CC BY
52
УДК 616.631.11:616.379-008.64:612.017.1:615.37:616-091.8
ОСОБЕННОСТИ БАЗАЛЬНОЙ И СТИМУЛИРОВАННОЙ СЕКРЕЦИИ ИНТЕРЛЕЙКИНОВ 2 И 4 МОНОНУКЛЕАРАМИ КРОВИ ПРИ АУТОИММУННОМ ДИАБЕТЕ
Т.В. Саприна, Ф.Э. Лазаренко, Т.С. Прохоренко, В.А. Столярова, Н.В. Рязанцева
ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Росздрава, г. Томск E-mail: tvsaprina@sibmail. com
PECULIARITIES OF BASAL AND STIMULATED SECRETION OF INTERLEUKINE 2 AND 4 BY MONONUCLEAR BLOOD CELLS IN AUTOIMMUNE DIABETES
T.V. Saprina, F.E. Lazarenko, T.S. Prohorenko, V.A. Stolyarova, N.V. Ryazentseva
Siberian State Medical University, Tomsk
В ходе работы определяли базальную и фитогемагглютинин-стимулированную продукцию интерлейкинов 2 (IL-2) и 4 (IL-4) мононуклеарами у пациентов с сахарным диабетом (СД). В поперечное исследование были включены 8 больных с СД типа 1, 21 пациент с СД типа 2 и 6 больных медленно прогрессирующим аутоиммунным диабетом (LADA). Для пациентов с СД типа 1 характерен высокий уровень базальной продукции IL-2 и низкий уровень базальной продукции IL-4. Интересен тот факт, что уровни продукции IL-4 при LADA достоверно выше.
Ключевые слова: аутоиммунный сахарный диабет, сахарный диабет тип 1, латентный аитоиммунный диабет взрослых, продукция цитокинов мононуклеарами, интерлейкин-2, интерлейкин-4.
The aim of the study was to evaluate the basal and phytoagglutinin-stimulated production of interleukins 2 (IL-2) and 4 (IL-4) by mononuclear leukocytes in diabetes mellitus. 8 patients with type 1 diabetes, 21 patients with type 2 diabetes and 6 patients with latent autoimmune diabetes in adults (LADA) were included in cross-sectional research. In type 1 diabetes basal production of IL-2 is increased, and basal production of IL-4 is decreased. It is of interest that production of IL-4 in LADA was significantly higher.
Key words: autoimmune diabetes mellitus, type 1 diabetes mellitus, latent autoimmune diabetes in adults, cytokine production by mononuclear leukocytes, interleukin 2, interleukin 4.
Введение
В настоящее время отмечается неуклонный рост заболеваемости сахарным диабетом (СД) во всех возрастных и этнических. Углубление понимания механизмов формирования диабета позволяет объяснить его клиническую гетерогенность и обосновать необходимость дифференцированной терапии. Если дебют СД приходится на период от 18 до 40 лет, могут иметь место различные его патогенетические варианты, требующие дифференцированной терапевтической тактики [2]. Аутоиммунный диабет может развиться в любом возрасте. Среди пациентов с СД обозначилась особая группа больных латентным аутоиммунным диабетом взрослых (LADA) [8]. Основным лабораторным критерием LADA является наличие циркулирующих антител к клеткам панкреатических островков. Для LADA характерна острая манифестация в возрасте от 30 до 50 лет и отсутствие абсолютной инсулиновой недостаточности в последующие 6 месяцев [7, 16]. В качестве клинических критериев диагноза LADA также используются индекс массы тела (ИМТ) менее 25, личный и семейный анамнез аутоиммунных заболеваний [7]. В результате иммунного повреждения островков у этих больных уже в начале заболевания отмечается снижение секреторной реакции р-клеток на стимуляцию глюкозой или глюкагоном [21]. Имеющиеся в литературе данные
позволяют считать, что медленное повреждение р-кле-ток при LADA не является случайным, а отражает патогенетические особенности функционирования Т-звена иммунитета, отличные от механизмов развития классического СД типа 1. В настоящее время в качестве ключевых звеньев патогенеза повреждения р-клеток рассматриваются аутоиммунные механизмы, глюкозо- и липо-токсичность, а также системный окислительный стресс и цитокиновый дисбаланс [9].
