D.C., Tong X., Schuele R., Kieback D.G. Functional characterization of somatic point mutations of the human estrogen receptor a (hERa) in adenomyosis uteri. Mol. Hum. Reprod. 2004; 10 (12): 853-60.
7. Silva R.C., Costa I.R., Bordin B.M., Silva C.T., Souza S.R., Júnior C.L., Frare A.B., Moura
K.K. Rsal polymorphism of the ERp gene in women with endometriosis. Genet. Mol. Res. 201122; 10 (1): 465-70.
8. Trukhacheva E., Lin Z., Reierstad S., Cheng Y.H., Milad M., Bulun S.E. Estrogen Receptor (ER) p Regulates ERa Expression in Stromal Cells Derived from Ovarian Endometriosis. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2009; 94 (2): 615-22.
9. Pan Q., Luo X., Toloubeydokhti T., Cheginl N. The expression profile of micro-RNA in endometrium and endometriosis and the influence of ovarian steroids on their expression. Mol. Hum. Reprod. 2007; 13 (11): 797-806.
10. Lessey B.A., Palomino W.A., Apparao K.B., Young S.L., Lininger R.A. Estrogen receptor-alpha (ER-alpha) and defects in uterine receptivity in women. Reprod. Biol. Endocrinol. 2006; 4 Suppl 1: S9.
11. Xue Q., Lin Z., Cheng Y.H., Huang C.C., Marsh E., Yin P., Milad M.P., Confino E., Reierstad S., Innes J., Bulun S.E. Promoter methylation regulates estrogen receptor 2 in human endometrium and endometrio-sis. Biol. Reprod. 2007; 77 (4): 681-7.
12. Costa I.R., Silva R.C., Frare A.B., Silva C.T., Bordin B.M., Souza S.R., Ribeiro Júnior C.L., Moura K.K. Polymorphism of the progesterone receptor gene associated with endometriosis in patients from Goiás, Brazil. Genet. Mol. Res. 2011; 6; 10 (3): 1364-70.
13. Bukulmez O., Hardy D.B., Carr B.R., Word R.A., Mendelson C.R. Inflammatory Status Influences Aromatase and Steroid Receptor Expression in Endometriosis. Endocrinology. 2008; 149 (3): 1190-204.
14. Samartzis N., Samartzis E.P., Noske A., Fedier
A., Dedes K.J., Caduff R., Fink D., Imesch P. Expression of the G protein-coupled estrogen receptor (GPER) in endometriosis: a tissue microarray study. Reprod. Biol. Endocrinol. 2012; 20; 10: 30.
15. Karita M., Yamashita Y., Hayashi A., Yoshida Y., Hayashi M., Yamamoto H., Tanabe A., Terai Y., Ohmichi M. Does advanced-stage endometriosis affect the gene expression of estrogen and progesterone receptors in granulosa cells. Fertil. Steril. 2011; 1; 95 (3): 889-94.
16. Harris H.A. Preclinical characterization of selective estrogen receptor beta agonists: new insights into their therapeutical potential. Ernst. Schering. Found. Symp. Proc. 2006; 1: 149-61.
17. Minutolo F., Bertini S., Granchi C., Marchi-tiello T., Prota G., Rapposelli S., Tuccinardl T., Martinelli A., Gunther J.R., Carlson K.E., Katzenellenbogen J.A., Macchia M. Structural evolutions of salicylaldoximes as selective agonists for estrogen receptor beta. J. Med. Chem. 2009; 12; 52 (3): 858-67.
18. Bulun S.E., Monsavis D., Pavone M.E., Dyson M., Xue Q., Attar E., Tokunaga H., Su E.J. Role of estrogen receptor-p in endometriosis. Semin. Reprod. Med. 2012; 30 (1): 39-45.
19. Giudice L.C., Evers J.L.H., Healy D.L. Endometriosis: Science and Practice. Wiley-Blackwell; 2012.
20. Bulun S.E., Cheng Y.H., Pavone M.E., Yin P., Imir G., Utsunomiya H., Thung S., Xue Q., Marsh E.E., Tokunaga H., Ishikawa H., Kurita T., Su E.J. 17Beta-hydroxysteroid dehydro-genase-2 deficiency and progesterone resistance inendometriosis. Semin. Reprod. Med. 2010; 28 (1): 44-50.
Поступила 15 декабря 2013 г.
