CC BY
60
УДК: 616-001.8-097.3-091.818:591.39
ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ПРОЛИФЕРАЦИИ И АПОПТОЗА КОМПОНЕНТАМИ ГЕМАТО-ЭНЦЕФАЛИЧЕСКОГО БАРЬЕРА ПРИ ПЕРИНАТАЛЬНОМ ГИПОКСИЧЕСКОМ ПОВРЕЖДЕНИИ
Харьковский национальный медицинский университет
Г.И. ГУБИНА-ВАКУЛИК Е.В. КИХТЕНКО Р.В. СИДОРЕНКО
Представлены результаты иммуногистохимического исследования уровня экспрессии каспазы-3 и К-67 в клеточных элементах гематоэнцефа-лического барьера головного мозга крысят первого месяца жизни после перенесенного перинатального гипоксического воздействия. Установлена динамика интенсивности клеточной гибели и пролиферации в различные периоды гипоксически-ишемической энцефалопатии в эксперименте.
e-mail: kihtenko@ukr.net
Ключевые слова: перинатальная гипоксия, апоптоз, пролиферация, каспаза-3, КІ-67.
Клинические последствия перинатальных поражений центральной нервной системы (ЦНС) являются темой острых дискуссий педиатров, неонатологов и неврологов на протяжении многих десятилетий. Недооценить роль перинатальных поражений ЦНС в формировании детской патологии сложно: в структуре детской инвалидности поражения нервной системы составляют около 50%, при этом 70-80% случаев приходится на перинатальные поражения [1, 5].
Наиболее частой причиной перинатальных повреждений ЦНС являются гипоксически-ишемические поражения мозга — 47% [3], последствия которых занимают ведущее место в структуре заболеваемости и смертности у детей неонатального периода и раннего возраста [2, 13]. К моменту рождения головной мозг ребенка является незрелым, особенно большие полушария [10]. Наиболее высокие компенсаторные возможности имеет именно незрелый мозг, находящийся в стадии бурного развития. Главным повреждающим фактором у этой категории детей является гипоксия [1-4], которая может быть следствием как гипоксемии, так и ишемии мозга и является главным фактором, предрасполагающим к развитию гипоксически-ишемической энцефалопатии (ГИЭ) [11, 13].
Исходя из нозологического принципа гипоксические состояния плода и новорожденного классифицируют следующим образом: 1) острая асфиксия в результате острого прекращения маточно-плацентраного или плацентарно-плодового кровообращения; 2) хроническая внутриутробная гипоксия как проявление фетопатии вследствие заболеваний сердечно-сосудистой, дыхательной и кроветворной систем беременной; эндокринных заболеваний беременной; интоксикаций (профессиональных, лекарственных); патологии беременности (эклампсия); хронической плацентарной недостаточности и недостаточности пуповины; инфекционных заболеваний плода; пороков развития плода.
Смертность новорожденных при перинатальном поражении ЦНС гипоксической природы составляет 11,5% (среди детей с умеренными церебральными нарушениями — 2,5%, тяжелыми — 50%). У детей с легким течением гипоксически-ишемической энцефалопатии в неонатальном периоде осложнений не возникает [8]. По данным Ment L.R. и соавт. [14], у 80% доношенных новорожденных тяжелые гипоксически-ишемические поражения ЦНС приводят к смерти или тяжелым неврологическим нарушениям.
Основные аспекты функционирования ЦНС невозможно понять без учета современных представлений про гемато-энцефалический барьер (ГЭБ). Этот механизм эволюционно создан для обеспечения автономности мозга. Морфологическая организация ГЭБ охватывает несколько уровней клеточных систем. Первый - двухмембранный слой эндотелиоцитов, второй - базальная мембрана с перицитами, третий - астроцитарная «муфта» из атростков астроцитов, которые окутывают 85-90% поверхности церебральной капиллярной сети [7]. Морфологические закономерности различных перинатальных гипоксических поражений мозга на настоящий момент изучены недостаточно. Материалы по патоморфологическим особенностям перинатального гипоксического поражения ГЭБ скудны и несистематизированы. Данных с использованием современных иммуногистохимических методов нет.
Цель исследования. На основании данных уровня экспрессии маркера апоптоза - каспазы-3 и маркера пролиферации - Ю-67 изучить морфологические закономерности клеточной гибели и регенерации компонентов гемато-энцефалического барьера при различных типах перинатальной гипоксии (острой постнатальной и хронической внутриутробной) в эксперименте.