В 1986 г Mosmann и сотрудники предложили модель Th1/Th2 - поляризации иммунного ответа, постулирующую, что эти клеточные типы находятся во взаимоотношениях контррегуляции посредством продукции цитокинов [6, 18]. Считается, что ТЫ-клетки играют главную роль в патогенезе аутоиммунного диабета. Напротив, предполагается, что цитокины профиля Th2 могут быть протективными, подавляя патологический аутореактивный ответ 1 типа и поддерживая толерантность.
Цель работы - проанализировать зависимость базальной и фитогемагглютинин-стимулированной продукции мононуклеарами IL-2 и IL-4 от клинического типа диабета, стажа заболевания, индекса массы тела пациента, потребности в инсулине. То есть установить взаимосвязь между клиническими проявлениями сахарного диабета и поляризацией в системе Th1/Th2.
Материал и методы
В исследовании приняли участие 35 пациентов, в возрасте от 21 года до 62 лет (средний возраст - 47,5±1,5 года), в том числе 23 женщины и 12 мужчин. Выборка была сформирована из больных сахарным диабетом, находившихся на обследовании и лечении в эндокринологическом отделении ОГУЗ ТОКБ (зав. отд. к.м.н. Милова-нова Т.А.) и Клиник ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (зав. клин. Гудкова Т.К.). Диагноз сахарного диабета устанавливался на основании критериев ВОЗ [23].
Группу больных с СД типа 1 составили 8 человек, средний возраст - 36,5±2,3 года, длительность заболевания -9,5±2,8 года. Диагноз СД типа 1 устанавливался на основании развития кетоацидоза в течение первых 6 месяцев от начала заболевания, персистирующей потребности в инсулинотерапии после ликвидации кетоза и достижения метаболической компенсации.
Группу больных с СД типа 2 составил 21 человек, средний возраст - 52,6±1,1 года, длительность заболевания -5,3±1 год. Диагноз СД типа 2 устанавливался на основании наличия маркеров метаболического синдрома, постепенного начала заболевания без развития кетоацидо-за, отсутствия потребности в инсулинотерапии после ликвидации кетоза и достижения метаболической компенсации как минимум в течение 6 месяцев от начала заболевания.
Группу больных МБА составили 6 человек, средний возраст - 44,2±3,8 года, длительность заболевания -4,2±1,7 года. Диагноз LADA устанавливался на основании клинических критериев острой манифестации в возрасте от 30 до 50 лет без развития кетоацидоза, отсутствия потребности в инсулинотерапии после ликвидации ке-тоза и достижения метаболической компенсации как минимум в течение 6 месяцев от начала заболевания. В качестве клинических критериев диагноза LADA также использовался индекс массы тела (ИМТ) менее 25, отсутствие признаков метаболического синдрома, личный и семейный анамнез аутоиммунных заболеваний. В качестве косвенного лабораторного подтверждения LADA рассматривали отсутствие гиперинсулинемии и снижение секреторной реакции р-клеток на стимуляцию смешанной пищей [7, 16].
По стажу заболевания группы были однородны.
Материалом исследования являлась венозная кровь обследованных лиц, взятая утором натощак. Кровь стабилизировали гепарином (25 Ед/мл).
Мононуклеары выделяли на градиенте плотности фиколл-верографин. Для получения супернатантов выделенные мононуклеары ресуспендировали в полной питательной среде, стандартизируя количество клеток в суспензии до 2,0х106/мл. Для стимуляции секреторных способностей лимфоцитов в пробы вносили фитогемаг-глютинин (“БИео”, Германия) с дальнейшей инкубацией клеточных суспензии в течение 24 ч.
Определение спонтанного и ФГА-стимулированного уровней 1Ь-2 и 1Ь-4 в супернатантах проводили с использованием твердофазного иммуноферментного метода по инструкциям, предлагаемым производителями тест-систем (“Ргоеоп”, Россия). Учет результатов иммунофермен-
тного анализа производили с помощью фотометра для микропланшетов “Multiscan EX” (“ThermoLabSystems”, Финляндия) при длине волны 450. Концентрацию цито-кинов вычисляли по калибровочной кривой. Данные выражали в пг/мл.
