CC BY
67
№ 1 - 2010 г.
14.00.00 медицинские науки
УДК 616-006.04-085.849.12]-091.8
ОСНОВНЫЕ ВАРИАНТЫ КЛЕТОЧНЫХ РЕАКЦИЙ СО СТОРОНЫ ЗДОРОВЫХ ТКАНЕЙ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ БОР-НЕЙТРОНОЗАХВАТНОЙ ТЕРАПИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ
(ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР)
11 2 Ю.В. Пахомова , В.В. Каныгин , С.М. Давыдова
]ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава»(г.
Новосибирск)
2 •,
ГУ «НИИ физиологии СО РАМН» (г. Новосибирск)
В статье изучается влияние бор-нейтронзахватной терапии на процессы адгезии клеток и связанные с ними клеточные структуры.
Ключевые слова: клеточные реакции, адгезия клеток, метод биоиндикации
Пахомова Юлия Вячеславовна - доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической физиологии и клинической патофизиологии ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава», телефон рабочий: (383) 225-39-78
Каныгин Владимир Владимирович - кандидат медицинских наук, ассистент кафедры нейрохирургии ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава», телефон рабочий: (383) 229-28-84
Давыдова Светлана Михайловна - кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории нейрорегуляции ГУ «НИИ физиологии СО РАМН», контактный телефон: (383) 229-10-82
Одним из достоинств бор-нейтронзахватной терапии (БНЗТ) является способность к подавлению процессов метастазирования опухолей. Известно, что в развитии и метастазировании опухолей важную роль играют процессы клеточной адгезии [4]. Адгезия клеток к соседним клеткам, межклеточному матриксу или различным поверхностям является одним из фундаментальных биологических механизмов, определяющих форму и подвижность клеток. Она играет важнейшую роль в формировании многоклеточных организмов. Поэтому важно изучить влияние БНЗТ на процессы адгезии клеток и связанные с ними клеточные структуры.
В качестве объектов исследования авторы использовали два вида культивируемых опухолевых клеток с различной морфологией и способностью к колониеобразованию. Клетки аденокарциномы человека WiDr формировали плотные колонии из нескольких десятков клеток, тесно контактирующих друг с другом. Клетки глиобластомы человека D54Mg не образовывали таких колоний и контактировали друг с другом с помощью длинных отростков. Эти клетки культивировали в средах RPMI 1640 и DMEM соответственно по стандартным методикам в пластиковых планшетах Costar или Nunc или в чашках Falcon (35 х 10 mm). Для оценки прочности адгезии клеток к пластиковому субстрату подсчитывали число открепившихся клеток после стандартной их обработки раствором трипсина. Для оценки способности клеток прикрепляться к субстрату подсчитывали количество клеток, не прикрепившихся к субстрату через разные промежутки времени.
Для оценки выживаемости клеток использовали МТТ-тест или через сутки после воздействия 10В измеряли среднюю оптическую плотность клеточного монослоя, окрашенного метиленовым синим, на длине волны 630 нм. В иммунофлуоресцентном исследовании использовали антитела к белкам клеточной адгезии интегрину aVp3 и Е-кадгерину, а также к белкам цитоскелета актину и тубулину. Флуоресцентная микроскопия показала, что при кратковременной инкубации TPPS2a локализуется почти исключительно на клеточной поверхности. В этом случае понятно, как при БНЗТ воздействие может повреждать адгезионные белки. Спектральные измерения показали, что PpIX может выходить из клеток, и этот процесс нарастает со временем по мере накопления PpIX в клетке. Следовательно, протопорфирин IX может задерживаться в плазматической мембране во время ее пересечения и сенсибилизировать мембранные белки.
Однако и другие фотосенсибилизаторы: MTR, селективно окрашивающий
митохондрии, и гиперицин, локализующийся в эндоплазматическом ретикулуме и аппарате Гольджи, также ингибировали трипсин-индуцированное открепление клеток WiDr от субстрата.
Таким образом, не только сенсибилизаторы, локализующиеся в плазматической мембране, но и красители, локализующиеся во внутриклеточных органеллах, удаленных от клеточной поверхности, существенно влияли на прочность адгезионных контактов клеток с субстратом. Это наводит на мысль о фотодинамическом воздействии на процессы внутриклеточной сигнализации, управляющие процессами адгезии и связанными с ними перестройками цитоскелета.