Материалы и методы исследования. Экспериментальное исследование проведено на крысятах трех групп: 1 - крысята самок с физиологически протекающей беременностью, подвергшиеся острой постнатальной асфиксии (группа ОПнА); 2 - крысята самок с артериальной гипертензией,
выношенные в условиях хронической внутриутробной гипоксии (ХВУГ), подвергшиеся острой пост-натальной асфиксии (группа ХВУГ+ОПнА); 3 - крысята контрольной группы (группа К).
Для моделирования хронической внутриутробной гипоксии из контингента крыс популяции «черный капюшон» вивария Харьковского национального медицинского университета путем ежедневного в течение 2-х недель измерения уровня артериального давления на центральной хвостовой артерии отобрали і5 самок в возрасте 4-5 месяцев со стабильно повышенным давлением. 5 животных выведено из эксперимента и при патоморфологическом исследовании их внутренних органов в головном мозге, сердце и почках обнаружены изменения, характерные для артериальной гипертензии (гиалиноз мелких артерий, гиперплазия мышечного слоя артерий мышечного типа, эластофиброз артерий мышечно-эластического типа, мелкоочаговый кардиосклероз, склероз и гиалиноз гломерул и т.д.).
Для моделирования острой постнатальной асфиксии крысята групп ОПнА и ХВУГ+ОПнА сразу после рождения подвергались воздействию «высокогорной» гипоксии в течение 15 мин. Для этого крысята помещались в специальную герметичную камеру, из которой выкачивался воздух, и создавались условия резкого уменьшения атмосферного давления и содержания кислорода (аналогично 11
000 м над уровнем моря) .
Для выяснения динамики морфологических изменений при течении гипоксически-ишемической энцефалопатии крысята всех групп выводились из эксперимента в следующие сроки:
1 - через сутки после рождения (период острых изменений ГИЭ); 2 - на 14-е сутки жизни (период ранних восстановительных изменений ГИЭ); 3 - на 35-е сутки постнатального онтогенеза (период восстановительных изменений ГИЭ).
После выведения животных из эксперимента для морфологического исследования брался участок головного мозга, а именно правая и левая зоны глиального паравентрикулрного матрикса (ЗГПВМ), расположенные латеральнее 3-го желудочка, где во внутриутробном и раннем поста-натальном периодах проходят процессы дифференцировки глиоцитов. Эта зона является очень чувствительной к повреждающему гипоксическому воздействию [і2]. Срезы толщиной 3-5 мкм наносили на адгезивные предметные стекла SuperFrost Plus и депарафинировали согласно принятым протоколам.
В иммуногистохимическом исследовании для оценки процессов апоптоза и пролиферации использовали антитела к каспазе-з (клон CPP32, LabVision) и Ю-б7 (Ab-4, LabVision). Визуализация осуществлялась пероксидазным методом. Количественные и качественные показатели экспрессии маркеров изучали как минимум на 8-10 случайно избранных полях зрения микроскопа при увеличении x200, Х400 и хіООО.
С помощью программ Olympus DP-Soft и Microsoft-Exel на микроскопе Olympus BX-41 подсчитывали среднее абсолютное количество антиген - позитивных клеток на ограниченной площади -360 хіо-12 м2 при увеличении в 400 раз, а также определяли оптическую плотность антиген-позитивных структур с использованием метода цитофотометрии. При этом следует отметить, что при оценке уровня экспрессии маркеров как апоптоза, так и пролиферации, согласно современным канонам [6, 9], наличие до 3-5 позитивных клеток в поле зрения считается нормой и оценивается как негативная реакция (в дальнейшем в таблицах при изложении цифровых данных используется знак «-»).
Результаты исследования. Цифровые данные о среднем содержании клеток с активной каспазой-3 и положительных к маркеру апоптоза Ki-67 приведены в таблице 1. Данные об оптической плотности цитоплазмы клеток, экспрессирующих каспазу-3, и оптической плотности ядер клеток, позитивных к Ki-67 приведены в табл. 2.
Таблица 1
Среднее количество клеток позитивных к каспазе-3 и к Ki-67 на ограниченной площади
(З60 х10-12 м2 при увеличении в 400 раз) (в экз.)
Длительность постнатального онтогенеза (в сут.) Исследуемая группа
К ОПнА ХВУГ+ОПнА
1 каспаза-3 Ю-б7 каспаза-3 Ю-б7 каспаза-3 Ю-б7
15,7±0,3 12,3±0,4 27,7±0,9 27,4±0,7* 62,3±2,7* ** 97,7±3,3* ** a
14 _ А _ А і6,9±04* 25,2±0,6* 33,2±1,1* A 44,0±1,3* a
35 - - - - 17,і±0,2* ** і6,6±0,4* **
Примечание:
* - разница двух средних достоверна при сравнении с группой К;
** - разница двух средних достоверна при сравнении группы ХВУГ+ОПнА с группой ОПнА;
А - разница двух средних достоверна в соседние сроки длительности постнатального онтогенеза.
