CC BY
52
ОБЩАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 579.26
Э. Э. Зиганшина, В. Ш. Мохаммед, Н. В. Шулаев, А. В. Беспятых, А. М. Зиганшин
ОСОБЕННОСТИ БАКТЕРИАЛЬНОГО СООБЩЕСТВА КИШЕЧНИКА ЛИЧИНОК ЖУКОВ-КСИЛОФАГОВ (CERAMBYCIDAE)
Ключевые слова: жуки-ксилофаги, бактерии, высокопроизводительноесеквенирование, 16SрРНК.
В настоящем исследовании на основе анализа данных высокопроизводительного секвенированиягена бактериальной 16SрРНКоценена структуракишечных бактериальных сообществ жуков семейства Усачина личиночной стадии индивидуального развития. В структуресообществ бактерий, ассоциированных с кишечником личинок жуков рода Усачи-рагии(личинки типичныексилофаги), выявлена как дифференциация бактериального разнообразия кишечной микробиоты между двумя видами жуков-усачей, так и отмеченысхожие черты кишечных ассоциаций бактерий.Среди основных представителей кишечной микробиотыисследуемых личино-котмечены характерные для каждого вида жуков-усачей представителибактериальной филы Proteobacteria
Keywords: xylophagous beetles, bacteria, high-throughput sequencing, 16S rRNA.
In the present study, the structure of the gut bacterial communities in larvae of some Cerambycidae species was estimated using high-throughput sequencing of bacterial 16S rRNAgenes. In the structure of the bacterial communities associated with the gut systems of the xylophagous larvae, the differentiation of the bacterial diversity of the gut microbi-ota within species of beetles as well as similar features of the gut bacterial associations were noted. Among the main representatives of the gut microbiota of the studied larvae various members of thephylum Proteobacteriawereobserved.
Введение
Насекомые представляют собой одну из самых многочисленных и многообразных групп, представители которойохватили разнообразные экологические ниши и обрели способность питаться широким спектром органических ресурсов. Способность насекомых к усвоению сложных питательных веществ, например, лигноцеллюлозных компонентов, нередко обусловлена наличием прочных симбиоти-ческих связей хозяев с разнообразными микроорганизмами. Микробные сообщества, ассоциированные с пищеварительными системами насекомых, помогают им расщеплять и переваривать различные природные полимеры, в частности растительные компоненты и древесину у насекомых-ксилофагов (растительноядных насекомых). Следует отметить, что экологическая роль прочных связей насекомых и их микробных симбионтов также вносит вклад в гло-бальныециклыкак углерода, так и азота [1, 2]. Кроме основных функций по участию в конверсии субстрата, грибные и бактериальные симбионты, а также архейные симбионты у некоторых насекомых, выполняют и другие специфические функции, которые могут включать, например, синтез необходимых веществ, устойчивость к патогенам, детоксикациюи ряд других [3, 4].
Жесткокрылые (жуки) рассматриваются как один из крупнейших таксонов насекомых, у многих из которых развились высокоэффективные пищеварительные системы, способные переваривать трудноусвояемые субстраты. Кроме этого, жуки развили симбиотические взаимоотношения с микроорганиз-мамикишечного тракта, играющими важную роль в пищеварении. В свою очередь, условия в кишечном
тракте жуков благоприятствуют росту и развитию разнообразных микроорганизмов. Прочные взаимоотношения жуков-ксилофагов и микроорганизмов их пищеварительного тракта имеют как большое значение в природе - глубокое расщепление труднодоступных субстратов, так и перспективы для практического применения полученных фундаментальных знаний в различных биотехнологиях [5-7].
Известно несколько семейств среди жесткокрылых, представители которых способны переваривать древесную биомассу, в частности Усачи, Долгоносики, Точильщики, Златки и другие. Среди указанных семейств отдельное место занимают Усачи или дровосеки (Cerambycidae), взрослые особи кото-рыхпитаются вегетативными органами травянистых растений и деревьев, в то время как их личинки развиваются преимущественно в деревьях, используя их в качестве единственного источника питания [4].