Как известно, существует два направления сигнальных процессов: «извне-внутрь клетки» и «изнутри-наружу». В первом случае образование адгезионными белками (кадгеринами, интегринами) контактов с внешними объектами (клетками, внеклеточным матриксом) запускает цепь внутриклеточных сигнальных каскадов и вызывает перестройки цитоскелета, ведущие к изменению формы и подвижности клеток. Во втором - внутриклеточные сигнальные процессы управляют конформацией и сродством молекул клеточной адгезии к внеклеточным объектам. ALA-PDT вызывало изменения морфологии клеток WiDr и распределение в них интегрина aVp3. В контроле эти клетки формировали плотно упакованные колонии, в которых практически не было свободного пространства между клетками. ALA-PDT снижала плотность упаковки клеток в колонии. Клетки формировали ламеллиподии, направленные не только во внеклеточную среду, как в контроле, но и в межклеточное пространство внутри колоний. В отличие от внешней стороны клеток, входящих в состав колоний, которая была обращена в среду и имела мощный актиновый кортекс, на той стороне контрольных клеток, которая была обращена
внутрь колоний, кортекс был незначительным. Но БНЗТ вызывала формирование актинового кортекса и на клеточных поверхностях, обращенных друг к другу внутри колоний. Все это свидетельствовало об ослаблении межклеточных взаимодействий. Однако, БНЗТ не изменяла внутриклеточного распределения Е-кадгерина, иммунофлуоресценции которого была представлена небольшими гранулами концентрирующихся в зоне межклеточных контактов на периферии клеток.
В большинстве клеток, входящих в состав колонии, интегрин aVp3 был больше сосредоточен в областях межклеточных контактов внутри колонии. Ярко флуоресцирующие точки соответствовали фокальным контактам с повышенным содержанием этого интегрина, который диффузно распределялся в цитоплазме. В некоторых, но не во всех, клетках происходило перераспределение интегрина aVp3 из пограничных районов на всю площадь клеток и формировалось большое количество фокальных контактов и актиновых стресс-волокон. Это могло приводить к усилению адгезии клеток к субстрату и ингибированию трипсин-индуцированного открепления клеток от субстрата под влиянием БНЗТ. Интегрин aVp3 - основной тип интегрина, формирующего фокальные контакты. Он специфически связывается с витронектином -сывороточным белком, способствующим высокоаффинному прикреплению клеток к субстратам, формированию точек адгезии и ламеллиподий. Эти процессы необходимы для выживания, пролиферации и миграции клеток, а также их инвазии и образования опухолевых метастазов. Возможно, БНЗТ, запуская перекисное окисление липидов и образование сшивок белков с липидами и между собой, нарушало конформационные переходы интегринов, в частности, интегрина aVp3 в активное состояние, необходимое для адгезии, а также сшивало белки в интегриновых кластерах, предотвращая их разборку и реорганизацию.
БНЗТ ингибировала трипсининдуцированное открепление клеток глиобластомы D54Mg от субстрата так же, как и клеток WiDr. Однако морфологические изменения в этом случае были иными. Клетки глиобластомы растут отдельно друг от друга и контактируют с помощью длинных отростков. После БНЗТ наиболее заметной в них была потеря фибриллярных актиновых структур в конусах роста отростков и их ретракция. Одновременно усиливался актиновый кортекс в центральных районах прикрепленных клеток. Часть клеток округлялась, и в них происходило «пузырение» поверхностной мембраны. Изменений в распределении интегрина aVp3 и Е-кадгерина не наблюдалось. Таким образом, процессы адгезии и изменения цитоскелета различаются в разных клетках и влияние БНЗТ на них несколько разное, хотя в обоих случаях слабое фотодинамическое воздействие усиливало связывание этих клеток с субстратом. В молекулярных механизмах этого эффекта, видимо, участвуют сигнальные механизмы, которые еще предстоит выяснить.
Исследования внутриклеточного накопления BPA и BSH показали, что BSH проникает в клетку посредством пассивной диффузии, а BPA проходит клеточную мембрану через L-аминокислотную транспортную систему. При этом внутри клетки BSH распределяется равномерно, а BPA гетерогенно, с преимущественным накоплением в ядре и цитоплазме и со значимо меньшим содержанием в околоядерной области (митохондрии, аппарат Гольджи). Расчеты с помощью программы Монте-Карло показали, что в случае, когда бор 10B локализован во внеклеточном пространстве, доза на ядро после облучения тепловыми нейтронами составляет 10 % дозы, получаемой при равномерном
распределении такого же количества бора по всей клетке, т. е. внутриклеточная локализация бора имеет для БНЗТ определяющее значение. В связи с тем, что BSH и BPA имеют различные пути поступления в опухолевую клетку и как следствие различные места локализации, представляет интерес совместное использование этих соединений.
