CC BY
19
© Группа авторов, 2001
Особенности численно-размерного состава мышечных волокон передней большеберцовой мышцы при повреждении и реконструкции бедренной артерии в условиях костно-сосудистой травмы в эксперименте
Г.Н. Филимонова, Н.А. Щудло, А.М. Добрушкин, Н.В. Копкова, Т.Н. Варсегова
Characteristic features of numerical-and-dimensional composition of muscular fibers of the anterior tibial muscle for injury and
reconstruction of the femoral artery under osteovascular trauma
experimentally
G.N. Filimonova, N.A. Chtchoudlo, A.M. Dobroushkin, N.V. Kopkova, T.N. Varsegova
Государственное учреждение науки Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" им. академика Г. А. Илизарова, г. Курган (генеральный директор — заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент РАМН, д.м.н., профессор В.И. Шевцов)
На 18 взрослых беспородных собаках проведены эксперименты по моделированию сосудистой и костно-сосудистой травмы и реконструкции магистральной артерии. Исследовали опорно-двигательную функцию конечности в экспериментах с изолированным повреждением, швом артерии и сочетании этого воздействия с нейтральным и дистракционным остеосинтезом после открытой остеотомии. В передней большеберцовой мышце после гистохимического выявления активности миозиновой АТФ-азы изучали численно-размерный состав мышечных волокон, кровоснабжаемых реконструированной бедренной артерией. Гистограмма диаметров мышечных волокон, являясь достаточно чувствительным тестом, отражает направленность структурной перестройки мышцы в экспериментальных условиях. В статье обсуждено патологическое и адаптивное значение изменений опорно-двигательной функции конечности и характера распределения мионов.
Ключевые слова: эксперимент, беспородная собака, костно-сосудистая травма, мышца, морфометрия, гистограмма распределения.
The experiments on modelling of vascular and osteovascular trauma and reconstruction of magistral artery were made using 18 adult mongrel dogs. Limb locomotor function was studied by experiments with isolated injury and arterial suturing and combination of this effect with neutral and distraction osteosynthesis after open osteotomy. Numerical-and-dimensional composition of muscular fibers, supplied by reconstructed femoral artery, was studied in the anterior tibial muscle after histochemical revealing of myosin ATP activity. Histography of muscular fiber diameters, being rather a sensitive test, reflects orientation of muscular structural reconstruction experimentally. Pathological and adaptive importance of changes in limb locomotor function and those in character of myon distribution were discussed in the work. Keywords: experiment, mongrel dog, osteovascular trauma, muscle, morphometry, histogram of distribution.
Ишемический некроз мышечных волокон, по-видимому, следует рассматривать в числе основных причин, определяющих неудовлетворительные результаты восстановления функции конечности при переломах длинных трубчатых костей с повреждением магистральных артерий.
М.Г. Гончарь и Е.П. Мельман [4] изучили характер компенсаторно-приспособительных сочетанных изменений в мышцах и их кровеносных капиллярах при острой экспериментальной ишемии конечности и на этапах рециркуляции. В работе Т.С. Беркуцкой с соавт. [1] исследованы изменения гистохимических и морфометрических характеристик мышц голени собак на модели хронической ишемии различ-
ной степени через 3 месяца после резекции бедренных и ягодичных артерий и введения скле-розирующего раствора в подколенную артерию. Было установлено, что в передней большебер-цовой и икроножной мышцах увеличивается средний диаметр мышечных волокон (МВ), что авторы ассоциировали с развитием внутриклеточного отека и расширением цистерн сарко-плазматического ретикулума. Наиболее значительные изменения претерпевала кривая распределения МВ по диаметрам: она становилась бимодальной, увеличивалась ширина её основания. При более глубокой ишемии типы мышечных волокон не дифференцировались.
Представляется актуальным изучение осо-
бенностей патологических и адаптационных изменений скелетных мышц, кровоснабжаемых повреждённой артерией, после её реконструкции и регенерации в условиях костно-сосудистой травмы, при этом практически важно сравнение условий нейтрального и дистрак-
ционного остеосинтеза.