Таблица 2
Оптическая плотность цитоплазмы клеток, позитивных к еа8ра8а-э, и оптическая плотность ядер клеток, позитивных к К1-67 в условных единицах (усл. ед.)
Длительность постнатального онтогенеза (в сут.) Исследуемая группа
К ОПнА ХВУГ+ОПнА
каспаза-3 Ki-67 каспаза-3 Ki-67 каспаза-3 Ki-67
1 0,149± 0,233± 0,250± 0,354± 0,4б7± 0,573±
0,004 0,003 0,012 0,005 0,023* ** 0,022* **
14 _ А _ А 0,144± 0,337± 0,277± 0,432±
0,006* 0,005* 0,012* а 0,017*
35 - - - _ А 0,15б± 0,242±
0,007* ** 0,002* ** А
Примечание:
* - разница двух средних достоверна при сравнении с группой К;
** - разница двух средних достоверна при сравнении группы ХВУГ+ОПнА с группой ОПнА;
А - разница двух средних достоверна в соседние сроки длительности постнатального онтогенеза.
Животные контрольной группы. Учитывая данные таблиц 1 и 2 можно констатировать, что в первые сутки постнатального онтогенеза у животных контрольной группы регистрируется низкая экспрессия каспазы-3, что, вероятнее всего является следствием перенесенного родового стресса. В эти же сроки обнаруживается незначительное повышение пролиферативной активности всех глио-цитов и эпендимоцитов. На 14-е и 35-е сутки жизни клеточные элементы ГЭБ у животных данной группы не экспрессируют маркеры апоптоза и пролиферации.
Группа ОПнА (животные, выношенные в условиях физиологически протекающей беременности и подвергшиеся воздействию постнатальной гипоксии). У животных, выведенных из эксперимента через сутки после рождения, уровень экспрессии каспазы-3 можно охарактеризовать как умеренный.
К 14-м суткам постнатального онтогенеза процессы апоптотической гибели снижают свою интенсивность, однако все же еще продолжают регистрироваться. К 35-м суткам постнатального онтогенеза у животных данной группы, судя по данным иммногистохимического исследования с маркером каспазы-3, процессы интенсивной клеточной гибели путем апоптоза прекращаются.
При оценке выраженности пролиферации установлено, что через сутки после смоделированной высокогорной гипоксии среднее число пролиферирующих клеток на ограниченной площади составляет (27,4±0,7), оптическая плотность их ядер - (0,354±0,005) усл. ед. в среднем (табл. 1, 2). При этом пролиферируют преимущественно эндотелиоциты и единичные глиоциты (рис. 1). К 14-м суткам эксперимента цифровые данные, характеризующие выраженность клеточной пролиферации, достоверно не изменяются. Однако меняется качественный состав пролиферирующих клеток: пролиферируют преимущественно глиальные клетки, эндотелиоциты - в меньшей степени. Также среди Ki-67-позитивных клеток имеются единичные эпендимоциты (рис. 2). К 35-м суткам эксперимента показатели клеточной пролиферативной активности резко снижаются(табл. 1, 2).
w * ' ' ■ а. ‘
Рис. 1. Крысенок группы ОПнА выведенный из эксперимента в 1-е сутки после рождения. Отмечается экспрессия протеина пролиферации К1-67 преимущественно эндотелиоцитами капилляров
и единичными глиоцитами. Увеличение х 400
>
1 . * • •
. . " - /
•
.» : * Л* , ' • - ■ ' ••
•. • • 1V, .
‘ • • ". ■ . ... ф ‘
. * ; - ■ '. . ..
Л *: и --Г У > • . /
Рис. 2. Крысенок группы ОПнА выведенный из эксперимента на 14-е сутки после рождения. Экспрессия протеина пролиферации К1-67. Пролиферируют преимущественно клетки глии, эпендимоциты и, в меньшей степени, эндотелиоциты капилляров. Увеличение х 200
Группа ХВУГ+ОПнА (животные, выношенные в условиях хронической внутриутробной гипоксии и подвергшиеся воздействию постнатальной гипоксии). Исследование уровня экспрессии маркера апоптоза каспазы-3 показало, что наиболее высок он у животных через сутки после рождения. Экспрессируют каспазу все типы глиоцитов и нейроциты. К 14-м суткам эксперимента процессы апоптотической гибели несколько снижают свою интенсивность, их можно охарактеризовать как умеренно выраженные. У животных, выведенных из эксперимента на 35-е сутки постнатального онтогенеза, процессы клеточной гибели путем апоптоза продолжают регистрироваться на низком уровне (табл. 1, 2).