Комбинированное использование BSH и BPA позволяет значительно повысить эффективность НЗТ при облучении мышей со сквамозной карциномой SCCVII, крыс с глиомой F98 по сравнению сраздельным введением соединений. Исследования также показали, что вклад бора, включенного в состав BSH и BPA, в суммарной концентрации бора в опухоли у разных пациентов варьирует в широких пределах. Также из-за различной локализации в клетке при БНЗТ эти соединения проявляют различное радиобиологическое действие, поэтому для расчета поглощенной дозы необходимо знать концентрацию бора для каждого соединения [1].
Эксперименты, проведенные японскими учеными из университета Киото, показали, что биологической целью БНЗТ являются ДНК клетки. Прямое влияние радиации вызывает прямое повреждение ДНК, что обусловлено ионизацией или возбуждением компонента ДНК. Косвенное воздействие радиации приводит к повреждению ДНК, вызванному свободными радикалами, полученными в результате ионизации [2]. В результате воздействия радиации образуются долговечные свободные радикалы, которые могут играть более важную роль в индукции мутации, чем недолговечные свободные радикалы [3].
В последние годы широкое применение в мире (США, Франции, Великобритании и других странах) нашел метод биоиндикации, позволяющий определить цитотоксичность агента - значит оценить его способность повреждать клетки или резко изменять их метаболизм, который успешно применяется для изучения биологических эффектов воздействия нейтронов бора 10B при БНЗТ. Исследования проводятся на любой тканевой культуре (L41 - лейкоциты человека или RH - перевиваемая почка человека). Клеточная взвесь в концентрации 8-100 тыс. клеток/мл среды рассаживалась по 2 мл в пенициллиновые флаконы с покровными стеклами на дне флакона. В качестве культуральной среды использовали среду 199 с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки. После формирования клеточного монослоя на стекле (24 часа) культуральная среда сливалась и заменялась на среду 199 с раствором исследуемого вещества в исследуемой концентрации. Контролем служила тканевая культура без добавления исследуемого вещества. Флаконы инкубировали в термостате при 37 оС в течение 96 часов, каждые 24 часа готовили морфологические препараты по общепринятой методике (по 4 препарата на точку) и проводили подсчет числа митотических клеток в монослое и общее количество выросших клеток методом случайных полей по С. Б. Стефанову. Метод биоиндикации с использованием тканевых культур с успехом может заменить опыты на лабораторных животных по следующим причинам:
1. Дешевизна и доступность используемого материала (для выращивания тканевых культур достаточно изъять клетки органов у 1-2 животных и полученные клеточные линии могут использоваться в течение длительного периода, в отличие от биомониторинга, в котором гибнут десятки и сотни животных).
2. Возможность быстрого получения результатов и прижизненного наблюдения за моделью в течение всего эксперимента.
3. Высокая корреляция результатов in vitro и in vivo.
4. Полученные тканевые культуры сохраняют высокую видовую, органнотканевую специфичность в течение всего эксперимента, что позволяет проводить на них практически все эксперименты.
Для успешной реализации БНЗТ раковых опухолей необходимо осуществить направленный синтез веществ, которые способны избирательно доставлять в клетки злокачественных опухолей терапевтическое количество бора 10B, обеспечивать его оптимальное микрораспределение и оставаться в клетках в течение необходимого для
облучения периода времени. В настоящее время отсутствуют прямые методы присоединения биологически активных транспортных групп к высшим кластерам бора [BnHn] 2 - (n = 10, 12). Поэтому возникает необходимость разработки новых методов присоединения биологически активных транспортных групп к различным функциональным производным клозоборатных анионов [BnHn] 2 - (n = 10, 12). Был разработан новый метод получения ковалентных борсодержащих биологически активных производных на основе нитрилиевых замещенных клозо-боратных анионов [BnH(n-1)(N=C-CH3)] - (n = 10, 12) и биологически активных веществ, имеющих в своем составе свободную гидроксо- или амино-группу. При взаимодействии анионов [BnH(n-1)(N=C-CH3)] - (n = 10, 12) с нуклеофилами (аминами, спиртами) в мягких условиях и с количественным выходом образуются производные нуклеофильного присоединения (AdN) по следующей схеме:
[BnH(n-1)(N=C-CH3)] + RmXHk ^ [BnH(n-1)(NH=C(CH3)XR)]
X = N, R = H, Alk, m = 1, 2; k = 3 - m; X = O, R = H, Alk, m = 0, 1; k = 2 - m.
