CC BY
25
ВНУТРЕННИЕ БОЛЕЗНИ
УДК 616.12-07:616.127-004
ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ ФАКТОРОВ РОСТА ФИБРОБЛАСТОВ (FGF-2 И IGF-P1) В СТЕНКЕ БРЮШНОЙ АОРТЫ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ МОДЕЛИРОВАНИИ РАЗЛИЧНЫХ ВАРИАНТОВ ХРОНИЧЕСКОГО СТРЕССА
В.Р.Вебер, М.П.Рубанова, С.В.Жмайлова, П.М.Губская, М.Н.Копина, Е.Е.Румянцев, И.ААтаев
EXPRESSION PATTERNS OF FIBROBLAST GROWTH FACTORS (FGF-2 AND TGF-P1) IN THE ABDOMINAL AORTIC WALL IN EXPERIMENTAL MODELING OF DIFFERENT CHRONIC STRESS VARIANTS
V.R.Veber, M.P.Rubanova, S.V.Zhmailova, P.M.Gubskaia, M.N.Kopina, E.E.Rumiantsev, I.A.Ataev
Институт медицинского образования НовГУ, [email protected]
Статья посвящена изучению особенностей экспрессии основного фактора роста фибробластов (FGF-2) и трансформирующего фактора роста фибробластов (TGF-pi) в различных слоях стенки брюшной аорты крыс линии Вистар при экспериментальном моделировании трех вариантов хронического стресса. Показано, что наиболее выраженные изменения выработки факторов роста фибробластов, как FGF-2, так и TGF-pi, при всех трех вариантах стресса происходят в эндотелиальном слое. Показатель отношения FGF-2/TGF-pi в эндотелии при хроническом адренергическом стрессе снижается, а при хроническом холинергическом и хроническом смешанном стрессе — значительно увеличивается. В медии и адвентиции показатель отношения FGF-2/TGF-pi уменьшается, но при этом экспрессия факторов роста меняется по-разному: при адренергическом стрессе выработка FGF-2 снижается, а экспрессия TGF-pi повышается, а при холинергическом стрессе выработка FGF-2 снижается, а экспрессия TGF-pi не изменяется. Учитывая патофизиологические особенности воздействия FGF-2 и TGF-P-i, можно ожидать различия в формировании фиброза в разных слоях стенки брюшной аорты при том или ином варианте стресса.
Ключевые слова: экспериментальный хронический стресс, ремоделирование, брюшная аорта, FGF-2, TGF-01
This article considers the expression characteristics of basic fibroblast growth factor (FGF-2) and transforming growth factor (TGF-pi) in different layers of the abdominal aortic wall of Wistar rats in experimental modeling of three chronic stress variants. It is shown that the most pronounced changes in expression of both FGF-2 and TGF-pi fibroblast growth factors, of all three wall layers, occur in the endothelium. The FGF-2/TGF-pi ratio in the endothelium in chronic adrenergic stress is reduced, and in chronic cholinergic and mixed chronic stress is significantly increased. The media and adventitia FGF-2/TGF-pi ratio decreases in all three chronic stress models but the expression of growth factors varies according to the chronic stress variant: in adrenergic stress model FGF-2 expression is reduced and TGF-pi expression increases, while in cholinergic stress model FGF-2 expression decreases and the expression of TGF-pi does not change. Given the differences in particular pathophysiological effects of FGF-2 and TGF-pi, it can be expected that severity of fibrosis in different layers of the abdominal aortic wall will differ according to particular variant of chronic stress. Keywords: experimental chronic stress, remodeling, abdominal aorta, FGF-2, TGF-01
В современной концепции жесткости артерий значительное место занимает представление о роли трансформирующего фактора роста фибробластов (TGF-P1). Эта молекула отказывает плейотропное влияние на ССС, регулируя рост клеток, фиброз и воспаление. Влияние TGF-P1 также проявляется в ограничении эластолитической активности, в том числе в ограничении активности матриксной метал-лопротеигназы-2 (ММР-2): блокирование сигнализации TGF-P1 вызывает усиление эластолиза в стенке крупных артерий [1] и наоборот, избыточная экспрессия TGF-P1 уменьшает экспрессию эластолитических ММР и приводит к сохранению эластических волокон даже в зоне повреждения при аневризме аорты [2]. Кроме того, TGF-P1 стимулирует экспрессию
тканевых ингибиторов ММР [3]. В то же время TGF-Р1 сам является медиатором сосудистого фиброза, вызванного механическим стрессом, ангиотензином II (АТП), высоким уровнем гликемии, конечными продуктами гликирования белков [4].