Среди представителей семейства Усачи особенно выделяются жуки рода Усачи-рагии - Rhagium, которые утилизируют ослабленную древесину и ускоряют разложение мёртвой древесины [8]. Так, имаго Чернопятнистого рагия (Rhagiummordax) относится к полифагам, в то время как личинки данного вида усачей развиваются исключительно под корой деревьев и в пнях. Другой представитель рода Усачи-рагии, а именно личинки Рагия ребристого (Rhagiuminquisitor) внедряются под кору ослабленных и мертвых деревьев, прокладывают там ходы, а также развиваются в пнях. Несмотря на обширные знания об анатомии и физиологии жуков семейства Усачи, лишь в узком ряде исследований, направлен-ныхна достоверную оценку структуры кишечных сообществжуков-усачей, отмечена важная роль бак-
териальных и грибных симбионтовв питании и развитии своих хозяев [9, 10].
Таким образом, достоверные знания о потенциале симбиотической микрофлоры насекомых-ксилофагов, в том числе и жуков на различных этапах жизненного цикла, позволят раскрыть механизмы сложных взаимоотношений организмов с представителями кишечной микробиоты, а также в перспективе лечь в основу различных биотехнологий, в том числе и конверсии труднодоступных субстра-товв полезные продукты [6, 7].
В связи с вышеизложенным целью данной работы являлось определение основных представителей сообществ бактерий кишечного тракта двух видов жуков рода RhagiumПриволжской климатической зоны (Республика Татарстан, Россия) на личиночной стадии индивидуального развития с применением современных методов молекулярной биологии.
Экспериментальная часть
Сбор материала и препарирование личинок. Поиск личинок осуществлялся под корой валежин и сухостоя различных пород хвойных и лиственных деревьев в окрестностях поселка Займище (Республика Татарстан, Россия) летом 2016 года. Точки сбора были занесены в базу данных "Энтомофауна". Личинки жуков транспортировались в лабораторию живыми в чашках Петри с древесной биомассой. После группирования личинок по размеру и первичной идентификации по морфологическим признакам они подверглись препарированию. Перед препарированием поверхность личинок отмывалась дважды 70% этиловым спиртом для удаления загрязнений и поверхностноймикробиоты. Далее кутикулу личинок дважды отмывали 0,9% раствором NaCl и стерильными скальпелем и пинцетом проводили иссечение кишечника личинок. Содержимое целого пищеварительного тракта использовали непосредственно для экстракции тотальной ДНК и молекулярного анализа. Кутикулу личинок использовали для экстракции ДНК и дальнейшего установления таксономической принадлежностисамих жуков.
Идентификация личинок. Выделение ДНК из кутикулы личинок усачей осуществляли с помощью набора для выделения ДНК FastDNA SPIN Kit (MP Biomedicals, США) согласно инструкциям производителя. Для установления таксономической принадлежности исследованных в работе личинок жуков был применен анализ фрагментов митохондриаль-ного гена первой субъединицы цитохромсоксидазы (ген COI), используемого для ДНК-баркодирования эукариот [11].
При амплификации гена COI использовали праймеры LC01480 (5'-GGTCAACAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3') и HCO2198 (5'-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3') [11]. Очистку продуктов амплификации проводили с применением кита QIAquick PCR PurificationKit (Qiagen, Германия) согласно рекомендациям производителя. Для секвенирования фрагментов митохондриального гена первой субъединицы цитохромсоксидазы использовали праймеры LC01480 и HCO2198. Определение нуклеотидных последовательностей прово-
дилось на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3100 GeneticAnalyzer (AppliedBiosystems, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Для установления таксономической принадлежности исследуемых личинок был проведен поиск схожих нуклеотидных последовательностей фрагментов гена COI в базе данных NCBI (Национальный центр биотехнологической информации США). Идентификация личинок осуществлялась относительно инвентарных номеров нуклеотидных последовательностей базы данных NCB I [12].