Синтезированы, выделены и охарактеризованы различными методами производные, содержащие в своем составе в качестве биологически активной транспортной группы холестерин и холин. Полученные соединения обладают высокой гидролитической стабильностью, а натриевые соли - водорастворимостью и высоким содержанием бора 10B. Следует отметить, что новые выделенные соединения относятся к принципиально новому, еще не изученному классу соединений (амидов и амидинов) для целей БНЗТ, однако в случае обнаружения низкой токсичности и высокой селективности данные производные могут быть рекомендованы для БНЗТ раковых опухолей.
Результаты, полученные на клеточных и тканевых культурах, нельзя экстраполировать на целый организм, но не вызывает сомнений, что если то или иное вещество оказывает повреждающее действие в нескольких линиях культивируемых клеток, то следует ожидать неблагоприятного эффекта и при введении этого вещества целому животному. Помимо того, что использование культуры клеток избавляет от страданий большое количество животных, использование культур клеток человека позволяет оценивать повреждающее действие веществ у вида, недоступного для экспериментов такого рода, т. е. у человека.
Список литературы
1. Баранов А. П. Анализ особенностей распределения BSH и BPA с целью повышения эффективности нейтронозахватной терапии / А. П. Баранов [и др.] // Рос. биотерапевт. журн. - 2007. - Т. 6, № 1. - С. 80.
2. Kinashi Y. Locus in CHO cells against thermal neutron radiation / Y. Kinashi [et al.] // Neutron capture therapy of epidermal growth factor (+) gliomas using boronated cetuximab (IMC-C225) as a delivery agent : Topics in neutron Capture therapy: Proceedings of the Eleventh World Congress on Neutron Capture Therapy. - 2004. - Vol. 61, N 5. - P. 899-903.
3. Koyama S. Radiation-induced long-lived radicals which cause mutation and transformation / S. Koyama [et al.] // Mutat. Res. - 1998. - Vol. 421. - P. 45-54.
4. Kroegel C. Putting priming into perspective - from cellular heterogeneity to cellular plasticity / С. Kroegel [et al.] // Immunology Today. - 2000. - Vol. 21, N5. - Р. 218-222.
BASIC VARIANTS OF CELLULAR RESPONSE OF SOUND TISSUES IN MALIGNANT TUMORS BOR-NEUTRON-CAPTURE THERAPY CONDUCT
(LITERATURE PREVIEW)
11 2 J. V. Pakhomova , V.V. Kanygin , S.M. Davydova
1SEIHPE «Novosibirsk State Medical University Rushealth»
(c. Novosibirsk)
2SG «NRI of physiology SD RAMS» (c. Novosibirsk)
Bor-neutron- capture therapy influence on cellular adhesion processes and structures connected are being studied in the article.
Keywords: cellular response, adhesion of cells, bio-indication method
About authors:
Pakhomova Julia Viacheslavovna - doctor of medical sciences, professor of pathological physiology department and clinical pathophysiology SEI HPE «Novosibirsk State Medical University Rushealth » , office telephone: (383)225-39-78
Kanygin Vladimir Vladimirovich - medical sciences candidate, neurosurgery department assistant SEI HPE «Novosibirsk State Medical University Rushealth» office telephone: (383)229-28-84
Davydova Svetlana Mikhailovna - biological sciences candidate, neuroregulation laboratory scientific collaborator SG «NRI of physiology SD RAMS», contact telephone: (383)229-10-82
List of the Literature:
1. Baranov A.P. BSH and BPA distribution features analyses to increase the neutron-capture therapy efficiency. / A.P. Baranov [et.al.] // Rus. biotherap. journ. - 2007. - V.6, №1. - P.80.
2. Kinashi Y. Locus in CHO cells against thermal neutron radiation / Y. Kinashi [et al.] // Neutron capture therapy of epidermal growth factor (+) gliomas using boronated cetuximab (IMC-C225) as a delivery agent : Topics in neutron Capture therapy: Proceedings of the Eleventh World Congress on Neutron Capture Therapy. - 2004. -Vol. 61, N 5. - P. 899-903.
3. Koyama S. Radiation-induced long-lived radicals which cause mutation and transformation / S. Koyama [et al.] // Mutat. Res. - 1998. - Vol. 421. - P. 45-54.
4. Kroegel C. Putting priming into perspective - from cellular heterogeneity to cellular plasticity / C. Kroegel [et al.] // Immunology Today. - 2000. - Vol. 21, N 5. - P. 218222.