Цель данного исследования - изучение особенностей численно-размерного состава мышечных волокон как одной из важнейших мор-фо-функциональных характеристик мышцы после реваскуляризирующей операции.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты проведены на 18 взрослых беспородных собаках в возрасте скелетной зрелости. Операции выполняли в асептических условиях под внутривенным комбинированным обезболиванием. В первой серии (п=5) после проекционного доступа к поверхностной бедренной артерии выполняли артериотомию и микрохирургический циркулярный шов. Использовали инструментарий фирмы Aesculap, нити 8/0 и 10/0 на круглой атравматической игле диаметром 75-130 мкм фирмы Е1Ысоп, операционный микроскоп фирмы Орйп (увеличение от 8х до 32х). Во второй (п= 6) и третьей (п=7) сериях пересечение и анастомози-рование артерии осуществляли после открытой остеотомии бедренной кости и наложения спице-стержневого аппарата для остеосинтеза. Общий срок эксперимента во всех сериях опытов составил 70 дней после операции. При этом в третьей серии через 7 дней после остеотомии начинали удлинение бедра дистракцией в аппарате с суточным темпом 0,5-0,75 мм за 2-3 приёма, которое проводили в течение 35 дней, после чего следовал период фиксации 28 дней. Во второй серии опытов конечность фиксировали в течение 70 дней после операции (в том числе в экспериментах с более ранней консолидацией). В течение эксперимента регистрировали особенности опорной функции и походки животных.
Для морфометрических исследований передней большеберцовой мышцы из каждой серии было случайным образом отобрано по 3
собаки. При биопсии под наркозом, либо в первые 10-15 минут после эвтаназии из верхней, средней и нижней трети передней большебер-цовой мышцы лезвием безопасной бритвы иссекали кусочки ткани объемом 1см3, замораживали в жидком азоте и изготавливали поперечные срезы толщиной 15-17 мкм в криостате при температуре -220С. Проводили гистохимическую реакцию на выявление активности фермента миозиновой АТФ-азы по Padycula, Herman в модификации З. Лойда [7]. Условным контролем служили мышцы контралатеральной конечности. Помимо этого для контроля использовали материал от трех интактных собак. Измерения диаметров, площади поперечного сечения и периметра МВ в оцифрованных изображениях поперечных срезов (по 200-300 волокон в каждой мышце) производили в программе "Médias" на аппаратно-программном комплексе "ДиаМорф" для анализа полноцветных изображений. Статистическую обработку первичных данных проводили в программе "Microsoft Excel", диаметры мионов ранжировали с шагом 10 мкм. Оценку статистической значимости различий проводили с использованием непараметрического критерия Смирнова для двусторонней гипотезы, нулевая гипотеза которого состоит в равенстве эмпирических функций распределения [2]. Вычисления теста выполнены в ИВЦ РНЦ "ВТО" И.П. Гайдышевым с помощью специально составленных функций.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Экспериментально-клиническое исследование двигательной активности, опорной функции и походки животных свидетельствует о существенных различиях между сериями.
В первой серии (при изолированном повреждении артерии) снижение двигательной активности отмечалось только в периоде выхода из наркоза - в течение одного-двух дней после операции. Некоторые животные уже на следующее утро после операции "служили на задних лапах", уверенно опираясь на оперированную конечность.
Вторая серия (сочетание повреждения и ана-стомозирования бедренной артерии с остеотомией и нейтральным остеосинтезом) характеризовалась тем, что животные в той или иной мере щадили оперированную конечность. Две собаки из 6 в течение 2-3-х недель вообще не опира-
лись на оперированную конечность. С четвёртой недели эксперимента опорная функция и походка у всех животных практически восстанавливались. Одна собака на протяжении всего периода эксперимента пользовалась оперированной конечностью, как бы "не замечая" перелома бедренной кости и аппарата.
В третьей серии поведение животных в течение первых 2-3-х недель после операции не отличалось от второй. Но со второй недели дистракции щажение конечности становилось более заметным, а в 3 -х случаях из 7 наблюдались симптомы патологической опоры (на подогнутые пальцы или даже тыл стопы), что свидетельствовало о нарушении функции седалищного нерва. Патологические знаки исчезали уже в начале периода фиксации, но некоторое ослабление опоры отмечалось
даже через месяц фиксации, что при неравенстве длины конечностей закономерно.
При гистохимическом исследовании во всех препаратах передней большеберцовой мышцы реакция на миозиновую АТФ-азу позволяла выявить мышечные волокна с высокой концентрацией осадка сульфида кобальта (темно-коричневые) и низкой концентрацией (светло-коричневые) и различные звенья микроциркуля-торного русла: артериолы, прекапилляры, капилляры, посткапилляры, венулы. В некоторых препаратах выявлялись также ядра мышечных волокон (МВ) и клеток-сателлитов, которые
имели более светлую окраску, чем микрососуды. Визуально препараты передней большебер-цовой мышцы оперированной и контралате-ральной конечностей, а также разных серий практически не различались (рис. 1).