Исследование соответствовало требованиям локального этического комитета ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава, разработанными в соответствии с Хельсинской декларацией Всемирной ассоциации “Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека” с поправками 2000 г. и “Правилами клинической практики в Российской Федерации”, утвержденными Приказом Минздрава Российской Федерации от 19.06.2003 г. №266. Все лица, участвующие в исследовании, дали информированное согласие на участие.
Результаты исследования обрабатывали с использованием стандартного пакета программ Statistica. for Windows (2000, версия 6.0) фирмы Statsoft Inc. и пакета программ Microsoft Excel (2003). Для всех имеющихся выборок данных проверяли гипотезу нормальности распределения (по критерию Колмогорова-Смирнова). Для каждой выборки вычисляли средневыборочные характеристики^ среднее арифметическое, среднее квадратичное отклонение, ошибку среднего. При соответствии нормальному закону распределения признака в исследованных выборках проверку гипотезы о равенстве средних выборочных величин проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Для оценки статистической значимости различий выборок, не подчиняющихся критерию нормальности распределения, использовали критерии Манна-Уитни (для независимых выборок) и Вилкоксона (для зависимых выборок). Различия считались статистически значимыми при уровне значимости р<0,05. Для выявления функциональных взаимосвязей между изученными параметрами проводили корреляционный анализ путем вычисления коэффициента ранговой корреляции Пирсона (r) [2].
Результаты и обсуждение
Известно, что между Th1- и Th2 лимфоцитами существует “антагонизм”, реализуемый с участием их продуктов - IL-2 и IFN-g или IL-4 и IL-10 соответственно. Согласно современным представлениям, поляризация иммунного ответа по Th1-пути играет решающую роль в патогенезе аутоиммунного диабета. Исходя из этого, в ходе настоящего исследования была проведена оценка способности мононуклеаров периферической крови пациентов с сахарным диабетом продуцировать ключевые цитоки-ны, детерминирующие Th1- и №2-пути IL-2 и IL-4 соответственно (табл. 1).
Интерлейкин-2 (IL-2) - один из важнейших цитоки-нов профиля Th1. Повышение уровня IL-2 вызывает цепную реакцию повышения содержания других цитокинов.
По данным литературы, у пациентов с впервые выявленным СД типа 1, и их серопозитивных родственников выявляли как повышение сывороточного уровня IL-2, так и повышение его продукции мононуклеарами после стимуляции [1, 5, 13, 14, 19]. С другой стороны, имеются данные, свидетельствующие о снижении уровня IL-2 и его
продукции мононуклеарами при СД типа 1 [17, 22].
При исследовании базальной продукции IL-2 отмечалась отчетливая тенденция к более высоким уровням в группе пациентов, страдающих СД типа 1 (138,74±67,99 пг/мл), затем в группе LADA (96,88+51,75 пг/мл), и наименьшим в группе больных СД типа 2 (72,72+19,94 пг/мл). Однако уровень статистической значимости не был достигнут из-за малого объема выборок (р СД типа 1 - СД типа 2=0,22; р СД типа 1 - LADA=0,65; р СД типа 2 -LADA=0,6). Полученные результаты согласуются с данными литературы. Более высокий уровень базальной продукции IL-2 при аутоиммунном диабете отражает Th-1 поляризацию иммунного ответа при этом заболевании. Выявлена статистически значимая обратная корреляционная зависимость между уровнем базальной продукции IL-2 и весом при LADA (r=-0,85, p=0,032). Также выявлена статистически значимая обратная связь уровня базальной продукции IL-2 с возрастом при СД типа 2 (r=-0,67, p=0,0009).