Анализ бактериальных сообществ кишечного тракта личинок жуков-усачей. Для каждого образца были проведены биологические и технические повторы. Для каждого биологического повтора образцы нескольких пищеварительных систем личинок каждого вида усачарагия объединялись и использовались для экстракции тотальной ДНК с использованием набора FastDNAspinkit forsoil (MPBi-omedicals, США) всоответствиисинструкциямипро-изводителя. Фрагменты бактериальной 16S рРНК амплифицировали с тотальной ДНК с применением пары универсальных праймеров Bakt_341F (5'-CCT ACG GGN GGC WGC AG-3') и Bakt_805R (5'-GAC TAC HVG GGT ATC TAA TCC-3') [13]. Библиотеки, содержащие фрагменты гена бактериальной 16S рРНК, секвенировали на платформе MiSeq (Illumina, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Анализ полученных данных секве-нирования выполнялся с использованием пакета QIIME [14]. Все низкокачественные и короткие последовательности, а также химерные последовательности были удалены из дальнейшего анализа. Нуклеотидные последовательности были сгруппированы в операционные таксономические единицы (ОТЕ) на уровне 97% сходства последовательностей гена бактериальной 16S рРНК. Представители основных бактериальных сообществ, ассоциированных с пищеварительной системой личинок Рагия чернопятнистогои Рагия ребристого, представлены на уровне вида или более высокого таксона (таблицы 1 и 2).
Результаты и их обсуждения
Таксономическая принадлежность личинок семейства Усачи. На основе анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов митохондриально-го гена цитохромсоксидазы I личинки жуков-усачей были идентифицированы как личинки рода Усачи-рагии, а именно личинки Рагия чернопятнистого и Рагия ребристого. Изображения взрослых особей данных жуков представлены на рисунках 1А и 1Б, соответственно.
Структура бактериальных сообществ кишечного тракта личинок жуков рода Усачи-рагии. Применение культуральных методов оценки разнообразия микробных сообществ различных экологических ниш может оказаться неточным из-за нескольких факторов, например, из-за специфических условий роста многих микроорганизмов. Новые методы се-квенирования позволяют достоверно изучать мик-робиомразличных исследуемых образцов. Однако, несмотря на значительный объем научных работ,
направленных на исследование микроорганизмов, ассоциированных с насекомыми, в том числе и жуками, лишь узкий ряд исследований сосредоточен на достоверном исследовании того, как эти микробные сообщества организованы и о самих механизмах их взаимоотношений с хозяевами.
Бактериальное разнообразие кишечного тракта жуков рода Rhagium в пределах семейства Cerambycidae на личиночной стадии индивидуального развития было исследовано методом высокопроизводительного секвенирования гена бактериальной 16S рРНК на платформе Illumina. В таблице 1 представлены основные представители домена Бактерии кишечного тракта личинок жуков Рагия чернопятнистого с процентом встречаемости более 0.5%. Среди сообществ бактерий доминантной и самой разнообразной группой оказалась фила Proteobacteria. К основным представителям также были отнесены бактерии фил Actinobacteriaи Firmicutes. Представители ряда других фил присутствовали в сообществе бактерий личинок жуков вида Рагия чер-нопятнистого в незначительном количестве.
Рис. 1 - Имагожуков рода Усачи-рагии:Рагийчернопятнистый (Rhagiummordax; А) и Рагий ребристый (Rhagiuminquisitor; Б)(источник фотографий:http://cerambycidae.org)
Доминирующими филотипами филы Proteobacteria оказались представители класса Gammaproteobacteria. Доминирование в пределах данного классачленов семейства Enterobacteriaceae, местомобитания для большинства которых является кишечник различных животных, могло быть связа-ноучастием данных факультативных анаэробных микроорганизмовв метаболизме различных полисахаридов, в том числе и целлюлозы в составе потребляемых личинками жуков-усачей субстратов [15]. Полученные результаты также согласуются с данными работы [16], авторы которой изучили кишеч-нуюмикробиоту у взрослого жука-усача в пределах подсемейства Lamiinae. Авторы показали доминирование бактерий семейства Enterobacteriaceae внутри бактериальных ассоциаций кишечника усачей, наносящих экономический ущерб плантациям
кешью в Нигерии. В другой работе [10] также отмечено, что в структуре бактериальных сообществ, ассоциированных с кишечником ряда других личинок Cerambycidae, доминировали представители бактериального порядка Enterobacteriales.