Основной фактор роста фибробластов (FGF-2), также оказывающий значительное влияние на ремо-делирование, является выраженным антагонистом эластогенеза во многих тканях, в том числе уменьшает транскрипцию гена эластина в ГМК сосудистой стенки [5]. Блокада действия FGF-2 предотвращает постнатальное снижение выработки эластина в легких [6]. Отмечено, что FGF-2 способен уменьшать экспрессию эластина в ГМК сосудов, и в определенных условиях может играть роль антагониста протек-
тивного действия TGF-P1 в отношении эластических волокон.
Анализ литературных данных позволяет предположить, что направленность и выраженность действия факторов роста фибробластов зависит не только от содержания в ткани каждого из них, но и от взаминого соотношения, «местной цитокиновой обстановки» [7]. В связи с этим представляется интересным изучение особенностей и соотношения экспрессии TGF-P1 и FGF-2 в стенке аорты при различных видах экспериментального хронического стресса.
Цель исследования: изучить особенности и соотношение экспрессии основного фактора роста фиб-робластов (FGF-2) и трансформирующего фактора роста фибробластов (TGF-P1) в различных слоях стенки брюшной аорты крыс линии Вистар при моделировании трех вариантов хронического стресса.
Материал и методы
Эксперимент проводился на крысах-самцах линии Вистар, сопоставимых по возрасту и массе (200±20г). Животные содержались в помещении с температурой воздуха 22°С с 12-часовым циклом свет/темнота. Животные имели свободный доступ к воде и пище.
Экспериментальное исследование проводилось в соответствии с Европейской конвенцией о защите животных, используемых в эксперименте (Директива 86/609/ЕЕС). Протокол эксперимента, содержание животных и выведение их из опыта были составлены в соответствии с принципами биоэтики, изложенными в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) и приказе МЗ РФ №267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики».
В эксперименте создавались модели трех вариантов стресса — хронического адренергического стресса (ХАС), хронического холинергического стресса (ХХС) и хронического смешанного стресса (ХСС).
В I серии эксперимента при моделировании ХАС 5 крысам на протяжении 2 недель три раза в сутки интраперитонеально вводился адреналин из расчета 50 мкг/кг.
Во II серии эксперимента при моделировании ХХС 5 крысам на протяжении 2 недель три раза в сутки интраперитонеально вводился антихолинэсте-разный препарат прозерин из расчета 20 мкг/кг.
В III серии эксперимента при моделировании ХСС 5 крысам на протяжении 2 недель три раза в сутки интраперитонеально одновременно вводились адреналин в дозе 50 мкг/кг и прозерин в дозе 20 мкг/кг.
Через 2 недели введения препаратов под эфирным наркозом проводилась декапитация животных в каждой серии эксперимента, и осуществлялся забор материала на исследование.
Контрольную серию составили 5 крыс, сопоставимых по возрасту и массе (200±20г). Крысы контрольной серии содержались в отдельном помещении и не подвергались никаким медикаментозным и
стрессовым воздействиям. Под эфирным наркозом декапитировались, и производился забор материала на исследование.
Кусочки стенки брюшной аорты фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, дегидратировали в спиртах возрастающей концентрации и заливали в парафин по общепринятой методике с последующим изготовлением срезов ткани толщиной 4 мкм.
Иммуногистохимические исследования проводились с использованием автоматической установки для иммуногистохимического и иммуноцитологиче-ского окрашивания препаратов Autostainer 360 (Thermo Shandon, Великобритания). Использовались мышиные моноклональные антитела к трансформирующему фактору роста фибробластов TGF-ß1 (TB21) в разведении 1/100, кроличьи поликлональные антитела к основному фактору роста фибробластов FGF-2(147) в разведении 1/400 производства Santa Cruz Biotechnology, Inc., США, а также полимерная иммуногистохимическая система визуализации EnVision (DAKO, США) в соответствии с рекомендациями производителей реагентов. В качестве оптически плотной метки, визуализирующей продукт имму-ногистохимической реакции, использовался диами-нобензидин. После проведения иммуногистохимиче-ской реакции гистологические препараты докрашивались гематоксилином. Учет результатов иммуноги-стохимической реакции проводился с использованием светооптического бинокулярного микроскопа AxioscopeA1 (Carl Zeiss, Германия), TGF-ß1 и FGF-2 — позитивные клетки имели отчетливое коричневое окрашивание, по степени окрашивания выделяли клетки с сильной, средней и слабой экспрессией. В зависимости от количества и интенсивности окрашивания экспрессирующих клеток в поле зрения во всех слоях стенки брюшной аорты выраженность экспрессии факторов роста фибробластов в препарате оценивали по балльной системе: 1 балл — единичные клетки со слабой экспрессией; 2 балла — единичные клетки со средней экспрессией; 3 балла — сплошь в поле зрения клетки со слабой экспрессией и единичные клетки со средней экспрессией; 4 балла — сплошь в поле зрения клетки со слабой экспрессией и единичные клетки с сильной экспрессией. Кроме того расчитывался показатель отношения экспрессии FGF-2 к TGF-ß1.