При исследовании ФГА-стимулированной продукции IL-2 отмечалась отчетливая тенденция к более высоким уровням в группе пациентов, страдающих СД типа 2 (212,67+103,26 пг/мл), затем в группе LADA (121,89±54,61 пг/мл), и наименьшим в группе больных СД типа 1 (78,23±32,51 пг/мл). Однако уровень статистической значимости не был достигнут из-за малого объема выборок (р СД типа 1 - СД типа 2=0,44; р СД типа 1 - LADA=0,48; р СД типа 2 - LADA=0,65). Полученные результаты отражают истощение функциональных резервов мононукле-аров при аутоиммунном процессе (табл. 1).
Интерлейкин-4 (IL-4) - это ключевой цитокин профиля Th2. Он секретируется активированными ^-лимфоцитами, тучными клетками. In vitro IL-4 стимулирует рост Т и В-клеток, регулирует индукцию №2-ответа, ингибирует макрофаги воспаления и TM-клетки. Этот ци-токин способствует формированию “толерантного Th2-фенотипа”, привлекая В-лимфоциты в качестве “непрофессиональных” антиген представляющих клеток, которые стимулируют развитие анергии в большей мере, чем активации. Более того, IL-4 ингибирует освобождение активированными макрофагами таких провоспалительных
Таблица 1
Уровни базальной и ФГА-стимулированной продукции IL-2 и IL-4 мононуклеарами периферической крови пациентов с СД
Показатели, пг/мл СД типа 1, M+m (n=8) СД типа 2, M+m (n=21) LADA, M+m (n=6)
Базальная продукция !Ь-2 138,74+67,99 72,72+19,94 96,88+51,75
ФГА-стимулированная продукция ^-2 78,23+32,51 212,67+103,26 121,89+54,61
Базальная продукция ^-4 29,11+18,52 52,45+23,27 80,61+36,04
ФГА-стимулированная продукция ^-4 3,36+2,36* 11,09+7,96 29,86+13,62*
Примечание: * - статистическая значимость различий ФГА-стимулирован-ной продукции IL-4 в группах пациентов с СД типа 1 и LADA p=0,047 по t-критерию Стьюдента; M - выборочная средняя, m - ошибка средней, n - объем выборки.
молекул, как интерлейкин-1, фактор некроза опухолей-а, интерлейкин-8, простагландин е2 [20].
По литературным данным, IL-4 проявляет защитное действие в моделях аутоиммунного диабета у грызунов [12]. Предварительная инкубация островковых клеток человека с IL-4 предотвращает апоптоз, вызываемый смесью IL-1+TNF-а+интерферон-y (IFN-y). Тем не менее, перенос Th2 клонов мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом может вызвать инсулит и Сд, и в некоторых условиях трансгенная экспрессия IL-4 способствует развитию аутоиммунного СД, наиболее типичного TM-заболевания.
Данные относительно содержания этого цитокина в периферической крови пациентов с СД типа 1 и их сиб-сов, базальной и стимулированной фитогеммагглютини-ном (ФГА) продукции мононуклеарами in vitro крайне противоречивы. Одни авторы обнаруживали более низкий его уровень [1, 11], другие не находили отличия от контрольной группы [10, 13, 14], третьи отмечали даже его повышение в дебюте СД типа 1 [19].
При исследовании базальной продукции IL-4 отмечалась отчетливая тенденция к более высоким уровням в группе LADA (80,61+36,04 пг/мл), чем в группе пациентов, страдающих СД типа 2 (52,45±23,27 пг/мл), и наименьшим в группе больных СД типа 1 (29,11+18,52 пг/ мл). Однако уровень статистической значимости не был достигнут из-за малого объема выборок (р СД типа 1-СД типа 2=0,56; р СД типа 1 - LADA=0,2; р сД типа 2 -LADA=0,56). Выявлена статистически значимая обратная корреляционная зависимость между уровнем базальной продукции IL-4 и весом при СД (r=-0,34, p < 0,05). При СД типа 2 - прямая связь с весом (r=0,48, p=0,03), и обратная связь со стажем инсулинотерапии (r=-0,5, p=0,02).