Таблица 1 - Представители бактериального сообщества, ассоциированного с кишечником личинок Рагия чернопятнистого (мажорные выделены полужирным шрифтом)
Фила Класс Представители
бактерий бактерий сообщества бактерий
род Cellulomonas
Cellulomonasxylanilytica
род Dietzia
Семейство
Actinobacte -ria Microbacteriaceae
Actinobacteria род Microbacterium
род Salinibacterium
род Mycobacterium
семействоNocardiaceae
род Rhodococcus
род Propionicimonas
Bacilli семействоBacillaceae
род Lactococcus
род Anaerovorax
Firmicutes род Clostridium
Clostridia род Coprococcus
семейство Veillonellaceae
Род Pelosinus
Порядок Rhizobiales
Boseagenosp.
род Devosia
Pleomorphomonasoryzae
Alphapro-teo-bacteria Семейство Rhizobiaceae
род Agrobacterium
род Kaistia
род Rhizobium
Rhizobiumleguminosarum
семейство
Xanthobacteraceae
Proteobacteria Betaproteo- семей- ствоComamonadaceae
bacteria родComamonas
Comam onasterrigena
Семейство
Enterobacteriaceae
Род Citrobacter
Gammapro-teobacteria род Serratia
род Sodalis
Семейство Moraxellaceae
Acinetobacterguillouiae
род Pseudomonas
Представители рода Сitrobacter в пределах мажорного класса Gammaproteobacteria (семейство Enterobacteriaceae) известны как споронеобразую-щие факультативно анаэробные бакте-рии,распространенные в почве, в водеи являющиеся представителями кишечного тракта многих живот-
ных. Данные бактерии, способные к трансформации углеродсодержащих субстратов и азотфиксации, отмечены как играющие важную роль в развитии жуков-короедов на всех их стадиях развития [17]. Присутствие бактерий рода Citrobacter в кишечном тракте личинок Рагия чернопятнистого потенциально могло быть опосредовано их участиемв связывании азота, что имеет важное значение для насекомых, питающихся субстратами с низким содержанием азота. Другие представители класса Gammaproteobacteria, в частности бактерии родов Serratia и Pseudomonas, также были отмечены как важные члены сообществ бактерий у взрослых жуков-усачей [16].
Представителей бактериальных фил Firmicutes и Actinobacteria также детектировали в роли основных членов сообществ кишечного тракта личинок Рагия чернопятнистого, но в меньшем количестве. В пределах филы Actinobacteria отметим бактерии рода Cellulomonas, способные активно осуществлять деструкцию целлюлозы [18, 19], в частности аэробный вид Cellulomonasxylanilytica, обладающий как цел-люлолитической, так и ксиланолитической активностью [20]. Обнаруженные представители класса Clostridiaв пределах филы Firmicutes являются активными представителями разнообразных сообществ, участвующими в гидролизе сложных субстратов, а также кислотообразовании [21].
В таблице 2 указаны основные представители домена Бактерии кишечного тракта личинок Рагия ребристого с процентом встречаемости более 0.5%. Основными встречаемыми филами (как и у личинок Рагиячернопятнистого) оказались Proteobacteria, Firmicutes и Actinobacteria, а также Bacteroidetes. Представители разнообразной и доминантной филы Proteobacteria детектировались в роли главных членов бактериальных сообществ и кишечнике Рагия ребристого. Представитель семейства Moraxellaceae в пределах порядка Pseudomonadales, а именно Acinetobacterguillouiae доминировал в кишечной-микробиоте личинок Рагия ребристого.