Анализ гистограмм распределения мышечных волокон (МВ) по диаметру позволил выявить особенности отдельных экспериментов и отличия между сериями.
Гистограммы распределения МВ в интакт-ной серии имеют в среднем 6 классов мионов. Характерной их особенностью является относительное единообразие мионов (рис. 2).
опытная конечность
контралатеральная конечность
Контроль 1, 10 недель Контроль 2, 10 недель Серия Ш Д35Ф28
Рис. 1. Поперечные криостатные срезы передней большеберцовой мышцы опытной и контралатеральной конечностей в трех сериях эксперимента. Активность миозиновой АТФ-азы по Padycula, German. Об. 16х, Ок. 12,5.
40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0%
30% 25% 20% 15% 10% 5% 0%
25,0%
11--20 21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 71-80
11--20 21-30
31-40 41-50 51-60 61-70
50% -45% -40% -35% -30% -25% -20% -15% -10% -5% -0% -
11--20 21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 71-80
Рис. 2. Гистограммы распределения мышечных волокон по средним диаметрам в передней большеберцовой мышце интактной серии.
28,0%
26,3%
12,9%
4,2%
2
2,3%
71-80
9,1%
2,5%
1,5%
Волокна с высокой активностью миозиновой АТФ-азы имеют преимущественно малый диаметр. Известно, что активность этого фермента отражает скоростные характеристики миофиб-рилл (быстрый и медленный миозин) [9], следовательно, мелкие МВ обладают высокой скоростью сокращения. Мионы с низкой активностью АТФ-азы преимущественно большого диаметра.
В первой серии эксперимента при изолированном повреждении артерии распределение МВ по диаметрам сохраняет унимодальный характер. Гистограммы распределения мионов оперированной и контралатеральной конечностей содержат в двух случаях то же количество классов, что и в интактной серии, однако гистограммы отличаются многоступенчатостью, что свидетельствует о протекании процесса структурной перестройки (рис. 3).
-40,0% -30,0% -20,0% -10,0% 0,0% 10,0% 20,0% 30,0% 40,0%
5414 81-90 0,5%
-50,0% -40,0% -30,0% -20,0% -10,0% 0,0% 10,0% 20,0% 30,0% 40,0% 50,0%
2040 0,5% 81-90 0,5%
-40% -30% -20% -10% 0% 10% 20% 30% 40% 50%
Рис. 3. Контроль 1. Гистограммы распределения мионов в передней большеберцовой мышце при пересечении и микрохирургическом шве бедренной артерии.
Далее на всех рисунках гистограммы опытной конечности - слева, контралатеральной конечности - справа. Гистограммы опытных конечностей во всех трех случаях имеют максимальное количество волокон в классе 51-60 мкм. В контралатеральной конечности № 2411 и
№ 5414 максимальный процент мионов зарегистрирован в пределах 41-50 мкм, в № 2040 - 5160 мкм. Непараметрический критерий Смирнова для сравнения эмпирических функций распределения МВ по средним диаметрам в данной серии эксперимента выявил недостоверное отличие опытной и интактной конечностей для всех экспериментальных случаев. Опытная и контралатеральная конечности значимо различаются лишь в случае № 2411 (Р<0,01).
Во второй серии гистограмма распределения МВ в № 2012 опытной конечности визуально отличается от двух других экспериментальных случаев и имеет один пик и более узкое основание (рис. 4). Форма гистограммы № 2012 более других схожа с гистограммой интактной серии, где одна вершина с широким пиком, так как 3 класса 31-40, 41-50, 51-60 мкм содержат в среднем по 23,5% мышечных волокон. В случае № 2012 к классу 41-50 мкм относится 46,2% мионов и к классу 51-60 - 27,6 %. Такая гистограмма распределения МВ свидетельствует, что передняя большеберцовая мышца является вы-сокодифференцированной и функционально-активной, что подтверждено клинической картиной. При сравнении опытной и контралате-ральной конечностей определена статистическая значимость различий (Р<0,01), напротив, различия с интактной серией недостоверны. В экспериментах № 2602 и № 2009 опытной конечности определяется две вершины и достаточно равномерное распределение МВ по классам от 10% до 26% в каждом классе (рис. 4). Можно предположить, что исследуемая мышца в данных экспериментальных случаях находится на этапе дифференцировки. Характер распределения по диаметрам МВ опытной и контрала-теральной конечностей достоверно различается в случае № 2602 (Р<0,01) и № 2009 (Р<0,05). Различия с интактной серией достоверны лишь в случае № 2009 (Р<0,01).