При исследовании ФГА-стимулированной продукции IL-4 отмечалась отчетливая тенденция к более высоким уровням в группе LADA (29,86+13,62 пг/мл), затем в группе пациентов, страдающих СД типа 2 (11,09±7,96 пг/мл), и наименьшим в группе больных СД типа 1 (3,36+2,36 пг/мл). Причем, различие средней ФГА-стимулированной продукции IL-4 в группах LADA и СД типа 1 было статистически значимым, несмотря на малый объем выборок (р СД типа 1 - LADA=0,047; р СД типа 1 - СД типа 2=0,56; р СД типа 2 - LADA=0,27). Полученные результаты также отражают истощение функциональных резервов моно-нуклеаров при аутоиммунном процессе (табл. 1). Выявлена статистически значимая прямая корреляционная зависимость между уровнем ФГА-стимулированной продукции IL-4 и стажем инсулинотерапии при LADA (r=0,99, p=0,001) и при СД типа 1 (r=0,97, p=0,00007). При СД типа 2 - со стажем диабета (r=0,98, p < 0,0001) и стажем инсулинотерапии (r=0,69, p=0,0005). Более высокий уровень базальной и ФГА-стимулированной продукции IL-4 при LADA вероятно отражает патогенетические особенности функционирования Т-звена иммунитета, отличные от механизмов развития СД типа 1, определяющие более медленное повреждение р-клеток при этом заболевании. Низкий уровень базальной и ФГА-стимулированной продукции IL-4 при СД типа 1 свидетельствует в пользу Th-1 поляризации иммунного ответа.
Заключение
Для пациентов с СД типа 1 характерен высокий уровень базальной продукции IL-2 и низкий уровень базальной продукции iL-4, что согласуется с гипотезой о Th1-поляризации иммунного ответа при этом заболевании. Низкие уровни ФГА-стимулированной продукции как IL-2, так и IL-4, вероятно, свидетельствуют в пользу функционального истощения мононуклеаров вследствие аутоиммунного процесса, хронической гипергликемии и инсулиновой недостаточности.
В группе больных LADA также отмечен относительно высокий уровень базальной продукции IL-2, что может рассматриваться как проявление аутоиммунного процесса. Низкий уровень ФГА-стимулированной продукции IL-2 также говорит о функциональном истощении мононук-леаров. Интересен тот факт, что уровни базальной и ФГА-стимулированной продукции IL-4 при LADA значимо выше, чем остальных группах. Это вероятно отражает патогенетические особенности функционирования Т звена иммунитета при LADA, отличные от механизмов развития СД типа 1, определяющие более медленное повреждение ß-клеток при этом заболевании.
Все вышеизложенное, на наш взгляд, не только подтверждает важную роль поляризации иммунного ответа в патогенезе аутоиммунного диабета, но и ставит вопрос о значении цитокиновой регуляции в механизмах формирования LADA, т.е. о детерминации скорости деструкции ß-клеток при естественном течении заболевания. Дальнейшее расширение знаний в этой области, верификация и детализация участия иммунопатологических процессов в прогрессировании деструкции ß-клеток поджелудочной железы при СД типа 1 даст возможность разработать новые диагностические и терапевтические подходы в отношении этого заболевания.
Литература
1. Попова В.В., Мельниченко С.В., Малиновская Т. Н. и др. Содержание цитокинов в крови в доклиническую и раннюю клиническую стадии развития сахарного диабета у детей // Проблеми ендокринної патології. - 20о4. - T.2. -C. 53-59.
2. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. -М. : Медиа-Сфера, 20о2. - 238 с.
3. Смирнова О.М., Кононенко И.В., Дедов И.И. Аутоиммунный латентный сахарный диабет у взрослых // Проблемы эндокринологии. - 2008. - Т.54, №2. - С. 1-7.
4. Aharoni D., Mor A., Bistrizer T. et al. Aberrant Th1/Th2 cytokine secretory pattern in pre-IDDM high risk individuals // Abstr. Book 4th Immunol. Diabet. Soc. Congr. November 12-15, 1999.
- Rome, 1999. - P. 119.
5. Citarrella R., Richiusa P., Mattina A. [et al.] Different TH1/TH2 cytokine expression in type 1diabetes mellitus patients (T1DM) alone or associated with autoimmune thyroid disease (AITD) // Diabetologia. - 2004. - Vol.47, Suppl.1. - A. 188.