Представители следующего мажорного порядка Enterobacterales в пределах филы Proteobacteria также были обнаружены в повышенном количестве и в кишечнике личинок Рагия ребристого в работе Grunwald с соавторами [9]. В пределах филы Firmicutes наиболее значительными оказались бактерии семейства Bacillaceae. Стоит отметить, что данные бактерии были отмечены и в бактериальных сообществах, ассоциированных с кишечником личинок других жуков-усачей в другойработе [10]. В пределах филы Bacteroidetes основными таксонами оказались члены родов Chryseobacteriumи Sphingobacterium, тогда как в пределах филы Actinobacteria - бактерии родов Propionibacterium Rhodococcus. Доля представителей других бактериальных филотипов оказалась незначительной.
Распространенность характерных микроорганизмов в составе кишечных микробных ассоциаций у исследуемых личинок жуков семейства Усачи предполагает симбиотическую ассоциацию микроорганизмов и их хозяев. Стоит также отметить, что ис-
точником ряда бактериальныхфилотипов мог стать и потребляемый личинками субстрат.
Таблица 2 - Представители бактериального сообщества, ассоциированного с кишечником личинок Рагия ребристого (мажорные выделены полужирным шрифтом)
Фила бактерий Класс бактерий Представители сообщества бактерий
Actinobacteria Actinobacteria Propionibacteriuma cnes
Род Rhodococcus
Bacteroidetes Flavobacteriia род Chryseobacterium
Sphingobacteriia Sphingobacteriumm ultivorum
Firmicutes Bacilli Семейство Bacillaceae
Proteobacteria Betaproteo-bacteria семейство Leuconostocaceae
Род Ralstonia
Род Comamonas
Gammaproteo-bacteria Семейство Enterobacteriaceae
Род Citrobacter
Род Erwinia
Род Serratia
Acinetobacterguillo uiae
Род Stenotrophomonas
В настоящем исследовании на основе анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов митохондриального гена COI до вида были идентифицированы личинки жуков семейства Усачи. Для каждого вида, а именно Рагия чернопятнистого и Рагия ребристого, описано бактериальное разнообразие микробиоты кишечника на стадии личинки с использованием высокопроизводительного секвени-рования гена 16S рРНК. Показано повышенное бактериальное разнообразие в кишечнике личинок вида Рагия чернопятнистого.
Стоит отметить выявление характерных для каждого из рассмотренных видовжуков бактерий в пределах общей мажорной филы Proteobacteria, определяющей основу микробного сообщества, способного участвовать в расщеплениии переваривании сложных природных субстратов, в частности древесины. Таким образом, отмечены общие и различные характеристики микробиоты содержимого кишечника личинок жуков одной экологической группы и с общим характером питания.
Отметим, что многие представители бактериальных сообществ не были классифицированы до рода и вида, что ограничивает нас в установлении их функциональных особенностей в структуре сообществ бактерий кишечника исследуемых личинок жуков-усачей.
Дальнейшие научные исследования структуры микробных сообществ, ассоциированных с пищева-
рительной системой жуков-ксилофагов, применение метагеномного профилирования для обнаружения новых генов, ответственных за конверсию лигно-целлюлозных субстратов, а также получение новых микробов и исследование физиолого-биохимической характеристики обнаруженных представителей позволят внести важный фундаментальный вклад в наши знания об экологии микроорганизмов и стать основой различных биотехнологий.
Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований в рамках научного проекта № 16-3400547.