В третьей серии эксперимента через 35 дней дистракции и 28 дней фиксации во всех экспериментальных случаях опытной конечности распределение становится унимодальным с явной асимметрией в пользу меньших диаметров (рис. 5). Для контралатеральной конечности гистограмма симметрична, то есть распределение нормальное, увеличивается число мионов с большим диаметром. Различия опытной и кон-тралатеральной конечностей в случаях № 2408 и № 2611 значимы, соответственно Р<0,05 и Р<0,01.
Рис. 4. Контроль 2. Гистограммы распределения мио-нов в передней большеберцовой мышце при пересечении и микрохирургическом шве бедренной артерии в условиях нейтрального остеосинтеза бедренной кости.
2611
-50,0% -40,0% -30,0% -20,0% -10,0% 0,0% 10,0% 20,0% 30,0% 40,0%
Рис. 5. Серия 3. Гистограммы распределения мионов в передней большеберцовой мышце при пересечении и микрохирургическом шве бедренной артерии в условиях дистракционного остеосинтеза бедренной кости.
Таким образом, анализ гистограмм распределения МВ по средним их диаметрам в передней большеберцовой мышце выявил следующее.
В первой серии при изолированном повреждении артерии распределение МВ по диаметрам сохраняет унимодальный характер, вершина гистограммы незначительно смещается в сторону больших диаметров, практически не меняется ширина основания гистограммы. В контрала-теральной конечности наблюдается синергизм, что свидетельствует об адаптационном характере перестройки - абсолютном снижении количества МВ малого диаметра и увеличении доли волокон большего диаметра.
Во второй серии при моделировании соче-танной травмы артерии и бедренной кости через 70 дней после микрохирургического шва бедренной артерии и нейтрального остеосинтеза в мышце оперированной конечности наблюдается тенденция к бимодальному распределению по диаметрам МВ: в эксперименте № 2009 бимо-дальность отчётливо выражена, у № 2602 отмечается аналогичная тенденция. В этих экспери-
ментах появляется фракция волокон наименьшего диаметра, что вероятно указывает на появление регенерирующих МВ. У животного, которое наиболее активно пользовалось оперированной конечностью (№ 2012), гистограмма одновершинна, кроме того, характерно, что совершенно отсутствуют мелкие мионы.
В третьей серии при регенерации артерии и кости в условиях дистракционного остеосинтеза гистограммы МВ оперированной конечности в наибольшей степени отличаются от контралате-ральной. Прежде всего в опытной конечности вершины гистограмм смещаются в сторону меньших диаметров, а в контралатеральной -напротив, увеличивается число мионов с большим диаметром (особенно в случае максимального щажения оперированной конечности и опоры на контралатеральную - № 2056).
Анализируя патологическое и адаптивное значение изменений гистограммы передней большеберцовой мышцы в разных условиях эксперимента, следует рассмотреть роль, по крайней мере, трёх повреждающих факторов.
Первый, наиболее очевидный фактор - острая ишемия в момент пересечения артерии и хроническая - в период её регенерации после анастомо-зирования. В данных экспериментах время окклюзии артерии было небольшим (15-40 минут), во всех случаях верифицирована проходимость анастомоза методами флоуметрии и морфологического исследования. Небольшие отличия паттернов гистограмм оперированной и контралате-ральной конечности в I серии позволяют сделать вывод, что значимость ишемического фактора в данных условиях невелика. Тенденция к "ише-мическому" типу гистограммы во 2 серии позволяет предположить, что в условиях костно-сосудистой травмы даже при реконструкции магистральной артерии развивается та или иная степень "обкрадывания" кровоснабжения мышц дистальных отделов конечности.