В различных слоях брюшной аорты каждой крысы во всех сериях эксперимента рассчитывался индекс экспрессии (ИЭ) — количество TGF ß1 и FGF-2 позитивных клеток в 1 мм2 миокарда. Площадь 1 поля зрения, с учетом увеличения микроскопа, составляла 0,088 мм2 (из расчета длина изображения 0,355 мм, умноженная на ширину изображения 0,248 мм). Так же определялся индекс активности (ИА) эндотелиоци-тов, который рассчитывался как доля (в %) эндотелио-цитов, экспрессирующих фактор роста фибробластов TGF ß1 от общего количества позитивных клеток, экс-прессирующих TGF-ß1. Аналогично определялся ИА эндотелиоцитов, экспрессирующих FGF-2.
Статистический анализ проводился с использованием программы STATISTICA 99.
Результаты иследования и их обсуждение
Результаты исследования показали, что в контрольной серии в эндотелиальном слое стенки брюшной аорты различий по экспрессии FGF-2 и ТGF-pl не наблюдалось.
В адвентиции различий по слабой экспрессии FGF-2 и ТGF-P1 не выявлено, но значительно преобладала сильная экспрессия клетками ТGF-P1 (15 баллов), тогда как сильной экспрессии FGF-2 в адвенти-ции не наблюдалось (%2 = 11,398, p < 0,0001). Самые значительные отличия наблюдались в медии стенки брюшной аорты: экспрессия FGF-2 была в 5,1 раза больше экспрессии ТGF-P1 (х2 = 6,837, p < 0,0009).
Таким образом, в контрольной серии крыс линии Вистар выработка FGF-2 и ТGF-P1 в различных слоях стенки брюшной аорты происходит по-разному: ТGF-P1 экспрессируется в основном в ад-вентиции, а FGF-2 — преимущественно в медии. Остается неясным, какие же клетки в основном синтезируют ТGF-P1 в адвентиции, а какие клетки вырабатывают FGF-2 в медии. Можно предположить, что ре-моделирование тех или иных слоев стенки брюшной аорты может привести к изменениям выработки факторов роста фибробластов, что может повлечь за собой изменение механизмов фиброгенеза.
Результаты исследования показали, что отношение FGF-2/TGF-pl значительно менялось при различных вариантах стресса (см. табл.).
В эндотелиальном слое показатель отношения FGF-2/TGF-pl при ХАС уменьшился в 2,1 раза по сравнению с контрольной серией (с 1,24 до 0,61) и это уменьшение произошло за счет значительного увеличения выработки TGF-P1 в 3,5 раза по сравнению с контрольной серией (р < 0,05).
При ХХС показатель отношения FGF-2/TGF-pl увеличился в 3,2 раза (с 1,24 до 4,0), причем за счет выраженного в 3,2 раза увеличения экспрессии FGF-2 (р < 0,05). То есть выработка факторов роста фиброб-ластов идет разнонаправлено при различных вариантах хронического стресса.
При ХСС значение показателя отношения FGF-2/TGF-pl в эндотелиальном слое занимало промежуточное положение и составило 2,6, что в 2,1 раза больше чем в контрольной серии. Увеличение этого показателя, как и при ХАС, связано с увеличением выработки FGF-2, но в меньшей степени (р = 0,066).
В медиальном слое брюшной аорты показатель отношения FGF-2/TGF-pl колебался от 5,1 в контроле до 2,8 при ХСС и по сравнению с контрольной серией
при моделировании ХАС уменьшился на 31,4%, при ХХС — на 20,6%, при ХСС — на 45,1%. Несмотря на однонаправленность изменений, уменьшение показателя отношения FGF-2/TGF-pl достигалось за счет различных изменений экспрессии факторов роста фибробластов: в медии при ХАС и ХСС отмечалось снижение экспрессии FGF-2 (на 42,9% и 32,1% соответственно), и увеличение экспрессии TGF-pl (на 12,5% и 18,7% соответственно). При ХХС выявлено уменьшение экспрессии FGF-2 (на 38,6%) и отсутствие значимых изменений экспрессии TGF-pl.
В адвентициальном слое показатель отношения FGF-2/TGF-pl так же уменьшился при всех вариантах стресса: на 50,0% при ХАС, на 28,4% при ХХС и на 20,5% при ХСС. В адвентициальном слое выявлены те же самые закономерности как и в медии, за исключением ХСС, при котором снижение показателя отношения FGF-2/TGF-pl на 20,5% (с 0,88 до 0,7) достигалось за счет уменьшения выработки как FGF-2, так и TGF-pl.