Литература
1. N.Fierer, M.S. Strickland, D.Liptzin, M.A.Bradford, C.C. ClevelandEcol. Lett.,12, 1238-1249 (2009)
2. K. Fox-Dobbs, D.F.Doak, A.K.Brody, T.M. Palm-erßcology, 91, 1296-1307 (2010)
3. P. Engel, N.A.Moran,FEMS Microbiol. Rev,37, 699-735(2013)
4. A.E. Douglas, Annu. Rev. Entomol,60, 17-34 (2015)
5. J.Z. Sun, M.E. Scharf, InsectSci.,17, 163-165(2010)
6. P. Gupta, K.Samant, A.Sahu,Int. J.Microbiol, 2012, 1-5 (2012)
7. M. Krishnan, C.Bharathiraja, J.Pandiarajan, V.A. Prasan-na, J.Rajendhran, P.Gunasekaran,Asian Pac. J. Trop. Bio-med., 4, 16-21 (2014)
8. B. Wermelinger, P. Duelli, M.K. Obrist, For. Snow.Landsc. Res,77, 133-148 (2002)
9. S. Grunwald, M. Pilhofer, W. Holl, Syst. Appl. Microbi-ol.,33, 25-34 (2010)
10. K.Rojas-Jimenez,M.Hernandez, Int. J. Microbiol., 2015, 1-11 (2015)
11. O. Folmer, M. Black, W. Hoeh, R. Lutz, R. Vrijenhoek, Mol. Mar. Biol. Biotech.,3, 294-299 (1994)
12. S.F.Altschul, T.L. Madden, A.A. Schaffer, J.H. Zhang, Z. Zhang et al., Nucleic Acids Res.,25, 3389-3402(1997)
13. E.E.Ziganshina,E.M.Ibragimov,P.Y.Vankov,V.A.Miluyko v,A.M. Ziganshin, Waste Manage, 59, 160-171 (2017)
14. J.G. Caporaso, J. Kuczynski, J. Stombaugh, K. Bittinger F.D. Bushman, E.K. Costello, N. Fierer, A.G. Pena, J.K. Goodrich, J.I. Gordon et al., Nat. Methods, 7, 335-336 (2010)
15. J. Morales-Jimenez, G. Zuniga, H.C Ramirez-Saad, C. Hernandez-Rodriguez, Microb. Ecol.,64, 268-278 (2012)
16. A.V.Oyedokun, D.O.Adeniyi,Int. J. Insect Sci.,8, 17-22 (2016)
17. X. Hu, C. Wang, H.Chen, J. Ma, Int. J. Mol. Sci.,14, 21006-21020 (2013)
18. W. Kenyon, S. Esch, C. Buller, Antonie van leeuwenhoek, 87, 143-148 (2005)
19. W.W.Wakarchuk, D.Brochu, S.Foote, A.Robotham, H.Saxena, T.Erak, J.Kelly, PLoS One,11(2016)
20. R. Rivas, M.E. Trujillo, P.F. Mateos, E. Martinez-Molina, E. Velazquez, Int. J. Syst. Evol.Microbiol,54, 533-536 (2004)
21. E.E. Ziganshina, D.E. Belostotskiy, R.V. Shushlyaev, V.A. Miluykov, P.Y. Vankov, A.M. Ziganshin, J. Microbiol. Biotechnol,24, 1464-1472 (2014)
© Э. Э. Зиганшина - к.б.н., ассистент кафедры микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии КФУ,elvira051088@gmailxom; В. Ш. Мохаммед - аспирант кафедры микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии КФУ, [email protected];H. В. Шулаев - к.б.н., доцент кафедры зоологии и общей биологии Института фундаментальной медицины и биологии КФУ, [email protected]; А. В. Беспятых - ассистент кафедры зоологии и общей биологии Института фундаментальной медицины и биологии КФУ, [email protected]; А. М. Зиганшин - д.б.н., в.н.с. кафедры микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии КФУ, [email protected].
© E. E. Ziganshina - candidate of science in biology, assistant of the Department of microbiology, Institute of fundamental medicine and biology, KFU, [email protected]; V. S. Mohammed - postgraduate student of the Department of microbiology, Institute of fundamental medicine and biology, KFU, [email protected]; N. V. Shulaev - candidate of science in biology, associate professor of the Department of zoology and general biology, Institute of fundamental medicine and biology, KFU, [email protected]; A. V. Bespyatykh - assistant of the Department of zoology and general biology, Institute of fundamental medicine and biology, KFU, [email protected]; A. M. Ziganshin - doctor of science in biology, leading researcherofthe Department of microbiology, Institute of fundamental medicine and biology, KFU, [email protected].