При любом травматическом воздействии, особенно таком тяжёлом, как открытый перелом диафиза трубчатой кости, нарушаются структурно-функциональные характеристики гемато-нейрального барьера. В работе Г.А. Илизарова и М.М. Щудло [5] изучен когерентный характер изменений структурных эквивалентов перинев-рального барьера и проводниковой части нерва. Транзиторный характер клинических манифестаций выпадения функции седалищного нерва, наблюдавшихся в экспериментах 3 серии, свидетельствует о функциональном характере и обратимости этих изменений. Это предположение согласуется с данными Н.Р. Карымова [6] о достаточно небольшом проценте деструктивно изменённых форм мякотных и безмякотных нервных волокон к концу периода дистракции даже при малой её дробности в экспериментах с удлинением голени. В то же время, судя по клинической картине, состояние парабиоза нервных волокон седалищного нерва в экспериментах с дистракционным остеосинтезом более продолжительное, чем при нейтральном, что несомненно сказывается на состоянии иннерви-руемых мышц. В этих условиях более продол-
жителен период снижения функциональной нагрузки оперированной конечности. Изменения гистограммы передней большеберцовой мышцы оперированной конечности свидетельствуют о тенденции к атрофии мышечных волокон.
Сопоставление гистограмм всех трёх серий с интактной позволяет предположить, что фактор гиподинамии имеет очень большую значимость. Данные литературы [8] свидетельствуют о высокой скорости дегенерации и регенерации МВ при гиподинамии: на протяжении 3 недель гиподинамии у крыс в камбаловидной мышце количество дегенерировавших МВ колебалось от 4,66 до 14,08%, но уже к концу этого периода наблюдалась регенерация 4,12+0,3% МВ. В наших экспериментах 1 серии, по-видимому, сказывается в основном общая гиподинамия, особенно выраженная во время наркотического сна и ближайшем послеоперационном периоде. Во второй и третьей сериях более или менее продолжительное время ослаблена опорно-двигательная функция оперированной конечности и повышена нагрузка на контралатеральную - сопоставление паттернов гистограмм мышц оперированной и контралатеральной конечности позволяет объективизировать функциональную асимметрию.
Таким образом, гистограмма распределения МВ по диаметрам является достаточно чувствительным тестом, отражающим общую направленность структурной перестройки мышцы в различных экспериментальных условиях в тех случаях, когда при визуальной оценке препаратов мышечной ткани отличия не выявляются.
Полученные данные свидетельствуют, что даже при ранней реконструкции магистральной артерии в условиях костно-сосудистой травмы состояние нервно-мышечного аппарата будет в значительной мере определяться режимом реабилитационных мероприятий, направленных на усиление двигательной активности мышц, обеспечение их трофики и оксигенации.
ЛИТЕРАТУРА
1. Беркуцкая Т.С., Зусманович Ф.Н., Бунов В.С. Изменения скелетных мышц при экспериментальной ишемии конечности // Архив патологии. - 1983. - № 7. - С. 36-41.
2. Большев Л.Н., Смирнов Н.В. Таблицы математической статистики. - М.: Наука, 1983. - 416 с.
3. Гланц С. Медико-биологическая статистика. - М.: Практика, 1999. - 460 с.
4. Гончарь М.Г., Мельман Е.П. Морфофункциональные изменения мышц конечности и их микроциркуляторного русла под влиянием острой ишемии // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. - 1990. - Т. 98, Вып. 6. - С. 13-18.
5. Илизаров Г.А., Щудло М.М. Изменения нервов голени при её удлинении в эксперименте // Лечение ортопедо-травматологических больных в стационаре и поликлинике методом чрескостного остеосинтеза, разработанным в КНИИЭКОТ: Тез. докл. науч.-практ. конф. - Курган, 1982. - С. 198-201.
6. Карымов Н.Р. Изменения нервов удлиняемого сегмента конечности при разной дробности дистракции (морфо-функциональное исследование): Автореф. дис... канд. мед. наук. - Пермь, 1995. - 24 с.
7. Лойда З. и др. Гистохимия ферментов: Лабораторные методы. Пер. с англ. / З. Лойда., Р. Госсрау, Т. Шиблер. - М.: Мир, 1982. -270 с.
8. Lesions degeneratives du muscle solaire induites par l'hypodynamie / A.X. Bigard, D. Merino, F. Lienhard, C.Y. Guezennec // Arch. Physiol. Biochem. - 1995. - Vol.103, № 5. - P. 100.
9. Barani M. АТБ - as activity of myosin correlated with speed of muscle shortening // J. Gen. Physiol. - 1967. - Vol. 50, № 2. - Р. 197-216.
Рукопись поступила 10.05.01.