При оценке выраженности пролиферативных процессов у животных данной исследуемой группы, выведенных из эксперимента через сутки после рождения, можно констатировать, что степень пролиферации очень высок: среднее количество К1-б7-позитивных клеток - (97,7±3,3) экз., средняя оптическая плотность их ядер - (0,573±0,022) усл. ед. Что касается характеристики клеточного состава пролиферирующего пула, то можно констатировать, что пролиферируют буквально все имеющиеся в исследуемой зоне клетки: эндотелиоциты, глиоциты, эпендимоциты и в отдалении нейроны (рис. 3).
Рис. 3. Крысенок группы ХВУГ+ОПнГ выведенный из эксперимента в 1-е сутки после рождения.
Высокая экспрессия Ю-67. Пролиферируют все клеточные пулы зоны глиального паравентрикулярного матрикса. Увеличение х 400
К 14-м суткам интенсивность пролиферации снижается и характеризуется как умеренно выраженная (табл. 1, 2). В эти сроки пролиферируют клетки глии и эндотелиальной капиллярной выстилки (рис. 4).
Рис. 4. Крысенок группы ХВУГ+ОПнА выведенный из эксперимента на 14-е сутки после рождения.
Экспрессия Ki-67 глиоцитами и эндотелиоцитами. Выраженный цитотоксический отек. Увеличение х 1000
На 35-е сутки экспериментального исследования показатели пролиферативной клеточной активности резко снижаются.
Обсуждение полученных результатов. Животные контрольной группы в качестве показателей реализации родового стресса сразу после рождения имеют незначительно повышенные показатели апоптотической гибели и пролиферативной активности клеток, формирующих ГЭБ [7].
Животные группы ОПнА вследствие сочетанного воздействия родового стресса и постнаталь-ной гипоксии имеют умеренную степень апоптотических процессов и пролиферации через сутки после рождения. Экспрессируют каспазу глиоциты, пролиферируют эндотелиоциты. К 14-м суткам эксперимента, уровень экспрессии каспазы-3 резко снижается и к 35-м суткам признаки клеточной гибели путем апоптоза фактически исчезают. К 14-м суткам эксперимента цифровые показатели пролиферации достоверно не изменяются, но при этом кардинально меняется клеточный состав пролиферирующих клеток - пролиферировать преимущественно начинают глиальные клетки и клетки эпендимы желудочков. Такое изменение качественного состава пролиферирующих клеток отражает закономерности регенераторных процессов и свидетельствует о том, что эндотелий первый отвечает на повреждающее воздействие смоделированной высокогорной гипоксии.
Уровень экспрессии каспазы-3 как глиоцитами, так и нейроцитами, у животных группы ХВУГ+ОПнА в первые сутки эксперимента наиболее высок, в эти же сроки регистрируются наиболее высокие показатели пролиферативной клеточной активности, что обусловлено в первую очередь воздействием хронической внутриутробной гипоксии, во вторую - смоделированной высокогорной гипоксией. В незрелой зоне глиального паравентрикулярного матрикса интенсивно продолжаются процессы пролиферации и дифференцировки различных пулов глиальных и эпендимарных клеток. К 14-м суткам эксперимента показатели апоптоза и пролиферации снижаются до умеренных цифр. К 35-м суткам экспериментального исследования пролиферативная активность глиальных и эндотелиальных клеток снижается до показателей, которые можно охарактеризовать как невысокие, но все же не свидетельствующие об окончании регенераторных процессов после повреждающего сочетанного гипоксического воздействия.
Выводы:
1. Родовой стресс реализуется незначительным увеличением интенсивности апоптотических и пролиферативных процессов в первые сутки постнатального онтогенеза.
2. Смоделированная высокогорная асфиксия (ОПнА) приводит к умеренному повышению уровня процессов апоптоза и пролиферативной активности клеточных элементов ГЭБ. Причем первым на повреждающее воздействие гипоксии реагирует эндотелий.
3. Наиболее тяжелые повреждения клеточных элементов ГЭБ регистрируются при сочетанном воздействии хронической внутриутробной гипоксии и острой постнатальной смоделированной асфиксии. При этом процессы регенерации эндотелиоцитов и глиоцитов еще не заканчиваются даже к 35-м суткам эксперимента, что отражает морфологические закономерности течения восстановительного периода ГИЭ у животных, подвергшихся гипоксическому воздействию как во внутриутробном периоде, так и в раннем постнатальном.