Таким образом, наиболее выраженные изменения показателя отношения FGF-2/TGF-pl наблюдались в эндотелиальном слое, причем при различных вариантах стресса значения показателя менялись раз-нонаправлено — при ХАС уменьшение показателя отношения FGF-2/TGF-pl происходило в основном за счет повышения экспрессии TGF-pl, а при ХХС показатель отношения FGF-2/TGF-pl увеличивался за счет повышения выработки FGF-2.
Учитывая патофизиологические особенности воздействия FGF-2/TGF-pl, можно предполагать особенности формирования фиброза при том или ином варианте стресса
Таким образом, полученные данные об экспрессии FGF-2 и TGF-pl позволяют утверждать, что:
— в контрольной серии крыс линии Вистар выработка FGF-2 и ТGF-pl в различных слоях стенки брюшной аорты происходит по-разному: ТGF-pl экспрессируется в основном в адвентиции, а FGF-2 преимущественно в медии;
— выработка факторов роста фибробластов FGF-2 и TGF-pl и их соотношение при всех трех вариантах стресса значительно различается. В эндотели-альном слое при ХАС и ХХС показатель отношения изменяется FGF-2/TGF-pl диаметрально противоположно — при ХАС преобладает экспрессия TGF-pl, а при ХХС превалирует выработка FGF-2. Можно предполагать различные механизмы фиброгенеза в эндоте-лиальном слое стенки брюшной аорты при этих вариантах стресса, поскольку морфологические «эффекты» FGF-2 и TGF-pl зависят от их соотношения;
Показатель отношения экспрессии FGF-2/TGF-pl в различных слоях стенки брюшной аорты
при трех вариантах хронического стресса
Серия эксперимента Внутренняя оболочка Средняя оболочка Наружная оболочка
FGF-2 TGF-pl Д в % к контролю FGF-2 TGF-pl Д в % к контролю FGF-2 TGF-pl Д в % к контролю
Контроль 1,24 5,1 0,88
ХАС 0,61 -50,8% 3,5 -31,4% 0,44 -50,0%
ХХС 4,0 +222,6% 4,0 -20,6% 0,63 -28,4%
ХСС 2,6 +109,7% 2,8 -45,1% 0,07 -20,5%
— в медии и адвентиции, несмотря на однонаправленность изменений показателя отношения FGF-2/TGF-pl, уменьшение показателя отношения достигалось все-таки за счет различных изменений экспрессии факторов роста фибробластов: как при ХАС, так и при ХХС выработка FGF-2 снижалась, а экспрессия TGF-Р1 повышалась при ХАС и не изменялась при ХХС. Значения показателя отношения FGF-2/TGF-pl при ХСС занимали промежуточное значение.
Наиболее выраженные изменения выработки факторов роста фибробластов, как FGF-2, так и ТGF-Р1, при всех трех вариантах стресса происходили в эндотелиальном слое.
Работа выполнена при финансовой поддержке РГНФ.
1. Alvira C.M., Guignabert C., Kim Y.M., et.al. Inhibition of transforming growth factor beta worsens elastin degradation in a murine model of Kawasaki disease. American Journal of Pathology, 2011, vol. 178, pp. 1210-1220.
2. Dai J., Losy F., Guinault A.M., et.al. Overexpression of transforming growth factor-beta1 stabilizes already-formed aortic aneurysms: a first approach to induction of functional healing by endovascular gene therapy. Circulation, 2005, vol. 112, pp. 1008-1015.
3. Akool El-S., Doller A., Muller R., et.al. Nitric oxide induces TIMP-1 expression by activating the transforming growth factor beta-Smad signaling pathway. Journal of Biological Chemistry, 2005, vol. 280, pp. 39403-39416.
4. Ruiz-Ortega M. et.al. TGF-p signaling in vascular fibrosis. Cardiovascular Research, 2007, vol. 74, no. 2, pp. 196-206.
5. Carreras I., Rich C.B., Panchenko M.P., Foster J.A. Basic fibroblast growth factor decreases elastin gene transcription in aortic smooth muscle cells. Journal of Cellular Biochemistry, 2002, vol. 85, pp.592-600.
6. Weinstein M., Xu X., Ohyama K., Deng C.X. FGFR-3 and FGFR-4 function cooperatively to direct alveogenesis in the murine lung. Development, 1998, vol. 125, pp. 3615-3623.
7. Davidson J.M., Zoia O., Liu J.M. Modulation of transforming growth factor-beta 1 stimulated elastin and collagen production and proliferation in porcine vascular smooth muscle cells and skin fibroblasts by basic fibroblast growth factor, transforming growth factor-a, and insulin-like growth factor-I. Journal of Cellular Physiology, 1993, vol. 155, no. 1, pp. 149-156.