6. Fiorentino D. F., Bond M. W., Mosmann T. R. Two types of mouse T helper cell. IV. Th2 clones secrete a factor that inhibits cytokine production by Th1 clones // J. Exp. Med. - 1989. - Vol.170. -P. 2081-2095.
7. Fourlanos S., Perry C., Stein M. S. et al. A clinical screening tool identifies autoimmune diabetes in adults // Diabetes Care. -2006. - Vol.29, №5. - P. 970-975.
8. Groop L., Bottazzo G.F., Doniach D. Islet cell antibodies identify latent tipe 1 diabetes in patient aged 35-75 years at diagnosis // Diabetes. - 1986. - Vol.35. - P. 237-241.
9. Hohmeier H.E., Tran W., Chen G., Gasa R., Newgard C.B. Inflammatory mechanisms in diabetes: lessons from the p-cell // Int. J. Obesity. - 2003. - Vol.27. - P. 12-16.
10. Hussain M.J., Maher J., Warnock T. et al. Cytokine overproduction in healthy first degree relatives of patients with IDDM // Diabetologia. - 1998. - Vol.41, №3. - P. 343-349.
11. Karlsson M.G., Lawesson S.S., Ludvigsson J. Th1-like dominance high risk first-degree relatives of type I diabetic patients // Diabetologia. - 2000. - Vol.43, №6. - P. 742-749.
12. Kukreja A., Maclaren N.K. Autoimmunity and diabetes // J. Clin. Endocrinol. Metab. - 1999. - Vol.84, №12. - P. 4371-4378.
13. Leech N. J., Elsegood K. A., Narendran P. et al. Deficit in Th2 cytokine production from peripheral T cell subsets in recent onset type 1 diabetes // Abstr. Book 4th Immunol. Diabet. Soc. Congr. November 12-15, 1999. - Rome, 1999. - P. 75.
14. Leech N.J., Elsegood K.A., Narendran P. et al. T helper 1 profile of recently activated circulating T cells in type 1diabetes // Diabetologia. - 1999. - Vol.42, Suppl.1. - A 316.
15. Liblau R.S., Singer S.M., McDevitt H.O. Th1 and Th2 CD4+ T cells in the pathogenesis of organ-specific autoimmune diseases // Immunol. Today. - 1995. - Vol.16. - P. 34-38.
16. Maioli M., Puddu L., Pes G.M. et al. [Latent autoimmune diabetes in adults] [Article in Italian] // Clin. Ter. - 2006. - Vol.157, №1.
- P. 69-78
17. Marchase R.B., Chen P.Y., Su Z. et al. Lymphocytes from subjects with type 1 diabetes are deficient in capacitative calcium entry: implications to immune function, cytokine production, and T cell subset representation // Abstr. Book 4th Immunol. Diabet. Soc. Congr. November 12-15, 1999. - Rome, 1999. - P 82.
18. Mosmann T.R., Coffman R.L. TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties // Annu. Rev. Immunol. - 1989. - Vol.7. - P. 145173.
19. Rapoport M.J., Mor A., Vardi P. et al. Decreased secretion of Th2 cytokines precedes up-regulated and delayed secretion of Th1cytokines in activated peripheral blood mononuclear cells from patients with insulin-dependent diabetes mellitus // J. Autoimmun. - 1998. - Vol.11, №6. - P. 635-642.
20. Rocken M., Shevach E. M. Immune deviationthe third dimension of nondeletional T cell tolerance // Immunol. Rev. - 1996. -Vol.149. - P- 175-194.
21. Stenstrom G., Gottsater A., Bakhtadze E. et al. Latent Autoimmune Diabetes in Adults // Diabetes. - 2005. - Vol.54, Suppl 2. - P. S68-S72.
22. Tomoda T., Kurashige T., Taniguchi T. Imbalance of the interleukin 2 system in children with IDDM // Diabetologia. -1994. - Vol.37, №5. - P. 476-482.
23. WHO. Report of the Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus // Diabetes Care. -1999. -Vol.27, №5. - P. 1047-1053.
Поступила 25.09.2009