Литература
1. Волосовец А.П. Последствия перинатальных поражений центральной нервной системы: дискуссионные вопросы / А.П. Волосовец, С.П. Кривопустов, И.А. Логинова, М.А. Шакотько // Неонатология. 2008. -№ 4(13). - С. 17-23.
2. Головченко О.В. Особенности гемодинамики головного мозга у новорожденных с отрой и хронической гипоксией / О.В. Головченко, И.С. Лукьянова, О.М. Дзюба, Г.Ф. Медведенко // Перинатология и педиатрия. - 2003. - № 1. - С. 8 - 11.
3. бвтушенко С.К., Шестова О.П., Морозова Т.М. Ппоксичт ушкодження головного мозку у новонароджених. — К.: 1нтермед, 2003. — 101 с.
4. Знаменськая Т.К. Место тромбогеморрагического синдрома среди причин перинатальной смертности / Т.К. Знаменськая, Т.Д. Задорожная, А.О. Закревський и соавт. // Перинатология и педиатрия. - 2003. - № 3. -С. 19 - 20.
5. Клименко Т.М. Status marmoratus и лейкомаляция мозга у новорожденных: особенности течения и перспективы терапии / Т.М. Клименко, С.В. Водяницкая, Г.А. Королева и др. // Планета здоровья. - 2005. - Т. 6, № 3. - С. 23 - 27.
6. Колобов В.В. Влияние антител к глутамату на активность каспазы-3 в структурах головного мозга крыс с экспериментальной болезнью Альцгеймера / В.В. Колобов, И.А. Захарова, В.Г. Фомина, В.Ю. Горбатов, Т.В. Давыдова / / Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. - №10. - С. 417 - 420.
7. Личко В.С. Гемато-энцефалический барьер и современные возможности управления им в эксперименте / В.С. Личко, В.О. Малахов // Украинский неврологический журнал. - 2012. - №4. - С. 33-38.
8. Макарова Е.А Перивентрикулярная лейкомаляция: факторы риска и прогноз / Е.А Макарова, В.Ю. Здвижкова, В.Ю. Мартынюк / / Современная педиатрия. - 2007. - № 1(14). - С. 195-197.
9. Меныпанов П.Н. Эффекты дексаметазона на развитие неонатальных крысят и уровень активной кас-пазы-3 в коре мозга / П.Н. Меныпанов, В.В. Музыка, Н.Н. Дыгало // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. - № 4. - С. 467 - 469.
10. Мощич П.С., Сулима О.Г. Неонатология: учебное пособие. Киев: Вища школа, 2004. - 407 с.
11. Фризе К., Кахель В. Инфекционные заболевания беременных и новорожденных: Пер. с нем. М.: Медицина, 2003. - 422 с.
12. Шабалов Н.П. Неонатология: учебное пособие: В 2 т.: 4-е изд., испр. и доп.: Т. 1. М.: МЕДпресс-информ, 2006. - 608 с.
13. Шабалов Н.П. Неонатология: Учебное пособие: В 2 т.: 4-е изд., испр. и доп.: Т. 2. М.: МЕДпресс-информ, 2006. - 656 с.
14. Ment L.R. Practice parameter: Neuroimaging of the neonate: Report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology and the Practice Committee of the Child Neurology Society / L.R. Ment, H.S. Ba-da, P. Barnes at al. // Neurology. - 2002, June 25. - № 58(12). - Р. 1726 - 1738.
PECULIARITIES OF EXPRESSION OF PROLIFERATIVE AND APOPTOTIC MOLECULAR-BIOLOGICAL MARKERS IN COMPONENTS OF BLOOD-BRAIN BARRIER WITH THE PERINATAL HYPOXIC DAMAGE
G.I. GUBINA-VAKULIK E.V. KIHTENKO R.V. SIDORENKO
Pathological Anatomy Department of Kharkiv National Medical University
e-mail: kihtenko@ukr.net
The cellular elements of the blood-brain barrier in the one month old rats after perinatal hypoxia were investigated using antibodies to caspase-3 and to Ki-67 (markers of cellular apoptosis and proliferation). It was found the dynamics of apoptosis and proliferation intensity in the cellular elements of the blood-brain barrier due to hypoxic-ischemic encephalopathy in the experiment.
Keywords: perinatal hypoxia, apoptosis, proliferation,
caspase-3, Ki-67.
